RNA干扰 (RNA interference ,RNAi)

二、RNAi作用机制

当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切 酶（ Dicer ）识别，切割成 21-23 核苷酸长的小片 段，这些片段可与该核酸酶的 dsRNA 结合结构域结 合，并且作为模板识别目的mRNA。 识别之后， mRNA 与 dsRNA 的有义链发生链互换，原 先 dsRNA 中的有义链被 mRNA 代替，从酶 -dsRNA 复合 物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。 核酸酶在同样位置对 mRNA进行切割，这样又产生了 21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合 物，继续对目的 mRNA进行切割，从而使目的基因沉 默，产生RNAi现象。


三、RNAi研究的一般技术路线
1、siRNA 的设计
何为siRNAs
siRNA
（ small interfering RNAs ， siRNAs ） 即为能够以同源互补序列的 mRNA 为靶目标并 将其降解而介导 RNA 干扰途径的短片断双链 RNA分子。
一般设计原则
（ 1 ）从 mRNA 的 AUG 起始密码开始，寻找“ AA” 二连 序列，并记下其 3' 端的 19 个碱基序列，作为潜在 的 siRNA 靶位点。有研究结果显示 GC 含量在 30%— 50% 左右的 siRNA 要比那些 GC 含量偏高的更为有效。 （2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或 者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他 编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST （3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因 需要设计 4-5 个靶序列的 siRNA ，以找到最有效的 siRNA序列。


RNAi 的基本过程：

siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA，消耗能 量；

RISC（RNA-induced silencing complex）形成：
与RNAi辅助蛋白结合形成RISC，消耗ATP能量； RISC 活化：siRNA解螺旋成单链，无活性的复合 体转变成活性形式； 阻止翻译或诱导mRNA降解：在siRNA引导下，RISC 识别并切割互补的靶RNA，无需或消耗少量ATP。
负对照
一个完整的siRNA实验应该有负对照。 作为负对照的 siRNA 应该和选中的 siRNA 序列
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有相同的组成，但是和 mRNA 没有明显的同源 性。 通常的做法是将选中的 siRNA序列打乱，同样 要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。
2、制备siRNAs的方法
1.化学合成； 2.体外转录； 3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA； 4. siRNA表达载体 5. siRNA表达框架
分子生物学实验技术
RNA干扰
（RNA interference ，RNAi）
重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室 刘先俊
实验目的
1.掌握RNA干扰的基本原理；
2.了解研究RNA干扰的技术路线及应用。
一、RNAi概述

RNAi：短双链RNA（dsRNA）诱导靶基因mRNA 特异性降解，或阻止mRNA翻译，产生基因沉 默（gene silence)的现象。因此，又称为 knockdown。
制备siRNA5种不同方法的比较
制备siRNA5种不同方法的比较（续）
4. 转染细胞 5. RNAi的效果分析
RNAi 的应用




基因功能分析 胚胎发育与干细胞基因调控研究 细胞增殖与分化基因调控研究 细胞生长与转移基因调控 多基因疾病发病机制研究 表观遗传学分析（RNAi可诱导基因甲基化） 信号通路新分子的筛选与鉴定 寻找新的药物靶标、基因治疗 药物作用机制探讨