RNA干扰

质粒载体表达合成siRNA的方法
第一种是设计可自然形成发夹的RNA （~22nt）: 两种RNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）启动子（U6 或H1）控制一段反向重复序列（中间被可变间隔 序列分开）转录，结果可在胞内合成具有发夹结 构的双链RNA（含19~29nt的茎和3~9nt的环）， 其中19~29nt的茎与靶基因序列互补。另外，此 发夹RNA的3’末端含有4个或4个以下的尿嘧啶。 实验证实， 3’末端为UU的RNA较AA、CC或GG 为末端的RNA更能有效地诱导基因沉默。
RNAi—生物技术的蓝月亮


基因治疗：RNAi 作用的高度特异性有可能特 异地抑制致病的突变等位基因，但又不影响正常 的等位基因。 肿瘤的基因治疗：肿瘤是多个基因相互作用的 基因网络调控异常的结果，传统技术诱发的单个 癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长， 而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一 段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这 一序列的dsRNA分子，只导入一种dsRNA 既可 以产生多个基因同时沉默。
RNAi现象的普遍性
随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟 草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生 物中。
RNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线 虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。
基因沉默
转基因沉默分为转录水平的基因沉默 (Transcriptional Gene Silencing, TGS) 和转录后 水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)两种：

2’，5’寡腺苷酸合成酶，其催化合成的 2’，5’寡腺苷酸会激活RNase L。RNase L能 够非特异地水解所有的mRNA。干扰素可加 剧以上两种酶促反应，最终导致蛋白合成终 止、诱发细胞凋亡。

~21nt siRNA介导特异靶基因沉默
近来研究发现通过导入~21nt的siRNA可在 哺乳动物中介导序列特异的基因沉默 。这些 siRNA长至可诱导特异基因沉默，短至可逃避宿 主的非特异干扰素效应。 Harborth等曾用体外 化学合成的21nt siRNA沉默靶基因成功。但因化 学合成的RNA易被RNase降解而且成本昂贵，目 前主要转向研究利用DNA载体在细胞内合成 siRNA。
Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos. (A) Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.)


研究基因的功能：由于RNAi 可以特异 性抑制特定的基因，获得功能丧失，因此 可用于功能基因组的研究（类似Gene knock out)。图示 防御病毒的感染：RNAi具有对抗侵入性 遗传因子（如病毒、转座子、转基因）的 作用、打破其复制循环、减弱或消除其基 因毒性作用 。由于RNAi也存在于哺乳动物 细胞中，RNAi或许可被利用来治疗病毒性 疾病。
RNA 干扰
吴xx 指导：刘xx
RNA 干扰 （RNA interference，RNAi）
RNAi是与靶基因序列同源的双链RNA (dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现 象。 它是真核生物中存在的一种抗病毒入 侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控 机制，具有重大生物学意义。
RNAi的发现简史
第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP 参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其 中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体 (RNA-induced silencing complex， RISC)。 RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸 内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。活化 的RISC在单链siRNA引导下识别互补的 mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从 siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶 mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降 解，从而干扰基因表达。
另外，内源性的小的短暂RNA（small temporal RNA，stRNA，为一种修饰后 的miRNA）也可作为siRNA发挥基因沉默 作用。stRNA（miRNA）是~70nt发夹 RNA （发夹miRNA 前体，miRNA hair precursor）被RNaseⅢ样核酸酶切割加工 成的单链~22nt RNA。由于stRNA与靶基 因不完全互补，它从翻译水平阻抑基因表 达。
TGS是指转基因在细胞核内RNA 合成受到了
阻止而导致基因沉默； PTGS 则是指转基因能够在细胞核里被稳定 地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA 存在这 一现象。
RNAi的作用机制
目前普遍认为，共抑制、基因压制和 RNAi很可能具有相同的分子机制，都是通 过dsRNA的介导而特异地降解靶mRNA, 抑制相应基因的表达。 即RNAi、共抑制、 quelling均属于PTGS！现已初步阐明 dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程主 要分为两步。

第二种是将两个U6启动子串联在一起 或置于两个分开的载体中以引导19nt的 siRNA正义和反义链转录，正义、反义链在 体内退火连接成双链siRNA。此siRNA中所 含的19nt序列与靶基因互补，且siRNA的3’ 末端亦含4个或4个以下的尿嘧啶。
表达siRNA的载体构建图

虽然由于内源性stRNA（miRNA）与 靶基因不完全互补，它从翻译水平阻抑基 因表达，但研究发现人工设计的与靶基因 完全互补的修饰后的miRNA则可同siRNA 一样在转录水平沉默基因，因此我们通过 人工设计表达miRNA发夹前体（~70nt） 的质粒载体也是RNAi技术的另一种方法。


90年代初，Rich Jorgensen 设想，将 更多的色素基因注入植物体，能使花朵的 色彩更艳丽，而结果出其预料，转基因的 植株不仅没有新基因表达，反而使原有的 色素基因也受到了抑制，当时称共抑制 （cosuppression)。 94年Cogoni等证明真菌中亦有类似现 象，此称为基因压制 (quelling)。
Naturally occuring and artifical miRNA
(serving as siRNA)
利用DNA载体的RNAi技术的优点之一 是siRNA能在细胞中比较稳定表达，介导较 长时间的基因沉默。除质粒载体外，科研 人员已经成功地采用逆转录病毒载体、腺 相关病毒载体和慢病毒载体将表达siRNA的 DNA模板序列转移入哺乳动物细胞。现在 许多学者正在加紧腺病毒载体的siRNA转移 研究 。
在许多机体中反向重复转基因序列在 细胞核内转录成发夹dsRNA，进而可介导 RNAi，这种dsRNA可能需要转移至胞浆中 才可有效地沉默同源靶mRNA。 例如，在果蝇中，转录含有内含子和 多聚腺苷酸信号的发夹dsRNA的反向重复 转基因序列比转录不含内含子、不含多聚 腺苷酸信号dsRNA的转基因序列更能有效 地沉默同源靶mRNA（因为内含子和多聚 腺苷酸信号有利于dsRNA转移入胞浆）。

95年Guo和kemphues在秀丽线虫 (C.elegans)中用反义RNA 阻止一些基因 的表达，给对照组用正义RNA不但不增加 该基因的表达，反而产生与反义RNA 同样 的结果——特异性阻断该基因的表达，从 而正式表明RNA 干扰现象的存在。

Fire等发现将ds RNA注入秀丽线虫可显 著抑制特定基因的表达，并证明了Guo和 kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用 其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。 将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA 无基因抑制作用，反义RNA的基因抑制作用也 很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫，却能 高效、特异地阻断相应基因的表达。实验证明 双链RNA抑制基因的表达的效率比纯化后的反 义RNA至少高几个数量 ，他们称此现象为ds RNA介导的RNA干扰（RNAi）。图示
RNAi的作用源自文库制模式图

RNAi途径主要存在于细胞浆中，但是 siRNA产生、靶mRNA降解的亚细胞位置 尚未明确。外源性（注射或喂养）的 dsRNA和病毒性dsRNA可能可以直接进入 细胞浆中的RNAi途径，仅在细胞浆中复制 的RNA病毒可被dsRNA介导的沉默机制所 抑制。外源性dsRNA则还可导致细胞核中 的同源早期RNA转录产物减少。
除上述RNAi机制外，转基因真核生物 中的dsRNA尚可引起相应基因的甲基化和 染色质重构、凝集、异染色质化，基因甲 基化和异染色质化还可能促使异常RNA （aberrant RNA）产生，最终导致基因沉 默。
RNAi的放大效应机制
siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA， 而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶 (RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的 dsRNA。 新合成的长链dsRNA同样可被 RNaseⅢ样核酸酶切割、降解而生成大量 的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。 这种合成-切割的循环过程称为随机降解性 PCR（random degradative PCR）。
RNAi降解mRNA的过程
外源dsRNA dsRNA
核酸酶
21-23nt dsRNA-核酸酶 RISC
mRNA
链互换 正义RNA
反义RNA-mRNA-核酸酶 mRNA降解 RNAi 或 PTGS
RNAi 的特点
转录后水平的基因沉默 较高特异性：能够非常特异地降解与之序 列相应的单个内源基因的mRNA。 高效性：相对少量的dsRNA就可以使相应 的基因表达受抑制。 可遗传性及远距离效应：RNAi基因表达的 效应可以突破细胞的界限，可传递给子一 代。
第一步（起始阶段）是较长ds RNA在 ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶切 割加工成21~23nt的由正义和反义链组成 的小干扰RNA（small interfering RNA， siRNA）。
siRNA的两条单链末端为5’－磷酸和3’－ 羟基，且3’端均有２~3个突出的核苷酸。果 蝇中的RNaseⅢ样核酸酶称为Dicer。 Dicer有解旋酶活性并含有 dsDNA结合 域和PAZ结构域。Dicer的类似物相继在拟南 芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中被发现。

哺乳动物细胞中的RNAi技术
长链dsRNA所致的非特异干扰素效应： 科研人员开始试图将RNAi技术应用于哺乳 动物细胞时，发现长链dsRNA（>30bp）并未 引起特异序列的靶基因沉默，而是激活一组导 致细胞死亡的非特异干扰素效应。
目前研究认为这种非特异效应可能是由 于长链dsRNA促使干扰素合成并激活了两 种酶： dsRNA依赖的蛋白激酶（dsRNAdependent protein kinse，PKR），PKR 可磷酸化转录起始因子eIF2a；