RNA干扰
RNA干扰(RNA interference, RNAi)
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术，它利用了由小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。
RNAi是生物进化的结果，是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应。
它普遍存在于各种生物，具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达ｍRNA的生物学功能。
RNA干扰现象不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可能在基因功能测定，基因治疗等方面开辟一条新思路。
1 RNAi的历史背景20世纪20年代，人们发现，植物受到野生型病毒感染后，能产生对另一种亲缘关系相近的病毒的抵抗力。
而真正发现双链RNA(dsRNA)能引起基因沉默现象，则在1995年。
当时，Guo和Kemphues用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)中parl基因的表达时发现反义RNA具有抑制该基因表达的功能，同时正义RNA也同样出现了类似的抑制效应，实验表明正义RNA和反义RNA均能阻抑基因功能表达，而且两者的作用是相互独立的，机制也各不相同。
1998年，Fire和Mello等人首次发现dsRNA能够特异地抑制C.elegans中的纹状肌细胞unc-22基因的表达，结果发现dsRNA所引起的基因沉默效应要比单单应用反义RNA或正义RNA强十几倍。
而且注射入C.elegans的性腺后，在其第一子代中也诱导出了同样基因的抑制现象，说明在原核生物中，RNAi具有可遗传性。
他们将这一现象称为RNAi。
因为RNAi作用发生在转录后水平，所以又被称为转录后基因沉默(PTGS)或共抑制。
此后，又在果蝇、锥虫、涡虫、无脊椎动物、脊椎动物、植物、真菌、斑马鱼及哺乳动物等真核生物中发现了RNAi现象。
RNA干扰
定义
• RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、 由双链RNA（dsRNA）诱发的、同源 mRNA高效特异性降解的现象。
类型
• 转录水平的基因沉默(TGS)：由于DNA修饰 或染色体异染色质化等原因使基因不能正 常转录。 • 转录后水平的基因沉默(PTGS)：PTGS是 启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解 机制。
体内表达
• 前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs， 并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转 到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于 PCR的表达框架则属于从转染到细胞的 DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两 种方法的优点在于不需要直接操作RNA。
siRNA表达载体
• 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶Ⅲ启动子（pol Ⅲ）中的一种，操纵一段小 的发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA）在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括 大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol Ⅲ启动子是由 于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6 个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单 链，退火，克隆到相应载体的pol Ⅲ 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周 甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
体外转录
• 用RNase Ⅲ 消化长片断双链RNA制备siRNA 其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的 siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个 缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链 dsRNA ，然后用RNase Ⅲ (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在 除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的 siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因 被有效地抑制。 dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人 员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse Ⅲ通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的 缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基 因。多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。 最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型 不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治 疗
rna干扰
RNA干扰什么是RNA干扰？RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种通过特定的RNA分子干扰基因表达的现象。
这种现象最早被发现于植物和线虫中，后来发现在动物中也普遍存在。
RNA干扰通过介导mRNA的降解或抑制转录来实现靶向基因的沉默。
RNA干扰的机制主要是通过一种特殊的小RNA分子，称为干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）或小干扰RNA （short interfering RNA，shRNA）。
这些siRNA或shRNA是由外源性或内源性的长双链RNA在细胞内被核酶Dicer切割而成的20-30个碱基的双链RNA分子。
RNA干扰的过程RNA干扰的过程可以分为三个主要步骤：siRNA的产生、siRNA的引物和RNA诱导沉默复合物（RISC）的形成、RISC 介导的mRNA降解或转录抑制。
首先，外源性或内源性的长双链RNA被核酶Dicer切割成20-30个碱基的siRNA。
siRNA由RNA诱导沉默复合物（RISC）捕获，其中的一个链被释放，留下一个导引链和一个剪切链在RISC中。
接下来，导引链将与靶标mRNA互补结合。
RISC将靶标mRNA切割成小片段，导致mRNA的降解或转录抑制。
这种RNA干扰过程可以非常特异地沉默特定的基因表达。
RNA干扰在基因研究中的应用RNA干扰已经成为基础科学研究和功能基因组学研究中广泛应用的工具。
通过沉默特定基因的表达，研究人员可以揭示该基因在生物学过程中的功能，以及该基因对疾病发展的影响。
在细胞水平上，RNA干扰可以用于验证候选基因是否在特定生物途径中起关键作用，或者用于筛选新药物靶点。
研究人员可以通过转染siRNA或shRNA来干扰目标基因，评估其对细胞功能的影响。
在动物模型中，RNA干扰可以用于研究特定基因的作用。
通过通过siRNA或shRNA直接注射进入动物体内，可以沉默目标基因的表达，并观察动物表型的变化。
RNA干扰
基因治疗的局限性
1.运载体系一直是体内基因治疗的瓶颈，如何将双链 RNA高效特异的转入体内靶细胞仍是一个难题； 2.大于30个核苷酸的双链RNA进入哺乳动物的成体细 胞后，会非特异的阻断基因的表达
病毒类疾病的治疗
治疗HIV 感染 由于RNAi是机体中古老而天然的抗病毒机制，HIV 病毒感染是我们亟待解决的问题，将RNAi技术应用于 艾滋病治疗是顺理成章之事。
关于核酸内切酶Dicer
在RNA干扰中一个非常重要的酶是RNaseIII核酶家 族的Dicer。它可与双链RNA结合，并将其剪切成 21～23nt及3'端突出的小分子RNA片段，即siRNA。 随后siRNA与若干个蛋白组成的，RNA引起的称之 为RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，解旋成单链，并由该复合 体主导RNAi效应。RISC被活化后，活化型RISC受 已成单链的siRNA引导（guide strand），序列特异 性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶 mRNA的特异性分解。
机制原理
细胞自然存在二种干扰RNA：
小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）： 19-25nt，由长dsRNA裂解而成的小片段，诱导 mRNA降解。
microRNA(miRNA) ：22nt，呈短发夹结构（short hairpin RNA，shRNA），由miRNA前体酶解而成， 抑制mRNA翻译。
RNA干扰
目录
概念 发展简史
问题与展望
机制原理
应用
制备方法
概
念
RNAi(RNA interference ，RNA干扰)： 短双链RNA（dsRNA）诱导靶基因mRNA 特异性降解，或阻止mRNA翻译，产生基 因沉默（gene silence)的现象。因此，又 称为knockdown。 它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、 抑制转座子活动、调控基因表达的监控机 制，具有重大生物学意义。
RNA干扰 (RNA interference ,RNAi)
二、RNAi作用机制
当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切 酶（ Dicer ）识别，切割成 21-23 核苷酸长的小片 段，这些片段可与该核酸酶的 dsRNA 结合结构域结 合，并且作为模板识别目的mRNA。 识别之后， mRNA 与 dsRNA 的有义链发生链互换，原 先 dsRNA 中的有义链被 mRNA 代替，从酶 -dsRNA 复合 物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。 核酸酶在同样位置对 mRNA进行切割，这样又产生了 21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合 物，继续对目的 mRNA进行切割，从而使目的基因沉 默，产生RNAi现象。
三、RNAi研究的一般技术路线
1、siRNA 的设计
何为siRNAs
siRNA
（ small interfering RNAs ， siRNAs ） 即为能够以同源互补序列的 mRNA 为靶目标并 将其降解而介导 RNA 干扰途径的短片断双链 RNA分子。
一般设计原则
（ 1 ）从 mRNA 的 AUG 起始密码开始，寻找“ AA” 二连 序列，并记下其 3' 端的 19 个碱基序列，作为潜在 的 siRNA 靶位点。有研究结果显示 GC 含量在 30%— 50% 左右的 siRNA 要比那些 GC 含量偏高的更为有效。 （2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或 者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他 编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST （3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因 需要设计 4-5 个靶序列的 siRNA ，以找到最有效的 siRNA序列。
RNAi 的基本过程：
siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA，消耗能 量；
rna干扰的名词解释
rna干扰的名词解释RNA干扰：探索基因调控的新领域近年来，一个名词在生物学领域频繁出现，它就是“RNA干扰”。
作为一种重要的基因调控机制，RNA干扰在生物学研究中扮演着重要的角色。
本文将带您深入了解RNA干扰的概念、机制和应用。
一、RNA干扰的概念RNA干扰，全称为RNA interference，是一种通过RNA分子调控基因表达的过程。
简而言之，它是一种通过降解或抑制特定基因产物的方式，来调节这些基因表达和功能的现象。
二、RNA干扰的机制1. 小干扰RNA（siRNA）的产生RNA干扰的开始是由于产生小干扰RNA（siRNA）。
当外源的双链RNA （dsRNA）或内源性的转录产物具备一定的结构特征，即能够被核酸内切酶识别并切割，从而形成长度约为20-24核苷酸的小干扰RNA。
2. siRNA的导入产生的siRNA会与RNA诱导复合物（RISC）结合，这个复合体能够识别和结合与siRNA序列互补的mRNA分子。
导入过程确保siRNA与目标mRNA结合，从而催化这些mRNA的降解或抑制翻译。
3. mRNA降解或抑制翻译一旦siRNA与特定mRNA结合，RISC会切割这些mRNA分子，导致它们在细胞内降解。
如果切割发生在编码区，会导致部分或完全的mRNA降解；如果切割发生在非编码区，会引起mRNA的转译抑制，从而阻止蛋白质的合成。
三、RNA干扰的应用1. 基因沉默研究RNA干扰为研究基因功能提供了强有力的工具。
通过选择性地抑制或沉默特定基因，在细胞和生物体中观察这些变化，可以揭示基因在发育、分化、疾病等方面的重要作用。
2. 药物研发RNA干扰技术为药物研发提供了新途径。
通过利用siRNA特异地靶向基因表达，可以高效地减少特定蛋白质的产生，从而对许多疾病进行治疗。
例如，肝癌、糖尿病和病毒感染等疾病的治疗已经取得了一定的成功。
3. 农业和食品安全RNA干扰不仅在医学领域应用广泛，也在农业和食品安全领域有着巨大潜力。
RNA干扰技术
RNAi的分子作用机制
1、siRNA引起的基因沉默
miRNA诱导的基因沉默
miRNA是一种广泛存在于真核生物中内源性的、高度保守 的、非编码小的RNA。 miRNA主要是通过抑制翻译来实现基因的沉默，成熟的双 链miRNA会很快被整合到miRNA介导的沉默复合体（miRISC） 中。 成熟miRNA结合到与其序列互补的mRNA位点，通过2种依 赖于序列互补机制负性调控靶基因的表达。如果miRNA与靶 位点序列完全互补，miRNA的结合会引起mRNA的降解；如 果miRNA与mRNA不完全互补，则能抑制mRNA的翻译过程。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第三步（倍增阶段）在 RISC 复合物中，以 siRNA 的单链 为引物，以 mRNA 为模板，在 RNA 指导的 RNA 聚合酶作 用下，合成 mRNA 的互补链，即形成 dsRNA 。 dsRNA 再 被Dicer酶裂解成新的siRNA（次级siRNA）。 因此，细胞内的siRNA数量大大增加，显著增强了对基因 表达的抑制作用。 siRNA 也可转运出细胞，使 RNAi 扩散 到整个机体。
获得siRNA产物方法
目前主要有5种方法用于siRNA的制备
(1)化学合成法;(2)体外转录法;
(3)长链dsRNA的RNaseIll体外消化法;
(4)siRNA表达载体法；(5)siRNA表达框架法。
前3种是在体外制备然后导入到细胞中；后两种则
是基于具有合适启动子的载体或转录元件在哺乳动
物或细胞中转录生成siRNA。
RNA干扰技术
张风娇
简介
RNA干扰（RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双
链RNA（dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解，
RNA干扰
RNA i的应用 研究信号转导通路的新工具
RNA干扰能高效特异地阻断基因的表达的特点可使其成 为研究信号传导通路的良好工具。Clemens等应用RNA干 扰研究了果蝇细胞系中胰岛素的信号转导通路。实验证明， RNA干扰能特异性地阻断培养细胞靶向蛋白质的产生，且 应用RNA干扰技术所阐明的转导通路与已知的胰岛素转导 通路完全一致。在整个实验过程中，发现RNA干扰技术比 传统的转染实验简单、快速、重复性好，克服了转染实验 中重组蛋白非特异性聚集和转染效率不高的缺点。故此认 为，RNA干扰技术将可能成为一种研究细胞信号转导通路 的重要方法，并将在研究哺乳动物信号转导通路中发挥重 大作用。
siRNA干扰效果的检测方法
• 核酸水平：检测转录量 • 蛋白水平检测：检测蛋白产物表达量 • 动物实验或TCID50检测
RNAi的生物学功能
• 防止病毒感染 • 抑制转座子转座 • 基因表达调控
RNAi的生物学功能
防止病毒感染 双链RNA是众多病毒的遗传物质，即使 在被单链RNA病毒感染的细胞中，也发现 了病毒特异性双链RNA。当病毒侵入生物 体后可诱发RNA干扰，封闭病毒生存和繁 殖必需的基因，产生抗病毒效应。
siRNA的获得
通过PCR介导的siRNA表达试剂盒获取siRNA
基于PCR的siRNA表达框架(siRNA expression cassette,SEC)，它由RNA pol、Ⅲ启动子、发夹 结构siRNA、RNA polⅢ终止位点组成,制备方法 为PCR，无需克隆和测序。
RNA干扰及其机制
RNA干扰及其机制
RNA干扰是一种新型的基因表达调控机制，它可以通过调节基因间的相互作用，实现基因的表达调控。
RNA干扰技术包括很多不同的方法，其中包括siRNA、miRNA和RNA内切酶基因等。
这些技术在生物学中有着广泛的应用，可以用于研究和调控基因表达。
RNA干扰是一种自然调控机制，可以抑制或调节mRNA的表达，从而调节细胞中的基因表达。
最常见的RNA干扰技术是siRNA，它可以靶向特定mRNA的3'末端，促使其形成双链RNA，并最终抑制其功能。
siRNA的抑制机制是通过RNA-RNA互作的形式引起的，它会与特定mRNA结合，形成“siRNA-mRNA”复合物，并最终能够抑制mRNA的转录及翻译的过程，从而使基因表达受到抑制。
miRNA是一种特殊的小RNA分子，可以连接靶向mRNA的3'末端。
它能够通过与mRNA形成“miRNA-mRNA”复合物来调控mRNA的翻译，从而实现基因表达的调节。
虽然miRNA与siRNA的机制相似，但是它的作用原理有一定差异，miRNA通过调节mRNA的翻译来抑制基因表达，而siRNA则会直接破坏目标mRNA。
RNA内切酶基因是一种RNA干扰技术，它能够通过表达一种特殊的内切酶来抑制特定的mRNA。
它的原理是利用内切酶将特定的mRNA切割，从而使得目标基因不能被翻译，最终从而影响基因表达。
RNA干扰技术基本原理与应用
网上数据库中选择特定的shRNA克隆，无需再耗时 耗力进行siRNA的设计、合成和验证过程
CAM:氯霉素抗性基因 hr：同源重组位点 Barcode：每个shRNA独特的识别序列 MSCV：病毒载体骨架 PKG-Puro：哺乳动物细胞中载体稳定性的选择 Kan、oriT、RK6：逆转录病毒信号序列
在特异性siRNA引入1~2个错配碱基 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG
目标序列筛选的相关网站
查找已经证实的siRNA的网站
siRNA的制备方法
体外制备方法
化学合成siRNA 体外转录获取siRNA 利用Dicer或 RNaseⅢ消化长的dsRNA成
RNAi的发现和发展历程
2002 年 Novina 等 用RNAi 技术实现了对HIV-1 病毒的阻抑
2004年 Morris 等 用RNAi技术实现了对人细胞基因的抑制
Science 2004(August 27)；305：1289-1292
RNAi的主要特点和优势
诱导转录后水平的基因沉默 具有高度的特异性 抑制基因表达的效率非常高 可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去
siRNA
化学合成法制备siRNA
优点： 纯度高 合成量不受限 能被标记 缺点：价格昂贵、合成周期长 用途：已经找到最有效的siRNA的情况下，
需要大量siRNA进行研究
体外转录法制备siRNA
优点：简单 成本低 速度快 毒性小 稳定性好 缺点：反应规模和量始终有一定的限制 用途：筛选siRNAs，特别是需要制备多种
HCV RNA ↓ 21倍
rna干扰完整解析
contents
目录
• RNA干扰概述 • 小分子RNA的种类和功能 • RNA干扰的应用 • RNA干扰的最新研究进展 • 结论与展望
01
RNA干扰概述
RNA干扰的定义
概念
RNA干扰是一种生物体内依靠双链RNA诱导的序列特异性的转录后基因沉默 现象。
特点
高效、特异、可遗传性、可传递性。
RNA干扰在细胞记忆和干细胞研究中的应用
RNA干扰技术在研究细胞记忆和干细胞中的基因表达调控方面具有重要价值，有 助于理解这些过程的基本原理和应用潜力。
RNA干扰在非编码RNA研究中的应用
要点一
RNA干扰在lncRNA研究中的 应用
长链非编码RNA（lncRNA）在RNA干扰中发挥重要作 用，最新的研究进展探讨了lncRNA如何影响基因表达 以及如何通过RNA干扰技术对其进行调控。
要点二
RNA干扰在miRNA研究中的应 用
microRNA（miRNA）是一种短链非编码RNA，通过 与mRNA结合来调节基因表达。最近的研究发现了 miRNA如何通过RNA干扰技术参与多种生物过程和疾 病发展。
RNA干扰技术在其他领域的新进展
RNA干扰在农业和生物技术中…
最新的研究发现，RNA干扰技术在农业和生物技术中具有广泛的应用前景， 可用于作物改良、生物防治和基因治疗等领域。
RNA干扰在农业科学领域的应用
作物改良
通过RNA干扰技术，可以抑制某些作物的有害基因，提高产量和质量。
抗病性研究
利用RNA干扰技术，可以研究植物抗病性机理，培育抗病性更强的作物品种。
转基因植物研发
RNA干扰技术可用于研发转基因植物，为解决粮食短缺和环境保护等问题提供新的途径。
RNA干扰及其应用
药物研发
靶点筛选
利用RNA干扰技术可以快速筛选出药物作用的靶点， 加速新药的研发进程。
药效评估
通过RNA干扰技术沉默特定基因，可以评估药物对疾 病的治疗效果和潜在副作用。
个体化用药
根据患者的基因型差异，利用RNA干扰技术定制个体 化的药物治疗方案，提高治疗效果和安全性。
个体化治疗
1 2
基因治疗
通过RNA干扰技术沉默缺陷基因或过表达基因， 实现基因治疗，治疗遗传性疾病和罕见病。
基因治疗：RNA干扰技术还可以用于基因治疗，通过沉默致病基因的表达，达到预防和治疗遗传性疾病的目的。例如，针对 杜氏肌营养不良症的RNA干扰药物已经进入临床试验阶段。
在癌症研究中的应用
癌症是由于基因突变引起的疾病，RNA干扰技术可以通过沉默致癌基因的表达，达到治疗癌症的目的 。例如，针对某些致癌基因的RNA干扰药物已经进入临床试验阶段。
细胞类型和组织特异性
RNA干扰在某些细胞类型或组织中的效率和特异性可能 较低，这限制了其在某些研究或治疗应用中的使用。
长期沉默和脱靶分析
在某些情况下，RNA干扰可能导致基因的长期沉默，这 可能对细胞或生物体产生不可逆的影响。同时，对脱靶效 应的全面分析仍是一个挑战。
体内应用
将RNA干扰技术应用于体内实验或治疗时，如何有效地 将siRNA传递到靶组织是一个关键挑战。
药物研发：RNA干扰技术还可以用于药物研发，通过沉默致癌基因的表达，筛选出具有抗癌活性的小 分子药物。例如，针对某些致癌基因的小分子药物已经进入临床试验阶段。
在神经科学中的应用
神经科学是研究神经系统和神经元活动的科学，RNA干扰技 术可以通过沉默某些基因的表达，达到调节神经元活动和行 为的目的。例如，针对某些神经递质受体的RNA干扰药物已 经进入临床试验阶段。
rna干扰
rna干扰RNA干扰技术是一种利用RNA分子干扰靶标基因表达的方法，该技术的研究与应用已经广泛扩展到生物学、医学以及生物技术领域。
本文将介绍RNA干扰技术的原理、应用和未来发展前景。
RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是由RNA介导的靶向基因沉默的一种机制。
它最早在植物中被发现，后来也被发现在动物细胞中广泛存在。
RNA干扰通过靶向性介导的方法，降低或抑制特定基因的表达，从而实现对基因功能的研究和调控。
RNA干扰的基本原理是双链RNA（dsRNA）通过酶切分解为20-25个碱基对长的小干扰RNA（small interfering RNA，简称siRNA）。
siRNA与RNA诱导静默复合体（RNA-induced silencing complex，简称RISC）结合，将其中一条链引导到靶标mRNA上，并通过与该mRNA互补配对，发挥沉默作用。
引导链与靶标mRNA形成稳定的双链结构，进而被RISC酶降解，从而阻断了该mRNA的翻译过程或引起其降解。
通过RNA干扰技术，可以特异性地沉默特定基因的表达。
RNA干扰技术的应用非常广泛。
首先，它被广泛应用于基因功能研究。
通过对单个基因进行沉默，可以直接观察到其对细胞及生物体的影响，从而揭示其在生物过程中的作用。
其次，RNA干扰技术也可以用于治疗疾病。
对于一些基因异常表达导致疾病的情况，通过RNA干扰技术恢复正常的基因表达，可以有望治疗相关疾病。
此外，RNA干扰技术还可以用于抗病毒研究、农业作物改良等领域。
在临床应用方面，RNA干扰技术已取得了一些重要的突破。
例如，目前已经有一些RNA干扰基因药物进入了临床试验阶段。
这些基因药物通过RNA干扰技术沉默与疾病相关的靶标基因，为患者治疗提供了新的选择。
此外，RNA干扰技术还可以用于个体化医学，根据患者基因的特点制定个体化的治疗方案，提高治疗的效果。
然而，RNA干扰技术仍然面临一些挑战和限制。
RNA干扰与基因沉默的分子机制
RNA干扰与基因沉默的分子机制RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由具有特定序列的双链RNA分子介导的基因沉默机制。
它在生物体内起着重要的调控基因表达的作用。
本文将探讨RNA干扰的分子机制，以及它与基因沉默之间的关系。
一、RNA干扰的发现和原理RNA干扰最早是由安德鲁·法耶和克雷格·米洛在1990年代中期发现的。
他们发现在尼蔺的体内注射双链RNA后，对于相应基因的表达发生了沉默。
这一发现揭示了RNA干扰的存在，并引起了全球科学界的广泛兴趣与研究。
RNA干扰的基本原理是通过特定的酶将双链RNA分子剪切成短小的小分子RNA（small RNA，sRNA），然后将其与RNA识别蛋白复合体形成RNA诱导沉默复合体（RISC）。
RISC能够识别并与相应的mRNA结合，进而导致靶基因的沉默。
二、RNA干扰的类型根据RNA干扰发生的位置和机制的不同，可以将其分为两种主要类型：小干扰RNA介导的RNA干扰（small interfering RNA-mediated RNA interference，siRNA-mediated RNAi）和微小RNA介导的RNA干扰（microRNA-mediated RNA interference，miRNA-mediated RNAi）。
1. siRNA介导的RNA干扰siRNA是由外源双链RNA（如病毒RNA）或内源非编码RNA（如LTR、剪接RNA等）在细胞内经过特定酶的作用而生成的。
siRNA的一条链被剪切成21-23个核苷酸的小片段，形成活性RNA双链（active RNA duplex）。
这个双链RNA具有与靶基因mRNA互补的序列，能够与之杂交并引起基因表达的沉默。
2. miRNA介导的RNA干扰miRNA是一类内源的、长度约为21-24个核苷酸的非编码RNA，它们通过与RISC复合体结合，调节细胞内多种基因的表达。
RNA干扰
RNA干扰RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。
由双链RNA(doublestrandedRNAs，dsRNAs)引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。
有时转基因会同时导致TGS和PTGS。
由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。
RNAi是在研究秀丽新小杆线虫（C. elegans）反义RNA（antisense RNA）的过程1.作用机制病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。
宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。
siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。
RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。
被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。
siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA 结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi 的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。
请解释rna干扰的原理及应用
RNA干扰的原理及应用1. RNA干扰的原理RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种基因沉默现象，通过介导转录本的降解或抑制翻译来调节基因表达。
它首次被发现于线虫Caenorhabditis elegans 中，随后发现在多种生物中广泛存在，并在生物学研究和生物医学领域得到广泛应用。
RNA干扰包括两个重要的过程：siRNA调控和miRNA调控。
在siRNA调控中，外源性的双链小干扰RNA (siRNA)通过RISC（RNA-诱导的沉默复合体）的介导将小干扰RNA的一个链进行降解，将另一链引导到靶mRNA上，产生相应的RNAi现象。
在miRNA调控中，内源性的miRNA通过RISC的介导将靶mRNA进行降解，抑制其翻译。
2. RNA干扰的应用RNA干扰技术在生物学研究和生物医学领域有着广泛的应用，主要包括以下几个方面：2.1 功能基因组学研究通过RNA干扰技术，可以选择性地沉默某个特定基因，在细胞或生物体内进行功能研究。
通过观察沉默基因后的表型改变，可以揭示该基因在生物学过程中的功能和调控机制。
这为研究基因功能和生物途径提供了一种方便有效的方法。
2.2 新药研发RNA干扰技术可以用于筛选和鉴定关键基因，从而发现新的药物靶点。
通过沉默某些特定基因，可以评估其对细胞过程或病理过程的贡献，并筛选出具有治疗潜力的药物靶点。
此外，通过RNA干扰还可以对已知靶点进行有效的验证和确认。
2.3 治疗基因相关疾病RNA干扰技术在治疗基因相关疾病方面具有巨大的潜力。
通过针对特定疾病相关基因的RNA干扰，可以抑制目标基因的表达，从而治疗相关疾病。
例如，通过靶向HIV的RNA干扰药物已被用于治疗艾滋病。
2.4 农业生物技术RNA干扰技术在农业领域中的应用也非常广泛。
通过沉默特定的基因，可以改良植物的性状，提高产量和抗逆性。
此外，RNA干扰还可以用于抑制害虫的基因表达，从而控制害虫的数量，降低农药使用，保护环境。
RNA干扰名词解释
RNA干扰名词解释RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种在基因表达调控过程中起关键作用的现象，也是一种常用的实验技术。
RNA干扰是指通过引入外源双链RNA（dsRNA），使其与特定的目标RNA序列产生互补配对，从而导致目标RNA降解或抑制其翻译的过程。
RNA干扰分为内源性RNA干扰和外源性RNA干扰。
内源性RNA干扰是生物体自身具备的一种防御机制，通过特定的酶（Dicer和Argonaute等）将dsRNA切割成长度约为21-25个核苷酸的小分子siRNA（小干扰RNA），然后与Argonaute蛋白结合形成RNA-诱导沉默复合物（RISC），通过互补配对特异性地降解目标mRNA或抑制其翻译。
外源性RNA干扰则是通过外源方法将dsRNA或人工合成的siRNA导入细胞内，引发类似的干扰效应。
RNA干扰在生物学研究中广泛应用。
通过选择合适的dsRNA序列，可以针对特定基因进行干扰，研究该基因的功能和调控机制。
通过抑制目标基因的表达，可以研究其对生物体或细胞的功能影响，验证其在生命过程中的重要性。
此外，RNA干扰还可以用于筛选基因库，寻找参与特定生理过程的新基因，或在疾病治疗中靶向抑制特定基因的表达。
RNA干扰技术的应用还包括在植物和动物遗传改良中。
通过选择性地抑制目标基因的表达，可以引起特定性状的变化，例如提高作物产量、增强抗病性等。
此外，RNA干扰还可以用于治疗疾病，例如通过沉默特定基因来治疗癌症、病毒感染等。
虽然RNA干扰技术有着广泛的应用前景，但也存在一些限制。
首先，由于dsRNA的特异性是通过互补配对实现的，因此如果引入的dsRNA序列与其他靶标RNA序列存在部分相似性，也可能对其产生干扰，导致误识别和副作用。
其次，外源性RNA干扰技术在某些细胞类型和生物体中的效率较低，对于特定的细胞类型和生物体，可能需要进行优化和改进。
综上所述，RNA干扰是一种重要的基因表达调控机制，并且具有广泛的应用潜力。
RNA 干扰
RNA 干扰(RNA interference , RNAi )是存在于真核细胞内的一种自我保护现象,既能对抗如病毒基因或人工转入基因所表达的mRNA 等外源基因的侵害, 又能降解自身异常基因产生的mRNA。
RNA 干扰主要发生在基因转录后,即mRNA 的修饰或翻译水平上,具有特异、高效和持久的特点,适用于后基因组时代未知功能基因的分析, 也为临床上特异性的基因干预治疗开辟了一条通路。
RNAi在哺乳动物细胞中有两种作用机制：一种是大于30 nt的长双链RNA（dsRNA）产生的广泛的、非特异性效应。
其机制可能是激活了细胞内的蛋白激酶R和RNA酶L，从而导致了非特异性的细胞凋亡。
另一种是21～23 nt的短双链RNA（siRNA）产生的相对具体的、特异性效应。
目前，RNAi在抗病毒及肿瘤中的研究主要集中在siRNA产生的特异性效应。
下面主要介绍siRNA的作用机制。
siRNA的作用机制目前尚未完全阐明，但已基本达成共识，即①dsRNA在细胞内与DICER酶（一种RNAaseIII家族中特异性识别dsRNA的酶）结合，随即被分割成21～23个核苷酸的短链dsRNA，在这个过程中需要ATP的参与。
②分割下来的短链dsRNA 即为siRNA，它是RNAi的起始诱导物，与DICER酶形成RNA引导的沉默复合体（RISC），此时RISC无活性，随后，siRNA经历一个依赖ATP的解双链过程激活RISC［2］。
③siRNA 特异性地识别靶基因转录的mRNA，并引导RISC结合mRNA，RISC中的DICER酶将mRNA切割成21～23个核苷酸片段，此后mRNA被逐步降解，导致不能进行翻译过程，从而引起目的基因沉默，抑制靶基因的表达。
④新产生的dsRNA（siRNA）可继续形成RISC 复合物进入新一轮RNAi的循环，产生正反馈效应。
这一过程需在RNA依赖RNA聚合酶（RdRP）的条件下进行。
除上述机制外，转基因真核生物dsRNA 还可引起相应基因的甲基化，促使异常RNA产生，最终导致基因沉默。
什么是RNA干扰
什么是RNA干预或RNA干扰（RNA interference，RNAi）？一、定义RNA干预或RNA干扰（RNA interference，RNAi）作为一种生物学现象，它是由双链RNA（dsRNA）介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。
可以对内源mRNA，也可以对外源mRNA为降解目标，这种基因沉默现象是一种核苷酸序列特异性的自我防御机制。
当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。
二、发现1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义和正义RNA都阻断了基因的表达。
1998年，Andrew Fire的研究证明正起作用的是双链RNA。
这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。
这种双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干预或干扰。
随后的研究中发现，RNAi现象广泛存在于真核生物体内，可用来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用。
RNAi目前作为一种应用广泛的生物研究技术和生物工程技术，具有多方面的用途。
三、作用机理细胞利用Dicer酶（参与RNAi反应的Dicer酶为RNA酶Ⅲ家族的一个成员，它能切割双链RNA，Dicer酶包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点。
）将双链RNA切割裂解成21到23个核苷酸的片断，称为短干预或短干扰RNA（short interference RNA，siRNA）或微RNA（microRNA）。
外源dsRNA或内源pre-miRNA可被Dicer酶加工并掺入到RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），使mRNA分子引发翻译阻遏（translational repression）。
外源dsRNA或内源pre-miRNA掺入到RNA诱导的转录沉默复合体（RNA-induced transcriptional silencing complex，RITS）中会诱导基因组保持活性如组蛋白甲基化（histone methylation）和染色质重组织（chromatin reorganization）。
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Naturally occuring and artifical miRNA
(serving as siRNA)
利用DNA载体的RNAi技术的优点之一 是siRNA能在细胞中比较稳定表达，介导较 长时间的基因沉默。除质粒载体外，科研 人员已经成功地采用逆转录病毒载体、腺 相关病毒载体和慢病毒载体将表达siRNA的 DNA模板序列转移入哺乳动物细胞。现在 许多学者正在加紧腺病毒载体的siRNA转移 研究 。
另外，内源性的小的短暂RNA（small temporal RNA，stRNA，为一种修饰后 的miRNA）也可作为siRNA发挥基因沉默 作用。stRNA（miRNA）是~70nt发夹 RNA （发夹miRNA 前体，miRNA hair precursor）被RNaseⅢ样核酸酶切割加工 成的单链~22nt RNA。由于stRNA与靶基 因不完全互补，它从翻译水平阻抑基因表 达。
Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos. (A) Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.)
研究基因的功能：由于RNAi 可以特异 性抑制特定的基因，获得功能丧失，因此 可用于功能基因组的研究（类似Gene knock out)。图示 防御病毒的感染：RNAi具有对抗侵入性 遗传因子（如病毒、转座子、转基因）的 作用、打破其复制循环、减弱或消除其基 因毒性作用 。由于RNAi也存在于哺乳动物 细胞中，RNAi或许可被利用来治疗病毒性 疾病。
第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP 参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其 中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体 (RNA-induced silencing complex， RISC)。 RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸 内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。活化 的RISC在单链siRNA引导下识别互补的 mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从 siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶 mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降 解，从而干扰基因表达。
90年代初，Rich Jorgensen 设想，将 更多的色素基因注入植物体，能使花朵的 色彩更艳丽，而结果出其预料，转基因的 植株不仅没有新基因表达，反而使原有的 色素基因也受到了抑制，当时称共抑制 （cosuppression)。 94年Cogoni等证明真菌中亦有类似现 象，此称为基因压制 (quelling)。
TGS是指转基因在细胞核内RNA 合成受到了
阻止而导致基因沉默； PTGS 则是指转基因能够在细胞核里被稳定 地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA 存在这 一现象。
RNAi的作用机制
目前普遍认为，共抑制、基因压制和 RNAi很可能具有相同的分子机制，都是通 过dsRNA的介导而特异地降解靶mRNA, 抑制相应基因的表达。 即RNAi、共抑制、 quelling均属于PTGS！现已初步阐明 dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程主 要分为两步。
2’，5’寡腺苷酸合成酶，其催化合成的 2’，5’寡腺苷酸会激活RNase L。RNase L能 够非特异地水解所有的mRNA。干扰素可加 剧以上两种酶促反应，最终导致蛋白合成终Fra bibliotek止、诱发细胞凋亡。
~21nt siRNA介导特异靶基因沉默
近来研究发现通过导入~21nt的siRNA可在 哺乳动物中介导序列特异的基因沉默 。这些 siRNA长至可诱导特异基因沉默，短至可逃避宿 主的非特异干扰素效应。 Harborth等曾用体外 化学合成的21nt siRNA沉默靶基因成功。但因化 学合成的RNA易被RNase降解而且成本昂贵，目 前主要转向研究利用DNA载体在细胞内合成 siRNA。
RNAi—生物技术的蓝月亮
基因治疗：RNAi 作用的高度特异性有可能特 异地抑制致病的突变等位基因，但又不影响正常 的等位基因。 肿瘤的基因治疗：肿瘤是多个基因相互作用的 基因网络调控异常的结果，传统技术诱发的单个 癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长， 而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一 段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这 一序列的dsRNA分子，只导入一种dsRNA 既可 以产生多个基因同时沉默。
质粒载体表达合成siRNA的方法
第一种是设计可自然形成发夹的RNA （~22nt）: 两种RNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）启动子（U6 或H1）控制一段反向重复序列（中间被可变间隔 序列分开）转录，结果可在胞内合成具有发夹结 构的双链RNA（含19~29nt的茎和3~9nt的环）， 其中19~29nt的茎与靶基因序列互补。另外，此 发夹RNA的3’末端含有4个或4个以下的尿嘧啶。 实验证实， 3’末端为UU的RNA较AA、CC或GG 为末端的RNA更能有效地诱导基因沉默。
RNAi现象的普遍性
随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟 草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生 物中。
RNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线 虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。
基因沉默
转基因沉默分为转录水平的基因沉默 (Transcriptional Gene Silencing, TGS) 和转录后 水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)两种：
第二种是将两个U6启动子串联在一起 或置于两个分开的载体中以引导19nt的 siRNA正义和反义链转录，正义、反义链在 体内退火连接成双链siRNA。此siRNA中所 含的19nt序列与靶基因互补，且siRNA的3’ 末端亦含4个或4个以下的尿嘧啶。
表达siRNA的载体构建图
虽然由于内源性stRNA（miRNA）与 靶基因不完全互补，它从翻译水平阻抑基 因表达，但研究发现人工设计的与靶基因 完全互补的修饰后的miRNA则可同siRNA 一样在转录水平沉默基因，因此我们通过 人工设计表达miRNA发夹前体（~70nt） 的质粒载体也是RNAi技术的另一种方法。
95年Guo和kemphues在秀丽线虫 (C.elegans)中用反义RNA 阻止一些基因 的表达，给对照组用正义RNA不但不增加 该基因的表达，反而产生与反义RNA 同样 的结果——特异性阻断该基因的表达，从 而正式表明RNA 干扰现象的存在。
Fire等发现将ds RNA注入秀丽线虫可显 著抑制特定基因的表达，并证明了Guo和 kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用 其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。 将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA 无基因抑制作用，反义RNA的基因抑制作用也 很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫，却能 高效、特异地阻断相应基因的表达。实验证明 双链RNA抑制基因的表达的效率比纯化后的反 义RNA至少高几个数量 ，他们称此现象为ds RNA介导的RNA干扰（RNAi）。图示
在许多机体中反向重复转基因序列在 细胞核内转录成发夹dsRNA，进而可介导 RNAi，这种dsRNA可能需要转移至胞浆中 才可有效地沉默同源靶mRNA。 例如，在果蝇中，转录含有内含子和 多聚腺苷酸信号的发夹dsRNA的反向重复 转基因序列比转录不含内含子、不含多聚 腺苷酸信号dsRNA的转基因序列更能有效 地沉默同源靶mRNA（因为内含子和多聚 腺苷酸信号有利于dsRNA转移入胞浆）。
RNA 干扰
吴xx 指导：刘xx
RNA 干扰 （RNA interference，RNAi）
RNAi是与靶基因序列同源的双链RNA (dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现 象。 它是真核生物中存在的一种抗病毒入 侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控 机制，具有重大生物学意义。
RNAi的发现简史
RNAi降解mRNA的过程
外源dsRNA dsRNA
核酸酶
21-23nt dsRNA-核酸酶 RISC
mRNA
链互换 正义RNA
反义RNA-mRNA-核酸酶 mRNA降解 RNAi 或 PTGS
RNAi 的特点
转录后水平的基因沉默 较高特异性：能够非常特异地降解与之序 列相应的单个内源基因的mRNA。 高效性：相对少量的dsRNA就可以使相应 的基因表达受抑制。 可遗传性及远距离效应：RNAi基因表达的 效应可以突破细胞的界限，可传递给子一 代。
RNAi的作用机制模式图
RNAi途径主要存在于细胞浆中，但是 siRNA产生、靶mRNA降解的亚细胞位置 尚未明确。外源性（注射或喂养）的 dsRNA和病毒性dsRNA可能可以直接进入 细胞浆中的RNAi途径，仅在细胞浆中复制 的RNA病毒可被dsRNA介导的沉默机制所 抑制。外源性dsRNA则还可导致细胞核中 的同源早期RNA转录产物减少。