RNA干扰完整解析

HIV-1的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进
入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行 性大大增加。
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Randall等证明了针对 HCV(丙型肝炎病毒) RNA的
siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的 HCV RNA降低80
端和5’端磷酸化的siRNA诱导的RNAi效应最强。
siRNAs have a defined structure
19 nt duplex
2 nt 3’ overhangs
siRNA具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞 间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于 30bp的dsRNA可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白 激酶(PKR)的激活而使其被降解，从而大大减少了其对 mRNA的抑制作用。 在RNAi启始过程中发挥酶切作用的Dicer酶属于 RNaseⅢ核糖核酸酶家族中的第三个家族，该家族的 RNase含有两个催化结构域，一个螺旋酶及PAZ模体 (motif)，其功能是特异地将dsRNA降解成siRNA，因此， Dicer酶被认为是启动RNAi效应的关键。然而，令人费解 的是，为什么Dicer酶的降解产物是21nt~23nt的siRNA呢 ?最近对RNaseⅢ催化结构域的结构的研究使其真相大白 。
RNAi 机制作为真核生物基因组免疫系统, 抑制外源和内源有害基因 表达。利用RNAi 技术把与病毒基因具同源性的siRNA 引入感染细胞将会 抑制病毒的增殖。利用RNAi 技术抑制过度表达的癌基因将会使癌症表型 逆转或病程得以控制。 研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个 研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi抑制了HIV-1的 coreceptor(辅助受体)-CCR5进入人体外周Ｔ淋巴细胞，不影响另一种
(3)效应阶段
siRNA引导RISC与同源性的mRNA结合，在ATP及解 旋酶(如Rde-3、MUT-6、MUT-14)的作用下使siRNA链解离 ，并使RISC由250X103大小的前体形式变成约100X103左右 活性形式，同时解旋酶催化同源mRNA与siRNA的正义链互 换，核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5’起始端 下游7~10个核苷酸处切断mRNA，起到特异地抑制基因表达 的效果。
1995
美国华盛顿卡耐 基研究院 的 Fire等在研 究 RNA 干扰所需的结构和传递条件的试
1998
Hamilton等首次在PTGS植株中发现了长 度为25nt的RNA中间产物。2000年，
验中发现, 把 dsRNA 正义链和反义链的混 合物注入线虫体内, 比注入单独的任意一个 正义链或反义链的效果均要好。
(1) siRNA的形成阶段； (2) RNA诱导的沉默复合物 ( RNA-induced silencing complex，RISC)形成阶段 ； (3) 效应阶段 ；
(4) 扩增阶段。
RNAi机制
外源
病毒
异常ssRNA
转座子
RdRP合成RNA
双链siRNA
激活的siRNA复合物
目标识别 内切酶切割目标 RdRP合成RNA 二级siRNA 外切酶降解RNA
应用：
RNAi主要通过在转录后 （post-transcriptional）水平阻断基因的表达， 导致蛋白无法合成，出现“基因沉默”。比如，我 们可以按拟定的方式来关闭（shutting off）非必 需或致病基因的功能。从理论上说，若能关闭致病 基因的表达则很多疾病将被治愈。动物实验已证明， 可以通过RNAi的方法使导致血胆固醇升高的基因 “沉默”；病毒性疾病，眼疾，心血管代谢性疾病 等方面的临床试验也正在进行中；这一方法为病毒 性肝炎、艾滋病和肿瘤等人类顽疾的治疗指了一条 新路 。
2000
Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子 构建了小发卡RNA（small hairpin RNA， shRNA）表达载体pSUPER，并证实转染该 载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内 目的基因的表达，为利用RNAi技术进行基 因治疗研究奠定了基础。
2002
RNAi的作用机制
RNAi的机制和过程大致分为以下几个阶段进行：
RNA干扰的发现
2006年，安德鲁· 法厄与克雷格· 梅 洛（Craig C. Mello）由于在RNAi 机制研究中的贡献获得诺贝尔生理 及医学奖。
Napoli 等尝试在有颜色的矮牵牛( Petunia
hybrida ) 花翼瓣中通过介入CHS基因使查
1990
Fire 等把 RNA 注入新 秀杆线虫以控制基因的 表达
Zamore和Hammond等使用体外培养的
果蝇细胞进行研究发现，外源性dsRNA 通过耗能过程降解成21-23nt的小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA） 引发RNAi。
1999
Wianny和Svoboda等分别证实在小鼠胚胎 细胞和卵母细胞中dsRNA能引发RNAi效应。 2001年，Elbashir等证实21nt的siRNA可在 避免激活dsRNA依赖的蛋白激酶和2',5'-寡聚 腺苷酸合成酶信号转导途径的同时，有效抑 制人胚肾293细胞、Hela细胞等哺乳动物细 胞中目的基因的表达。
RNA的干扰
RNA的干扰
RNA干扰是什么 RNA干扰的发现
RNA
干扰
RNA干扰的作用机制 RNA干扰的应用 RNA干扰存在的问题
什么是RNA干扰？
• 英文：RNA interference，缩写RNAi 。 • 概念：是指在进化过程中高度保守的、由 双链RNA（double-stranded RNA， dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性 降解的现象，是正常生物体内抑制特定基 因表达的一种现象
Dicer
一种核酸酶,负责将dsRNA 转化为siRNA ： 它属于RNase Ⅲ家族,具有两个催化结构域、一个解 旋酶( helicase) 结构域和一个PAZ ( Piwi/ Argonaute/ Zwille ) 结构域, Dicer 在催化过程中以二聚体的形式 出现, 其催化结构域在dsRNA 上反平行排列, 形成四个活 性位点, 但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性, 这两 个位点在相距约22bp 的距离切断dsRNA , 各种生物体内
(1) siRNA的形成阶段
目前，RNAi的作用机制主要是在线虫、果蝇和拟南 芥等生物体内阐明的。生物体由于RNA病毒入侵、转座子 转录、基因组中反向重复序列(inverted repeats)转录及外 源基因导入等原因，细胞中可出现dsRNA分子。 当各种原因产生的dsRNA在细胞中出现时，细胞中 一组特定蛋白复合物可识别dsRNA，此阶段需要Rde-1、 Rde-4和dsRNA特异性的核酸内切酶Dicer等共同参与。 Rde-1,4编码的蛋白识别并引导dsRNA与Dicer结合，然后 Dicer将dsRNA解旋，再将其裂解为21~25nt大小的小干扰 RNA (small interfering RNA，siRNA)。
RISC
RNA-induced Silencing Complex
核酸内切酶 解旋酶
Argonaute protein
siRNA mRNA 100KD (active)
250KD (inactive)
ATP
9/24/2018
(4)扩增阶段
该反应以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA为模板 ，在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下，扩增靶mRNA，产生新的二级 siRNA，而这些siRNA又能继续反作用于靶mRNA。 RdRP不仅能增加siRNA的拷贝数，而且能将异常的单 链RNA转变为dsRNA。RdRP还是一个重要的“感应器”，它 能识别正常和异常的RNA。转基因RNA和病毒RNA都在RdRP 的识别下启动RNAi的反应过程。
Dicer结构略有不同, 致使siRNA 长度存在微小差别。
Dicer
Models for Dicer cleavage
启始阶段
加工酶
加工成21-23核苷酸片段
Dicer
RISC
mRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解
①
Dicer
siRNA的形成
siRNA
②
RISC
(2)RNA诱导的沉默复合物形成阶段
RNAi的应用领域
1
基因功能研究
2
病毒性疾病的治疗
3
肿瘤治疗
4
药物开发
1）基因功能研究
由于RNAi技术可以利用siRNA使目的基因
行高 通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、 发现新的药物作用靶点有重要意义。
2）病毒性疾病的治疗
尔酮合成酶过量表达, 出人意料的是,
来加深花瓣的颜色。
花瓣颜色不仅未加深,而且
42%的介入 CHS 基因的植物的花全部变白 或有白色或灰白图案。
1991
罗马诺（Romano）和Macino
1992
Guo和Kemphues在线 虫中也发现了RNA干扰 现象。
也在粗糙链孢霉中发现了外源导 入基因可以抑制具有同源序列的 内源基因的表达
RNAi扩大效应
目前，对这பைடு நூலகம்现象的解释至少有 四种机制：
① Dicer酶将长dsRNA分子切成短的“初级siRNA”，再由后者降解 同源的mRNA，故dsRNA的长度决定了放大效应的水平； ② siRNA在酶作用中，可多次利用，能进一步提供放大的信号； ③ 移行RNAi (transitive RNAi)中，siRNA可作为靶mRNA的引物， 在RdRP和Dicer等的作用下产生“次级siRNA”，导致沉默信号的扩 增。 ④ “异常RNA”(aberrant RNA)无需引物，可在RdRP的作用下生成 dsRNA，并由Dicer酶切生成siRNA。 以上四种机制中，尤其是移行RNAi的发现为阐明沉默效应的扩增 及传递提供了重要线索。
Dicer
核酸内切酶 核酸外切酶
同源搜索活性 解旋酶
Dicer contains two RNAse III domains
long dsRNA
siRNAs
Dicer定位于胞浆中，但核内mRNA剪切修饰后，向核
外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其他类似功能的 酶发挥作用。现认为21~25nt大小在3’端带有2~3个碱基悬
生成的siRNA和RNAi特异性酶，如AGO-2、MUT-7、 RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶结合形成RISC（RNAinduced silencing complex），具有序列特异性核酸内 、外切酶和解旋酶活性，能特异地降解与siRNA同源的靶 mRNA。
RNA诱导的沉默复合物 ( RNA-induced silencing complex，RISC)
移行RNAi
移行RNAi是指沉默信号沿特定基因的移动。即沉默信号沿特 定的mRNA由3’ 5’方向移动，这就是“移行RNAi”。在移行 RNAi中新生成的siRNA并非直接来自导入的dsRNA，而是在细胞中 RdRP的作用下，以初级siRNA的反义链为引物，以靶mRNA为模板， 生成dsRNA，随后在Dicer酶及ATP的作用下产生新的siRNA，称为次 级siRNA。除RdRP通过产生次级siRNA参与RNAi信号扩增外，其他与 RdRP具有同源序列的蛋白类似物也通过相同的方式产生次级siRNA 参与沉默信号的扩增。 此外，RNAi的扩增效应还可能存在另外两种机制： (1) Dicer将长 dsRNA切成初级siRNA，这一放大水平取决于dsRNA的长度；(2) siRNA在酶的作用下可以多次应用，产生进一步的放大效应。
效应阶段
解旋酶 核酸外切酶
同源性检索活性
核酸内切酶 mRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解
RISC
在这些机制中，RISC是一个很 灵活的平台，在不同的情况下结合 不同的调节分子从而具有不同的功 能。RISC复合物的核心负责接受从 Dicer加工来的小RNA，并用该小 RNA作为识别其同源底物的向导从 而介导RNAi的发生。
倍；将siRNA 转染至已有HCV感染、复制的细胞，siRNA对