RNA干扰步骤
RNA干扰技术及其应用
RNA干扰技术及其应用随着生命科学的不断发展，RNA干扰技术（RNA interference，简称RNAi）逐渐成为了一种被广泛关注和使用的分子生物学工具。
RNA干扰技术的原理是通过利用RNA分子的特殊功能特点来靶向抑制或沉默特定基因，从而实现对基因表达、信号传递、病理发生等生物学过程的研究和调控。
RNAi的基本原理RNAi是一种高度特异的基因沉默机制，它的基本原理是利用小分子RNA识别和结合靶标mRNA，通过介导降解或抑制靶标mRNA的翻译，从而靶向性地沉默特定基因。
RNAi是从生物体内自然存在的基因表达沉默机制中发现的，主要通过使用双链RNA （dsRNA）来激活RNAi途径，这其中包括三个主要的步骤：转录、切割和选通。
RNAi的应用RNAi技术的应用范围非常广泛，从基础研究到生物技术工业等各个领域都有着不同的应用。
这里我们简单介绍一下RNAi在基础研究、药物研发、新药开发等领域的应用：1. 基础研究：RNAi的应用在基础研究中占有非常重要的地位，可以通过使用RNAi技术来破解基因调控网络、探索基因功能等。
例如，利用RNAi技术可以抑制细胞特定的基因表达，从而研究其对生理学和病理学的影响。
2. 药物研发：RNAi技术可以在新药研发过程中发挥重要的作用，可以靶向性地抑制疾病相关基因的表达，从而实现疾病的治疗。
例如，RNAi可以通过抑制肿瘤相关基因的表达，从而达到治疗肿瘤的目的。
3. 新药开发：RNAi技术在新药开发方面也有非常巨大的应用潜力。
例如，利用RNAi技术可以研究药物的靶标和作用机制、药物毒性的评估和筛选等。
此外，RNAi技术在病毒、传染病等领域也有着广泛的应用。
若在这方面的研究上取得突破性的进展，对人类健康和医学界的发展将意义重大。
结语综合来看，RNAi技术在基础研究、新药研发和治疗等领域都有着极为广泛的应用前景，对生命科学和医学的发展将产生深远的影响。
但就其本身而言，目前RNAi技术还有许多亟待解决的问题，例如RNAi是否会影响基因表达谱的全局性、RNAi技术的非特异性效应等等，这些问题也是RNAi技术需要不断完善和发展的方向。
rna干扰
RNA干扰什么是RNA干扰？RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种通过特定的RNA分子干扰基因表达的现象。
这种现象最早被发现于植物和线虫中，后来发现在动物中也普遍存在。
RNA干扰通过介导mRNA的降解或抑制转录来实现靶向基因的沉默。
RNA干扰的机制主要是通过一种特殊的小RNA分子，称为干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）或小干扰RNA （short interfering RNA，shRNA）。
这些siRNA或shRNA是由外源性或内源性的长双链RNA在细胞内被核酶Dicer切割而成的20-30个碱基的双链RNA分子。
RNA干扰的过程RNA干扰的过程可以分为三个主要步骤：siRNA的产生、siRNA的引物和RNA诱导沉默复合物（RISC）的形成、RISC 介导的mRNA降解或转录抑制。
首先，外源性或内源性的长双链RNA被核酶Dicer切割成20-30个碱基的siRNA。
siRNA由RNA诱导沉默复合物（RISC）捕获，其中的一个链被释放，留下一个导引链和一个剪切链在RISC中。
接下来，导引链将与靶标mRNA互补结合。
RISC将靶标mRNA切割成小片段，导致mRNA的降解或转录抑制。
这种RNA干扰过程可以非常特异地沉默特定的基因表达。
RNA干扰在基因研究中的应用RNA干扰已经成为基础科学研究和功能基因组学研究中广泛应用的工具。
通过沉默特定基因的表达，研究人员可以揭示该基因在生物学过程中的功能，以及该基因对疾病发展的影响。
在细胞水平上，RNA干扰可以用于验证候选基因是否在特定生物途径中起关键作用，或者用于筛选新药物靶点。
研究人员可以通过转染siRNA或shRNA来干扰目标基因，评估其对细胞功能的影响。
在动物模型中，RNA干扰可以用于研究特定基因的作用。
通过通过siRNA或shRNA直接注射进入动物体内，可以沉默目标基因的表达，并观察动物表型的变化。
RNA干扰的分子机制和应用研究
RNA干扰的分子机制和应用研究导语：RNA干扰是一种重要的调控基因表达的分子机制。
它通过介导RNA降解的方式，在不同的生物过程中发挥着重要的作用。
本文将从RNA干扰的机制入手，深入探讨它在基因调控、治疗疾病等方面的应用。
一、RNA干扰的机制RNA干扰是一种由双链RNA（dsRNA）介导的信号转导过程，分为小干扰RNA（siRNA）和microRNA（miRNA）两种，它们共同参与了基因调控的过程。
1.siRNA的形成过程：首先，一种叫做Dicer的酶将长的dsRNA切成21-23个碱基长的双股串。
然后，这个小双股串结合到一个复合物上，成为RNA-诱导沉默复合体（RISC）。
siRNA/RISC复合物与RNA单链的互补区域结合，即RNA的mRNA与siRNA匹配，从而切割RNAmRNA。
该过程种RNA分子起调控作用。
2.miRNA的形成过程：参与miRNA生物合成的miRNA基因最初是转录成长链RNA（pri-miRNA）。
长链RNA由核糖核蛋白复合物（hnRNP）形成，被Exportin-5转移到细胞质。
然后，Dicer和TRBP解剖出21-23个碱基长的双股RNA，成为mature miRNA。
mature miRNA与RISC一起结合，共同寻找和降解mRNA或抑制翻译。
该过程中mRNA被调控。
二、RNA干扰在基因调控中的应用RNA干扰通过特定RNA序列的介导降解或抑制翻译，调控mRNA的表达。
在细胞过程中，miRNA和siRNA在基因调控的过程中发挥着关键的作用。
1. 抑制丝氨酸蛋白酶，减少p53蛋白质的降解，从而降低肿瘤细胞的增殖速度，减少肿瘤的体积。
2. siRNA可以针对特定的目标基因进行靶向治疗，从而减轻癌症诊治的副作用。
3. siRNA具有较高的特异性和选择性，能够只抑制特定基因的表达，而不会影响其他相关基因的表达水平。
这种特异性和选择性使得RNA干扰在药物开发中有很大的应用前景。
RNA干扰及其机制
RNA干扰及其机制RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种在真核生物中广泛存在的保守的基因调控机制。
它通过靶向特定的RNA分子，降低或抑制其转录或翻译，从而实现对基因表达的调控。
RNA干扰机制包括小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）和microRNA(miRNA)两种方式。
RNA干扰的机制主要涉及到siRNA和miRNA的合成、成熟和靶向调控过程。
siRNA是由外源RNA（如病毒RNA）或内源RNA（如转座子RNA）降解产生的小分子RNA，它与RNA诱导的沉默复合体（RISC）相结合，通过序列互补靶向其作用靶标RNA分子，导致靶标RNA的降解或翻译抑制。
miRNA则是内源性产生的一类小RNA，通过转录、剪切和成熟过程产生成熟miRNA，与RISC结合后，靶向调控多个mRNA的翻译。
在siRNA合成过程中，双链RNA（dsRNA）首先由核酸多聚酶复制或RNA转录过程产生，而在miRNA合成过程中，则由miRNA前体RNA经过外核脱去部分序列后产生。
这些长链RNA经过核酸酶Dicer酶的作用进一步加工成为长度约为21-23个核苷酸的双链小miRNA或siRNA。
miRNA与RNA诱导的沉默复合体（RISC）结合后，通过序列互补机制靶向特定的mRNA，从而发挥调控的作用。
RNA干扰的调控作用主要通过两种方式实现：一是通过mRNA的降解，siRNA或miRNA与RISC结合后，通过靶标mRNA上的完全或部分互补序列，引导RISC靶向特定mRNA上的区域，使该mRNA受到核酸内切酶的攻击，导致mRNA的降解；二是通过转录的翻译抑制，siRNA或miRNA与RISC结合后，通过靶标mRNA上的互补序列，抑制其翻译的发生，使得mRNA不能被核糖体识别和翻译出蛋白质。
在细胞中，RNA干扰不仅参与基因的调控，还参与到染色体剪接、DNA甲基化和染色质乃至整个基因组的稳定性调控中。
RNA干扰技术
2006年的诺贝尔生理学奖获得者：
Andrew Z. Fire Craig C. Mello
Glossary (术语)
RNAi----- RNA interference (RNA干扰) siRNAs-----Small interfering RNAs (小干扰性RNA)
dsRNA------double strand RNA(双链Байду номын сангаасNA)
研究发现最有效的siRNAs是21个碱基大小、3’端有两个
突出碱基的双链RNA。
（UU）dTdT
dTdT（UU）
siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一 个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。
The targets of the RNAi-directed gene silencing （RNA干扰指导的基因沉默的结果）：
3、RdRP的功能似是产生以单链RNA引导的dsRNA的合成， 而dsRNA经dicer切割成siRNA，从而放大并维持PTGS 效应。
线虫中的随机降解性PCR模型
RNA-directed RNA polymerase
RICS
RNA-induced silencing complex
Gene silencing
在果蝇的研究中同样发现RNAi。通过显微注射或者通 过基因枪将dsRNA注入果蝇胚胎中能够引发基因沉默。在 过去的几年中RNAi技术在果蝇的研究中成为一种反向遗传 工具，用于鉴定功能缺失表型。
2001年Elbashir等《 Nature》上首次报道通过21个核苷 酸的siRNA成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉 默。随后，在小鼠等多种细胞中也取得了成功。
PTGS------Post-transcriptional gene silencing 转录后基因沉默
RNA干扰
RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是指由与靶基因序列同源的双链RNA(DsRNA)引发的基因转录后的沉默过程，小干扰RNA特异性介导相同序列的mRNA降解，阻断相应基因表达。
我们为您提供的RAN干扰技术包括化学合成小RNA片段（SiRNA）和构建载体RNA （SnRNA）两种形式，客户只需提供干预基因名称或基因序列ID，我们免费设计合适的干预位点，保证至少有一对小RNA有效抑制目的基因表达，抑制效率不低于70%。
RNA干扰流程步骤一确定干扰基因，设计并合成合适的小干扰RNA（片段型或载体型小干扰RNA）。
步骤二预转染实验，进行细胞培养，摸索转染条件、时间并进行必要的检测（WB，PCR 等），确定干预效果最佳的一对小RNA。
步骤三正式实验，设置合理实验分组，进行瞬时或稳定转染。
步骤四转染后检测，根据实验要求选择细胞生物学检测、蛋白检测、分子生物学检测等。
以研究小干扰RNA对于细胞、蛋白或基因功能的影响。
RNA干扰检测细胞检测细胞增殖毒性MTT 细胞凋亡细胞周期细胞迁移细胞侵袭蛋白检测免疫印迹WB 免疫细胞化学ICC 免疫荧光IF 流式细胞术FCM 酶联免疫ELISA分子生物检测RT-PCR 实时荧光定量PCR 甲基化特异性PCR(MSP)生化检测酶类检测脂类检测糖类检测1.材料报价片段型（SiRNA）1980元/套（含3组小RNA+阴性对照）载体型（SnRNA）2800元/套（含4组小RNA+阴性对照）；2.RNA干扰预实验报价片段型（SiRNA）2000元/每项目（含3组小RNA+阴性对照组+WB检测+定量RT-PCR检测）载体型（SnRNA）2500元/每项目（含4组小RNA+阴性对照组+ WB检测+定量RT-PCR检测）；3.RNA干扰正式试验报价细胞培养（普通培养）200元/瓶；细胞培养（转染培养）250元/瓶；细胞爬片50元/片注：每组WB检测需要1瓶细胞；PCR检测以及FCM检测需要1瓶细胞，细胞培养瓶子规格为T25（5×5cm）；4.RNA干扰下游检测报价参见各章节报价RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。
RNA干扰技术的分子生物学机制
RNA干扰机制的破解
掌握RNA干扰技术的分子生物学机制是了解RNA干扰的关键。研究表明，RNA干扰技术的分子生物学机制主要分为三个方面：1）siRNA和miRNA的合成；2）RISC组装和mRNA选择；3）靶基因mRNA的降解和抑制。
siRNA和miRNA的合成
siRNA和miRNA的合成过程类似，包括以下步骤。首先，dsRNA或pre-miRNA经过Dicer酶介导的切割产生20-25个核苷酸的siRNA或miRNA。然后，这些小RNA分子成为RISC的重要组成部分。最后，小RNA将以亚细胞定位方式与RISC的分子组分Ago和其他蛋白质相结合，从而具有生物学活性。
RNA干扰技术的分子生物学机制
RNA干扰技术是一种利用小分子RNA（siRNA）或微小RNA（miRNA）介导的基因沉默，从而抑制特定蛋白质表达的技术。这一技术在分子生物学和生物医学领域中被广泛应用，尤其是在RNAi药物的开发、基因功能研究和病毒防治等方面。本文将探讨RNA干扰技术的分子生物学机制。
RNA干扰载体的构建的实验流程
RNA干扰载体的构建的实验流程RNA干扰载体主要用来研究基因表达调控，RNA干扰技术已已被广泛用于基因结构功能研究和传染性疾病及基因治疗领域，进行RNA干扰实验首先是构建RNA干扰载体，本文以pRI系列载体为例论述了干扰载体的构建的实验流程。
产品技术背景pRI系列载体是基于III类rna聚合酶启动子：人类H1启动子的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。
H1启动子在哺乳动物细胞内合成类似siRNA分子的小分子RNA。
由于H1启动子有精确的转录起始位点和终止信号，H1启动子转录产物精确生成人工设计的shRNA，shRNA经过RISC剪切后形成有2个U突出末端的成熟siRNA。
由于H1启动子对转录产物长度的严格限制，基本上杜绝了非特异性干扰片段的产生，将载体转染细胞后对其它基因的影响降到最低。
pRI系列载体已经成功用于多种哺乳动物细胞进行基因的RNA干扰。
本系列中含有新霉素抗性基因的载体用于稳定表达siRNA，可以在更长时间内对基因表达抑制后的细胞功能和生理现象进行观察和分析。
插入寡核苷酸设计pRI系列载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入pRI系列载体中特定的酶切位点之间，寡核苷酸片段中包含了针对目标基因的mRNA设计的长度为19nt的干扰片段。
合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。
正、反向寡核苷酸退火后与载体连接，插入载体XhoI，BglII位点之间，位于载体上H1启动子下游正确的位置上。
连接后的载体转入哺乳动物细胞在H1启动子作用下转录产生shRNA。
1. 选择干扰序列在RNA干扰实验中，RNA干扰序列的选择会显著影响RNA干扰效果。
我们建议您按照以下几点指导原则选择RNA干扰序列：推荐长度为19 nt，采用21 nt序列也可以取得良好效果。
RNA干扰序列中不包含大于3 nt的连续相同碱基。
RNA干扰序列的GC含量为低到中等水平(推荐GC含量在35%到50%之间)。
不要将RNA干扰序列设计在已知的RNA-蛋白质结合位置附近。
如何进行动物体内RNA干扰实验
如何进行动物体内RNA干扰实验动物体内RNA转染，轻松进行RNA干扰，基因敲除、沉默实验，3天可得出结果。
下面以50μg的核酸与25μl转染试剂，总注射体积200μl，20g小鼠尾静脉注射为例说明。
局部注射不用稀释，直接根据需要把核酸和转染试剂混合即可使用。
1. 核酸的稀释。
将50μg核酸用适量无内毒素纯水稀释成1μg/μl，加入10%葡萄糖溶液(w/v)50μl，使葡萄糖终浓度为5%，终体积为100μl，充分混匀。
2. 转染试剂的稀释。
取25μl的Entranster TM-in vivo试剂用50μl的10%葡萄糖溶液稀释，并用纯水25μl补足，得到葡萄糖终浓度为5%，终体积为100μl液体，充分混匀。
3. 转染复合物形成。
立即将稀释后的转染试剂加入到稀释后的核酸溶液中，立即充分振荡混匀。
4. 室温静置15分钟。
配制好的转染复合物请即配即用，不宜长期存放。
5. 动物注射。
说明：1).尾静脉注射时请掌握注射技巧，一般选用远端1/3处静脉注射，如感觉到阻力和轻微隆起，请停止注射，重新寻找静脉进行操作，不要强力推注，否则容易将药液注射在尾部，导致尾部溃烂。
注射完成后移去针头，按压针孔10秒以上，防止药液流出。
2). 2.5mg/kg的给药剂量是起始给药剂量，如果动物可以耐受，可以按比例增加剂量，这样效果更好。
3).局部注射，尽可能多注射药液，有利于提高转染效果。
6. 基因表达检测。
一般来说，根据注射方法和靶器官的差异，12-48小时后基因表达效果较好。
7. 长期给药。
一次给药检测的最佳时间是注射后12-48小时。
如果需要维持长期效果，可以采用多次注射的方法，注射频度一般为每间隔2-3天一次，也可以根据实验情况适当延长至每7天一次。
rna干扰技术的流程
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RNA干扰技术及其在基因研究中的应用
RNA干扰技术及其在基因研究中的应用随着科学技术的不断进步，人类对基因和遗传学研究的关注越来越高涨。
基因研究在很多领域都有重要的应用价值，其中RNA干扰技术尤为重要。
RNA干扰技术是指利用RNA分子的专一互补配对来沉默一定的基因表达。
本文将详细介绍RNA干扰技术的基本原理及其在基因研究中的应用。
一、RNA干扰技术的基本原理RNA干扰技术最早是发现于植物，随后才被发现在动物细胞中也具有同样的作用机制。
作为一种先进的生物技术，RNA干扰技术的原理可以分为两个步骤：siRNA合成及siRNA从RNAi RISC（RNA诱导沉默复合物）介导的mRNA降解。
1. siRNA合成siRNA是由外源或内源限制酶（Dicer）水解的具有21-23个核苷酸的双链RNA分子。
siRNA的启动分子往往为dsRNA或微RNA（miRNA）前体。
笼统的说，miRNA与dsRNA是同类型但不完全相同，它们在产生过程中都需要dicer这个酶的功效作为固有单元。
Dicer通过将dsRNA水解成带有5‘磷酸的siRNA，siRNA再与RNAi RISC复合体结合，siRNA会被裂解成单链，在与靶标上（如mRNA）一段互补的区域配对，促使mRNA被降解，从而达到沉默的目的。
2. siRNA从RNAi RISC介导的mRNA降解siRNA将mRNA分子降解的过程是在RNAi RISC中实现的。
RNAi RISC是由小RNAs和RNA诱导的弯曲复合物（RISC）组成。
小RNAs的选择和RISC蛋白的招募唯一，起到识别和靶定作用，通过依赖是RNA的物理化学特性如序列比对和互补，最终将mRNA分子切割，使其被降解，从而起到干扰mRNA同源基因的表达的作用。
二、RNA干扰技术在基因研究中的应用RNA干扰技术在基因研究领域中大有用武之地。
其中，常见的应用包括：1. 基因沉默通过合成siRNA，科研人员可以对特定区域的基因进行选择性的沉默，从而研究该基因在细胞或生物体中的生理、生化作用及相互关系。
干扰rna的原理
干扰rna的原理
干扰RNA（siRNA）是一种小分子RNA，可以通过与靶向mRNA结
合来抑制基因表达。
干扰RNA的原理是通过RNA干扰（RNAi）途径，将siRNA与RISC（RNA诱导靶向剪切复合物）结合，形成siRNA-RISC复合物，然后将siRNA与靶向mRNA结合，导致mRNA的降
解或翻译抑制，从而抑制基因表达。
干扰RNA的原理可以分为两个步骤：siRNA的合成和siRNA-RISC复合物的形成。
siRNA的合成是通过一系列酶的作用，将长链RNA切割成21-23个核苷酸的小分子RNA。
siRNA-RISC复合物的形成是通过siRNA与RISC结合，形成siRNA-RISC复合物，然后将siRNA与靶
向mRNA结合，导致mRNA的降解或翻译抑制。
干扰RNA的原理在基因沉默、基因表达调控、病毒防御等方面具有广泛的应用。
在基因沉默方面，干扰RNA可以通过抑制基因表达来研究基因功能和信号通路。
在基因表达调控方面，干扰RNA可以通过调节基因表达来治疗疾病。
在病毒防御方面，干扰RNA可以通过抑制病毒基因表达来防止病毒感染。
总之，干扰RNA的原理是通过RNA干扰途径，将siRNA与RISC结合，形成siRNA-RISC复合物，然后将siRNA与靶向mRNA结合，
导致mRNA的降解或翻译抑制，从而抑制基因表达。
干扰RNA的应用具有广泛的前景，在基因沉默、基因表达调控、病毒防御等方面具有重要的意义。
RNA干扰载体的构建的实验流程
RNA干扰载体的构建的实验流程RNA干扰载体主要用来研究基因表达调控，RNA干扰技术已已被广泛用于基因结构功能研究和传染性疾病及基因治疗领域，进行RNA干扰实验首先是构建RNA干扰载体，本文以pRI 系列载体为例论述了干扰载体的构建的实验流程。
产品技术背景pRI系列载体是基于III类rna聚合酶启动子：人类H1启动子的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。
H1启动子在哺乳动物细胞内合成类似siRNA分子的小分子RNA。
由于H1启动子有精确的转录起始位点和终止信号，H1启动子转录产物精确生成人工设计的shRNA，shRNA 经过RISC剪切后形成有2个U突出末端的成熟siRNA。
由于H1启动子对转录产物长度的严格限制，基本上杜绝了非特异性干扰片段的产生，将载体转染细胞后对其它基因的影响降到最低。
pRI系列载体已经成功用于多种哺乳动物细胞进行基因的RNA干扰。
本系列中含有新霉素抗性基因的载体用于稳定表达siRNA，可以在更长时间内对基因表达抑制后的细胞功能和生理现象进行观察和分析。
插入寡核苷酸设计pRI系列载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入pRI系列载体中特定的酶切位点之间，寡核苷酸片段中包含了针对目标基因的mRNA设计的长度为19nt的干扰片段。
合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。
正、反向寡核苷酸退火后与载体连接，插入载体XhoI，BglII位点之间，位于载体上H1启动子下游正确的位置上。
连接后的载体转入哺乳动物细胞在H1启动子作用下转录产生shRNA。
1. 选择干扰序列在RNA干扰实验中，RNA干扰序列的选择会显著影响RNA干扰效果。
我们建议您按照以下几点指导原则选择RNA干扰序列：推荐长度为19 nt，采用21 nt序列也可以取得良好效果。
RNA干扰序列中不包含大于3 nt的连续相同碱基。
RNA干扰序列的GC含量为低到中等水平(推荐GC含量在35%到50%之间)。
不要将RNA干扰序列设计在已知的RNA-蛋白质结合位置附近。
请解释rna干扰的原理及应用
RNA干扰的原理及应用1. RNA干扰的原理RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种基因沉默现象，通过介导转录本的降解或抑制翻译来调节基因表达。
它首次被发现于线虫Caenorhabditis elegans 中，随后发现在多种生物中广泛存在，并在生物学研究和生物医学领域得到广泛应用。
RNA干扰包括两个重要的过程：siRNA调控和miRNA调控。
在siRNA调控中，外源性的双链小干扰RNA (siRNA)通过RISC（RNA-诱导的沉默复合体）的介导将小干扰RNA的一个链进行降解，将另一链引导到靶mRNA上，产生相应的RNAi现象。
在miRNA调控中，内源性的miRNA通过RISC的介导将靶mRNA进行降解，抑制其翻译。
2. RNA干扰的应用RNA干扰技术在生物学研究和生物医学领域有着广泛的应用，主要包括以下几个方面：2.1 功能基因组学研究通过RNA干扰技术，可以选择性地沉默某个特定基因，在细胞或生物体内进行功能研究。
通过观察沉默基因后的表型改变，可以揭示该基因在生物学过程中的功能和调控机制。
这为研究基因功能和生物途径提供了一种方便有效的方法。
2.2 新药研发RNA干扰技术可以用于筛选和鉴定关键基因，从而发现新的药物靶点。
通过沉默某些特定基因，可以评估其对细胞过程或病理过程的贡献，并筛选出具有治疗潜力的药物靶点。
此外，通过RNA干扰还可以对已知靶点进行有效的验证和确认。
2.3 治疗基因相关疾病RNA干扰技术在治疗基因相关疾病方面具有巨大的潜力。
通过针对特定疾病相关基因的RNA干扰，可以抑制目标基因的表达，从而治疗相关疾病。
例如，通过靶向HIV的RNA干扰药物已被用于治疗艾滋病。
2.4 农业生物技术RNA干扰技术在农业领域中的应用也非常广泛。
通过沉默特定的基因，可以改良植物的性状，提高产量和抗逆性。
此外，RNA干扰还可以用于抑制害虫的基因表达，从而控制害虫的数量，降低农药使用，保护环境。
RNA干扰（RNAi）实验原理与方法
RNA干扰（RNAi）实验原理与方法将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。
这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。
RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。
在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。
关键词：RNA干扰RNAi正义RNA反义RNA dsRN APTGSRISC转录后基因沉默机制RNA诱导沉默复合物近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。
这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。
一、RNAi的分子机制通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector st eps)。
在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。
证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(si RNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。
在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。
RNA干扰技术 ppt课件
2.Inhibition of translation of the target mRNA (抑制靶标mRNA的翻译),
3.Silencing the gene transcription from the target promoter (引起靶标启 动子的转录沉默).
▪ 选出合适的目标序列进行合成
▪ 并非所有符合条件的siRNA都一样有效，其原因还不 清楚，可能是位置效应的结果，因此对于一个目的基 因，一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA
设计阴性对照
▪ 通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查 结果以保证它和其他基因没有同源性。或者用 housekeeping genes 作对照.
哺乳动物细胞中的RNA干扰
大于30个核苷酸的双链RNA进入哺乳动物的成体细胞后，会非 特异的阻断基因的表达。这是由于当长的双链RNA进入哺乳动物成体 细胞后，细胞内的病毒防御机制被激活，会引起非特异的基因表达抑 制。
这种抑制是通过以下两种途径之一进行的：
A
长的dsRNA B
激活 蛋白激酶(PKR)
例如： 依赖RNA的RNA聚合酶 （RdRP）的发现 线虫中的随机降解性PCR模型
RdRP ----- 依赖RNA的RNA聚合酶
1、多种遗传学实验证实了RdRP在基因沉默中的重要作用, 其活性是基因沉默机制中不可缺少的组分。 （首先在线虫和果蝇中获证）
2、果蝇和线虫提取物中的siRNA可以作为RdRP的引物， 可以继续引导产生更多的dsRNA。这个过程成为---降解PCR （degradative PCR)
失活
翻译起始因子eIF2a
RNA干扰技术原理及应用
（5） siRNA表达框架 ） 表达框架
如果在PCR两端添加酶切位点 ， 那么通过 两端添加酶切位点， 那么通过SECs筛选 如果在 两端添加酶切位点 筛选 出的最有效的siRNA后 ， 可以直接克隆到载体中构建 出的最有效的 后 siRNA表达载体。 表达载体。 表达载体 构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的 构建好的载体可以用于稳定表达 和长效抑制的 研究。 研究。 这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。 产物很难转染到细胞中。 这个方法的主要缺点是 产物很难转染到细胞中 如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的 如果有适合的新型转染试剂能提高 的转染效率的 话 ， 那问题就可以解决了。另外，没有克隆到载体中 那问题就可以解决了。 另外， 片断并不适于大规模制备。 的PCR片断并不适于大规模制备。 片断并不适于大规模制备 最适用于： 筛选siRNA序列 ， 在克隆到载体前筛选最 序列， 最适用于 ： 筛选 序列 佳启动子； 佳启动子； 不适用于：长期抑制研究。 不适用于 ： 长期抑制研究 。 （ 如果克隆到载体后就可 以了） 。 以了）
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效 消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效 siRNA序列的步骤， 为研究人员节省时间和金钱 （ 注意 ： 序列的步骤， 序列的步骤 为研究人员节省时间和金钱（注意： 通常用RNAse III比用 比用Dicer要便宜）。 要便宜） 通常用 比用 要便宜 不过这种方法的缺点也很明显， 不过这种方法的缺点也很明显 ， 就是有可能引发非特异 的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。 的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。 现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响(1-4)。 现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响 。 最适用于： 最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型 不适用于：长时间的研究项目， 不适用于 ： 长时间的研究项目 ， 或者是需要一个特定的 siRNA进行研究，特别是基因治疗 进行研究， 进行研究
RNA干扰
RNA干扰整理者：顾中华黄明一．原理一种基因阻断技术，通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA分子，在mRNA水平关闭相应序列基因的表达或使其沉默。
RNAi发生的基本过程可分为起始阶段和效应阶段。
在起始阶段，一种称为Dicer的酶以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或由转基因、病毒感染、转座子的转录产物等方式引入的dsRNA，短的dsRNA继而形成有效复合物：RISC、RITS或miRNP。
在效应阶段，siRNA参与形成RNA诱导的沉默复合物（RISC）。
RISC以ATP依赖的方式催化双链siRNA解旋，然后利用其内部的单链siRNA，通过碱基配对识别与之互补的靶RNA，随后，RISC中的核酸内切酶在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割靶RNA，最后，切割后的靶RNA在核酸外切酶的作用下被降解掉，导致目的基因的沉默。
二．实验步骤1．siRNA分子的设计①从起始密码子开始寻找5’-AA（N19）TT序列（N代表任意的核苷酸），如果在靶基因中不存在这种序列，可以寻找5’-AA（N21）或5’-NA（N21）序列。
②如果需要在抑制内源性靶基因的表达以后再表达该基因的突变体或含有标签的融合基因，则靶位点应该选择在基因的5’或3’非编码区，以便于后续实验的进行。
③选择时应避开靶基因的内含子序列，因为RNAi作用主要发生在细胞浆中，而未拼接的mRNA分子主要位于细胞核内。
④选择GC含量比较低的序列作为siRNA（一般为40%-55%），此外，富含G的序列在细胞中易于形成高级结构而导致非特异性的反应。
⑤一般针对每个靶基因至少要设计并分析4个siRNA分子，并尽可能使这些siRNA的靶位点沿靶基因分布，以寻找有效的靶位点，提高实验的成功率。
⑥在确定了靶位点序列后，应该通过BLAST检索确保选择的siRNA分子同其他基因没有明显的同源性。
2．siRNA分子的制备（1）采用RNaseⅢ消化长片段双链RNA法①将靶基因cDNA片段按正反两个方向克隆到T7启动子的下游，并采用T7RNA体外转录试剂盒转录合成互补的两条RNA链，两条RNA链在体外互补形成双链RNA分子，纯化后备用（具体的操作方法见体外转录合成siRNA分子）②在1×Dicer反应缓冲液中加入约500ng纯化后的双链RNA和适量的r-Dicer，在37℃反应适当的时间后（通过预实验确定）加入10mmol/L EDTA终止反应，经蛋白酶K处理后，采用酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）提取。
RNA干扰技术在基因沉默中的应用
RNA干扰技术在基因沉默中的应用基因是生物体内控制遗传信息的基本单位，对于研究基因功能以及疾病的发生机制具有重要意义。
近年来，RNA干扰技术的出现为研究基因沉默提供了一种有效的手段。
本文将重点介绍RNA干扰技术在基因沉默中的应用。
一、RNA干扰技术的原理RNA干扰技术是一种通过利用外源性双链RNA介导的基因沉默现象进行研究的方法。
该技术主要分为两个步骤：首先，通过转录RNA 引导形成小干扰RNA（siRNA）；然后，siRNA与靶基因的mRNA相结合，形成RNA诱导沉默复合物（RISC），将靶基因的mRNA降解或抑制其翻译，最终达到基因沉默的效果。
二、RNA干扰技术的优势1. 高度特异性：通过设计合适的siRNA序列，可以实现对特定基因的选择性沉默，避免对其他基因的影响。
2. 高效性：RNA干扰技术可在较短的时间内达到可观察的基因沉默效果，并且对不同的生物体和细胞类型都具有较高的适用性。
3. 灵活性：通过改变siRNA的结构或序列，可以对多个基因进行同时沉默或调节。
三、RNA干扰技术在基因功能研究中的应用1. 基因沉默筛选：通过大规模筛选靶基因的方式，可以揭示基因在特定生理或病理进程中的功能，并进而识别潜在治疗靶点。
2. 基因表达调控：利用RNA干扰技术，可以对基因进行上调或下调，以研究其功能以及与其他基因的相互作用。
3. 疾病模型研究：通过沉默特定基因，可以模拟特定疾病发生机制，为疾病的研究和治疗提供有力的工具。
4. 药物研发：通过基于RNA干扰技术的高通量筛选，可发现针对特定疾病靶点的新药物，为疾病治疗提供新的方向。
四、RNA干扰技术在临床治疗中的应用前景近年来，RNA干扰技术在基因治疗、抗肿瘤治疗、抗病毒治疗等领域显示出巨大的潜力。
例如，利用siRNA沉默特定的癌基因，可以达到治疗肿瘤的效果；同时，siRNA还可以用于临床上针对病毒感染的治疗，如针对HIV、乙肝病毒的治疗等。
然而，由于RNA干扰技术在体内寿命较短、靶向性、递送等问题，目前还存在一些挑战，需要进一步完善技术。
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一、磷酸钙转染法【实验原理】磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。
磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。
该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。
【仪器、材料和试剂】（一）仪器、用具CO2培养箱、10cm细胞培养平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml锥形管、烧杯、量筒等。
（二）材料呈指数生长的真核细胞BALB/c 3T3CsCl纯化的表达质粒DNA（三）试剂1．完全培养液DMEM 90mlFCS 10ml2．2M CaCl2，过滤除菌，-20℃保存备用3．2×HEBS (g/500ml)NaCl 8.0KCl 0.38Na2HPO4.7H2O 0.19HEPES 5.0葡萄糖 1.0用NaOH调pH至6.95，过滤除菌后，-20℃保存备用。
【方法与步骤】1．在10cm的培养板上接种1×106个BALB/c 3T3细胞第二天进行转染2．准备CaPO4沉淀2.1 准备两组试管在A管中加入：15μg质粒DNA69μl 2M CaCl2460μl重蒸水在B管中加入：550μl 2×HEBS2.2 用巴斯德吸管将A管中的溶液缓慢地逐滴加入在B管中，同时用另一吸管吹打B管溶液，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。
2.3室温静置30min，出现细小颗粒沉淀。
3. 小心地将沉淀逐滴均匀地加入培养细胞的10cm平板中，轻轻晃动（此过程需尽快完成）。
4. 在5%CO2的加湿培养箱中培养细胞2-6 hr。
5. 除去培养液，加入10ml完全培养液培养细胞1-6天（依具体情况而定）。
6. 收集细胞进行基因活性的检测，或分散接种到其他培养皿中进行选择培养。
【注意事项】1．在整个转染过程中要保持无菌操作。
2．在实验中使用的各种试剂都必须小心校准，保证质量。
3．质粒DNA 需CsCl纯化，乙醇沉淀后的DNA应保持无菌，在无菌水或Tris- EDTA中溶解。
4．沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在磷酸盐溶液中加入DNA-CaCl2溶液时需用空气吹打，以确保形成尽可能细小的沉淀物，因为成团的DNA不能有效地黏附和进入细胞。
二、电穿孔和电融合技术[实验原理]当细胞置于非常高的电场中，细胞膜就变得具有通透性，能让外界的分子扩散进细胞内，这一现象称为电穿孔。
运用这一技术，许多物质，包括DNA、RNA、蛋白质、药物、抗体和荧光探针都能载入细胞。
作为一种基因转导方法，电穿孔已被广泛用于各种细胞类型，包括细菌、酵母、植物和动物细胞；而且，它还能作为注射方法（称为电注射），把各种外源物质引入活细胞。
与其他常用的导入外源物质的方法相比，电穿孔具有很多优点。
首先，不必象显微镜那样使用玻璃针，不需要技术培训和昂贵的设备，可以一次对成百万的细胞进行注射。
第二，与用化学物质相比，电穿孔几乎没有生物或化学副作用。
第三，因为电穿孔是一种物理方法，较少依赖细胞类型，因而应用广泛。
实际上，对大多数细胞类型，用电穿孔法基因的转移效率比化学方法高得多。
除了能使细胞膜具有通透性，让外界的分子扩散入胞液中以外，高强度的电场脉冲也能引起细胞融合，这一现象叫做电融合。
然而，在用电脉冲融合前必须使细胞相互紧密接触，这一电融合方法在原生质融合制取杂交植物，胚胎细胞相互融合制备动物克隆方面非常有用，尤其在制取杂交瘤细胞制备单克隆抗体方面用处很大。
几个实验室已证明使用电场电融合效率比常规的化学融合方法高10到100倍，最近，贴壁细胞的电融合还被用来研究细胞融合时细胞的骨架成分和细胞器的动力学重排。
[仪器、材料和试剂]（一）仪器：脉冲发生器，样品池：一个盛细胞的容器和两个平行的金属电极，CO2培养箱，离心机，显微镜，微量移液器，镊子，剪刀，三角瓶，吸管，毛细管，离心管等。
（二）材料：（三）试剂：穿孔介质（PM）：15mmol/L磷酸钾1mmol/L MgCl2 250mmol/L蔗糖（或甘露醇）10mmol/L HEPES调节pH 至7.3融合介质（FM）：1mmol/L MgCl2 280mmol/L甘露醇2mmol/L HEPES调节pH至7.3[方法与步骤]一．悬浮细胞的电穿孔法：1电穿孔进行基因转移电穿孔可用于将多种不同类型的分子载入活细胞中，操作步骤非常相似。
以下我们用基因转移作为例子。
载入其他的分子可按以下相同步骤进行，只需把外源DNA换页所需分子即可。
1.1使细胞在适宜的培养基中生长，用胰酶处理，收获对数生长中期的细胞，并用腺酶处理。
1.2在穿孔介质（PM）中至少洗一次。
洗细胞时，在台式离心机上1000rpm离心3分钟，使得悬浮细胞沉降。
然后，去掉上清液，在新的介质中重新悬浮细胞。
1.3计数细胞，在PM中，浓缩细胞为大约1千万细胞/ml。
1.4将DNA加到细胞悬液中，充分混合，使DNA均匀分散，用吸管吸一定体积的细胞-DNA混合液到装有电极的灭菌小样品池中。
1.5在电穿孔装置上设置输出电压和脉冲宽度（脉冲宽度是指数衰减函数的时间常数，即τ=RC，C是电容，R是样品的电阻）。
假如设备是CD脉冲型发生器，设定电容和并联电阻，以达到合适的τ值。
1.6将小池放进盛样品的池中，启动电穿孔装置，供给所需的电脉冲。
1.7电处理后，向小池加1ml普通培养基，将细胞混合液从小池转移到组织培养容器（培养皿或培养孔）中，再加入一些培养基使最终的培养基体积适量。
然后，将样品细胞放回孵育箱中使之在正常条件下生长。
1.8在测定转移基因的表达量前电穿孔细胞各自培养的时间不同。
2检测电穿孔效率和细胞存活率2.1 除用罗丹明偶联葡聚糖（1mg/ml）（分子探针）代替DNA 外，将罗丹明偶联葡聚糖引入目标细胞的方法如前所述。
2.2 电穿孔后，用培养基洗涤细胞两次，去掉胞外的荧光葡聚糖。
2.3 电穿孔后30min，向细胞悬液中加30μl台盼蓝，孵育2min，然后用培养基洗涤。
2.4 在1000rpm下离心3min，收集细胞，将细胞重悬于PM 中，终体积100μl。
2.5 将一滴细胞液（30μl）置于干净载玻片上，用盖玻片盖好，在显微镜下检测细胞，测定摄取荧光标记葡聚糖的百分数。
2.6 在亮视野镜片下，死细胞可因染成蓝色检测出（摄取了台盼蓝），测定细胞存活的百分数。
2.7 在各种电场设定值下重复实验，画出摄取葡聚糖率和细胞存活率对电穿孔参数的曲线。
这一曲线就将显示对特定细胞类型电穿孔的最优条件。
二．悬浮生长细胞的电融合融合悬浮细胞的步骤与电穿孔的很类似，只是在进行高强度的电场脉冲前后，必须用低幅、高频电场使细胞排成一条链。
1 用融合介质（FM）洗悬浮细胞两次，然后悬于FM中。
洗涤细胞时，在台式离心机上1000rpm下离心3分钟，得到细胞沉淀，弃去上清液将细胞悬于新鲜FM介质中。
2 将悬浮细胞转移到相应的融合室内。
假如要使两种不同的细胞彼此融合，转移前要充分混合。
3 启动介电电泳场，其振幅通常小于200V/cm，频率在2MHz 以内，用显微镜检测细胞是否排成一条链，调节振幅和频率以达到最佳效果。
4 让介电电泳场开约1分钟后关掉，立即应用融合脉冲，其振幅数量级为1kV/cm。
脉冲宽度小于1ms。
在进行融合脉冲后立即再次启动介电电泳场，常规让其开启约2分钟。
5 关掉介电电泳场，让细胞在样品池中静置10分钟。
6 去掉FM，用普通培养基再次洗涤细胞。
7 将细胞转移到培养皿，加入普通培养基，在培养箱一般条件下培养。
[注意事项]1 最优组分依使用的特定细胞种类而有明显的变化。
如果努力优化电压和脉冲宽度电穿孔结果仍不令人满意，就应尝试改变穿孔介质。
2 影响电穿孔/电融合的另一重要因素与细胞状态有关，为达到最高效率，必须收集对数生长中期的细胞。
1.纯化siRNA在转染前要确认siRNA的大小和纯度。
为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。
注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE 胶纯化）。
2.避免RNA酶污染微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。
由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。
3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性通常，健康的细胞转染效率较高。
此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。
为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。
4.避免使用抗生素抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。
有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。
这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。
5.选择合适的转染试剂针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。
6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。
将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞（同样适合实验靶siRNA），转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。
过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。
7.通过标记siRNA来优化实验荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。
标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。
RNAi研究的一般技术路线是：。