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荧光显微镜的基本原理及应用PPT课件
个性化定制
未来荧光显微镜的发展将更加注重个性化定制，根据不同 领域和不同需求，定制特定的光学系统和成像方案，以满 足不同用户的需求。
06 参考文献
参考文献
参考文献1
介绍荧光显微镜的基本原 理，包括激发光、发射光 和滤色片的原理和作用。
参考文献2
介绍荧光显微镜的应用， 包括生物学、医学、化学 等领域的应用案例和效果。
荧光显微镜的基本原 理及应用ppt课件
目录
CONTENTS
• 荧光显微镜简介 • 荧光显微镜的基本原理 • 荧光显微镜的应用 • 荧光显微镜的优缺点 • 荧光显微镜的发展趋势与未来展望 • 参考文献
01 荧光显微镜简介
荧光显微镜的发展历程
01
02
03
荧光显微镜的起源
19世纪末，科学家开始研 究荧光现象，并尝试将其 应用于显微镜中。
多色观察
荧光显微镜可以同时观察多个 荧光标记物的表达，通过不同 的荧光颜色来区分不同的标记 物。
非破坏性
荧光显微镜观察样本时不会对 样本造成破坏，因此可以观察
同一样本的不同层面。
缺点
01
02
03
04
光毒性
荧光显微镜需要使用高强度光 源来激发荧光，长时间观察会
对样本造成光毒性损伤。
光漂白
荧光标记物在受到高强度激发 光照射时容易发生光漂白，导
环境化学
荧光显微镜用于检测环境中的有害物 质和污染物。例如，利用荧光标记的 探针检测水体中的重金属离子或有机 污染物。
04 荧光显微镜的优缺点
优点
高灵敏度
荧光显微镜能够检测到非常微 弱的荧光信号，因此可以用于
观察低浓度的荧光标记物。
高对比度
荧光显微镜能够通过选择合适 的激发和发射波长，获得高对 比度的荧光图像。
未来荧光显微镜的发展将更加注重个性化定制，根据不同 领域和不同需求，定制特定的光学系统和成像方案，以满 足不同用户的需求。
06 参考文献
参考文献
参考文献1
介绍荧光显微镜的基本原 理，包括激发光、发射光 和滤色片的原理和作用。
参考文献2
介绍荧光显微镜的应用， 包括生物学、医学、化学 等领域的应用案例和效果。
荧光显微镜的基本原 理及应用ppt课件
目录
CONTENTS
• 荧光显微镜简介 • 荧光显微镜的基本原理 • 荧光显微镜的应用 • 荧光显微镜的优缺点 • 荧光显微镜的发展趋势与未来展望 • 参考文献
01 荧光显微镜简介
荧光显微镜的发展历程
01
02
03
荧光显微镜的起源
19世纪末，科学家开始研 究荧光现象，并尝试将其 应用于显微镜中。
多色观察
荧光显微镜可以同时观察多个 荧光标记物的表达，通过不同 的荧光颜色来区分不同的标记 物。
非破坏性
荧光显微镜观察样本时不会对 样本造成破坏，因此可以观察
同一样本的不同层面。
缺点
01
02
03
04
光毒性
荧光显微镜需要使用高强度光 源来激发荧光，长时间观察会
对样本造成光毒性损伤。
光漂白
荧光标记物在受到高强度激发 光照射时容易发生光漂白，导
环境化学
荧光显微镜用于检测环境中的有害物 质和污染物。例如，利用荧光标记的 探针检测水体中的重金属离子或有机 污染物。
04 荧光显微镜的优缺点
优点
高灵敏度
荧光显微镜能够检测到非常微 弱的荧光信号，因此可以用于
观察低浓度的荧光标记物。
高对比度
荧光显微镜能够通过选择合适 的激发和发射波长，获得高对 比度的荧光图像。
荧光显微镜分析课件
染色体染色实验
总结词
通过荧光染色技术，观察染色体的结构和数目。
详细描述
采用荧光染料对染色体进行染色，在荧光显微镜下观察染色体的形态、数目和分布，可用于研究染色 体变异、基因定位和遗传疾病等。
荧光原位杂交实验
总结词
通过荧光原位杂交技术，检测特定基因 在染色体上的位置。
VS
详细描述
利用荧光标记的探针与染色体上的特定基 因进行杂交，在荧光显微镜下观察杂交信 号的位置和强度，可用于基因定位、染色 体变异分析和遗传疾病诊断等。
荧光显微镜分析课件
目录 CONTENTS
• 荧光显微镜简介 • 荧光显微镜的基本原理 • 荧光显微镜的操作方法 • 荧光显微镜的实验技术 • 荧光显微镜的实验案例
01
荧光显微镜简介
定义与特点
定义
荧光显微镜是一种利用特定波长 的光激发细胞内或组织内的荧光 物质，从而观察细胞或组织的结 构和功能的显微镜。
重要意义。
05
荧光显微镜的实验案例
细胞核染色实验
总结词
通过荧光染色技术，观察细胞核的结构和分布。
详细描述
采用荧光染料对细胞核进行染色，在荧光显微镜下观察细胞核的形态、大小、分 布以及染色质结构，可用于研究细胞分裂、基因表达和疾病诊断等。
线粒体染色实验
总结词
通过荧光染色技术，观察线粒体的结 构和功能。
荧光共定位技术
荧光共定位技术是一种利用两种或多种 荧光染料标记细胞内不同组分，通过观 察它们的空间位置关系来研究细胞结构
和功能的技术。
通过高分辨率的荧光显微镜观察，可以 清晰地看到不同组分在细胞内的具体位
置和相互关系。
荧光共定位技术广泛应用于生物学、医 学和化学等领域，对于研究细胞内分子 相互作用和细胞生物学特性等方面具有
荧光显微镜的原理和使用方法课件
荧光显微镜的原理和使用方法课 件
目录
• 荧光显微镜简介 • 荧光显微镜的原理 • 荧光显微镜的使用方法 • 荧光显微镜的维护与保养 • 荧光显微镜的应用实例
01
荧光显微镜简介
荧光显微镜的发展历程
01
02
03
荧光显微镜的起源
19世纪末，随着光学和化 学的发展，荧光显微镜开 始出现。
荧光显微镜的发展
荧光灯泡表面不可直接触摸，清洁时 应使用软布或手套。
清洁载物台
用干燥的软布擦拭载物台，避免污渍 和划痕。
荧光灯泡的更换与保养
更换荧光灯泡
当荧光灯泡亮度降低或出现闪烁时，应更换荧光灯泡。更换时应关闭电源，并按照说明书正确操作。
保养荧光灯泡
荧光灯泡应在低电流下使用，避免频繁开关灯，以延长使用寿命。
常见故障排除与维修
20世纪初，荧光显微镜技 术逐渐成熟，并广泛应用 于生物学、医学等领域。
荧光显微镜的改进
随着科技的进步，现代荧 光显微镜在分辨率、成像 质量、自动化等方面不断 得到提升。
荧光显微镜的基本组成
光源
发出特定波长的光，激 发样品中的荧光物质。
滤色片
选择性地透过特定波长 的光，阻挡其他波长的
光。
物镜
将样品中的荧光图像放 大，并传递给目镜或摄
电源故障
检查电源插头是否松动，电源线 是否破损。如有问题，应更换电
源线或修理电源插座。
图像模糊
可能是镜头污染或载物台移动造成 的。应清洁镜头和载物台，确保其 表面干净无痕。
荧光灯泡不亮
可能是灯泡损坏或电路故障。应检 查灯泡是否正常，如有问题应更换 ；同时检查电路是否正常，如有故 障应及时维修。
05
荧光显微镜的调试
目录
• 荧光显微镜简介 • 荧光显微镜的原理 • 荧光显微镜的使用方法 • 荧光显微镜的维护与保养 • 荧光显微镜的应用实例
01
荧光显微镜简介
荧光显微镜的发展历程
01
02
03
荧光显微镜的起源
19世纪末，随着光学和化 学的发展，荧光显微镜开 始出现。
荧光显微镜的发展
荧光灯泡表面不可直接触摸，清洁时 应使用软布或手套。
清洁载物台
用干燥的软布擦拭载物台，避免污渍 和划痕。
荧光灯泡的更换与保养
更换荧光灯泡
当荧光灯泡亮度降低或出现闪烁时，应更换荧光灯泡。更换时应关闭电源，并按照说明书正确操作。
保养荧光灯泡
荧光灯泡应在低电流下使用，避免频繁开关灯，以延长使用寿命。
常见故障排除与维修
20世纪初，荧光显微镜技 术逐渐成熟，并广泛应用 于生物学、医学等领域。
荧光显微镜的改进
随着科技的进步，现代荧 光显微镜在分辨率、成像 质量、自动化等方面不断 得到提升。
荧光显微镜的基本组成
光源
发出特定波长的光，激 发样品中的荧光物质。
滤色片
选择性地透过特定波长 的光，阻挡其他波长的
光。
物镜
将样品中的荧光图像放 大，并传递给目镜或摄
电源故障
检查电源插头是否松动，电源线 是否破损。如有问题，应更换电
源线或修理电源插座。
图像模糊
可能是镜头污染或载物台移动造成 的。应清洁镜头和载物台，确保其 表面干净无痕。
荧光灯泡不亮
可能是灯泡损坏或电路故障。应检 查灯泡是否正常，如有问题应更换 ；同时检查电路是否正常，如有故 障应及时维修。
05
荧光显微镜的调试
实验荧光显微镜的使用演示文稿
现在是28页\一共有51页\编辑于星期六
现在是29页\一共有51页\编辑于星期六
反射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
分色镜 物镜
标本
现在是30页\一共有51页\编辑于星期六
汞灯
激发滤色镜
反射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜
紫外线 保护罩
激发滤色镜 孔径光栏（FS） 视场光栏（AS）
分色镜
汞灯
现在是31页\一共有51页\编辑于星期六
荧光素的特性
荧光素
激发波长 发射波长
DAPI
372
456
AMC A
350
450
Hoe chst 33258
365
465
FITC
490
520
Acridine O range 4 9 0
590
Acridine Ye llow
470
550
C Y3
552
565
TRITC
541
572
Propidium Iodide 5 3 0
转变为高能状态，再回到低能状态时释放出 的光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
现在是10页\一共有51页\编辑于星期六
荧光的性质
保持固有的荧光特性
n荧光波长＞激发波长
n荧光强度极小于激发光的强度
n有不同程度的衰减 n荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效 率
现在是11页\一共有51页\编辑于星期六
暗场聚光镜
现在是6页\一共有51页\编辑于星期六
汞灯箱
激发滤色镜
透射荧光显微镜原理
目镜
透射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
物镜
暗场聚光镜
现在是29页\一共有51页\编辑于星期六
反射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
分色镜 物镜
标本
现在是30页\一共有51页\编辑于星期六
汞灯
激发滤色镜
反射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜
紫外线 保护罩
激发滤色镜 孔径光栏（FS） 视场光栏（AS）
分色镜
汞灯
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荧光素的特性
荧光素
激发波长 发射波长
DAPI
372
456
AMC A
350
450
Hoe chst 33258
365
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FITC
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Acridine O range 4 9 0
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Acridine Ye llow
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C Y3
552
565
TRITC
541
572
Propidium Iodide 5 3 0
转变为高能状态，再回到低能状态时释放出 的光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光。
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荧光的性质
保持固有的荧光特性
n荧光波长＞激发波长
n荧光强度极小于激发光的强度
n有不同程度的衰减 n荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效 率
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暗场聚光镜
现在是6页\一共有51页\编辑于星期六
汞灯箱
激发滤色镜
透射荧光显微镜原理
目镜
透射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
物镜
暗场聚光镜
相差显微镜和荧光显微镜使用教程PPT课件
每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出 较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性， 一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在 物镜后面需加阻断滤光片。它的作用有二：一是 吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损 伤眼睛。二是选择并让特异的荧光透过，表现出 专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。
换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不 同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配 的环状光阑。
10
相 差 调 节
11
2.4用途 用于观察组织培养中活细胞形态结构。 活细胞无色透明，一般光镜下不易分辨 细胞轮廓及其结构，组织培养研究常用 的是倒置相差显微镜。
12
二、荧光显微镜
一、原理 荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过
滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫 蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质 发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜 的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使 荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结 构和功能以及化学成分等的研究。 荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一 些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻 断滤片等)的基础上组成的。
特殊生物显微镜的原理与 使用
南昌大学生命科学学院
1
2
主要内容
相差显微镜 荧光显微镜
3
相差显微镜
2.1 原理 光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在
某一时间上光的波动所能达到的位置)的不同。 当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的
眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到 染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标本， 因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光 波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变 化(相应发生的差异即相位差)，而这种微小的变化， 人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观 察到。
换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不 同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配 的环状光阑。
10
相 差 调 节
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2.4用途 用于观察组织培养中活细胞形态结构。 活细胞无色透明，一般光镜下不易分辨 细胞轮廓及其结构，组织培养研究常用 的是倒置相差显微镜。
12
二、荧光显微镜
一、原理 荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过
滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫 蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质 发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜 的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使 荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结 构和功能以及化学成分等的研究。 荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一 些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻 断滤片等)的基础上组成的。
特殊生物显微镜的原理与 使用
南昌大学生命科学学院
1
2
主要内容
相差显微镜 荧光显微镜
3
相差显微镜
2.1 原理 光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在
某一时间上光的波动所能达到的位置)的不同。 当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的
眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到 染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标本， 因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光 波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变 化(相应发生的差异即相位差)，而这种微小的变化， 人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观 察到。
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细胞生物学实验
任课教师：齐云峰
1
实验二
荧光显微镜的使用
Page 2
实验目的
掌握荧光显微镜的结构、原理 及其使用方法。
Page 3
实验用品 荧光显微镜及荧光装置附件。 人口腔上皮细胞装片，植物茎部组 织装片。
Page 4
实验原理
荧光显微镜是一种较为常用的光学显微镜。它 是由光源、滤色镜系统和光学系统等主要部件组成 。
由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因 此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发 生爆炸时造成操作。
Page 18
二、滤色镜系统
滤色镜按用途或功能，主要分为两类： 1、激发滤色镜（exciter filter）
对于光源发出的混合光，选择透过能使标本产 生荧光的特定波长的光，同时阻挡对激发荧光无关的 光。
口腔上皮细胞
Page 40
口腔上皮细胞 荧光
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松树茎部横切面
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松树茎部横切面 荧光
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松树茎部横切面
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松树茎部横切面 荧光
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向日葵茎部横切
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向日葵茎部横切 荧光
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头发
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头发 荧光
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它将激发荧光用的光源改在物镜的上方， 光由物镜上方经反光镜射入物镜去激发样品， 从样品上被激发的荧光经物镜成像并穿透反光 镜而由目镜观察。
Page 32
2．反射式荧光显微镜
如换用不同的激发滤片／双色束分 离器／阻断滤片的组合插块，可满足不 同荧光反应产物的需要。
此种荧光显微镜的优点是视野照明 均匀,成像清晰,放大倍数愈大荧光愈强 。
Page 36
荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：
1. 照明方式通常为落射式，即光源通过物镜 投射于样品上；
2. 光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通 显微镜；
3. 有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可 见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护 人眼。
Page 38
荧光素的特性
荧光素
激发波长 发射波长
五、注意事项
1. 荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观察。 2. 使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激
发光源，保护眼睛。
Page 50
实验报告
实验目的 实验用品 实验原理（荧光显微镜的原理） 实验方法（荧光显微镜的操作方法） 思考题
Page 51
六、思考题
1、什么是荧光？它是怎样发生的？ 2、荧光显微镜为什么要以汞灯为光源？ 3、激发滤色镜和阻断滤色镜的功能及区别？ 4、描述样品在荧光显微镜下与光学显微镜下
DAPI
372
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AMC A
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Hoe chst 33258
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Acridine O range 4 9 0
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Acridine Ye llow
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C Y3
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不过有的滤镜也可以透光分界波长命名，如K530，就 是表示阻挡波长530nm以下的光而透过530nm以上的光。还有 的厂家的滤镜完全以数字命名，如美国Corning厂的NO.5-58 ，即相当于BG12。
Page 21
二、滤色镜系统
3、二向色镜（DM）
二向色镜位于汞灯激发滤色镜构成的平行光轴与目镜 和物镜构成的竖直光轴的两轴垂直相交处,斜向安装于光路之中 。与照明光路成45°角，承担色光的分流作用。
Page 20
二、滤色镜系统
滤镜一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后 面字母代表玻璃，数字代表型号特点。
如德国产品（Schott）BG12，就是种蓝色玻璃，B是 蓝色的第一个字母，G是玻璃的第一个字母；
我国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于 BG12的蓝色滤镜名为QB24，Q是青色（蓝色）拼音的第一个 字母，B是玻璃拼音的第一个字母。
Page 9
什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能 状态转变为高能状态，再回到低能状态 时释放出的光。 即：物质吸收短波光，发射出的长波光 。
Page 10
荧光的性质
保持固有的荧光特性 荧光波长＞激发波长 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、 荧光效率
尼康所提供的滤光块种类很多，按客户要求选 择配套。
Page 23
三、荧光显微镜的光路 荧光显微镜按激发光对样品的激发方向
或方式，分有两种： 1．透射式荧光显微镜 2．反射式（落射式）荧光显微镜
Page 24
1．透射式荧光显微镜
激发光束通过聚光器穿过标本材料来激发荧 光的，诱发的荧光从物镜前方进入物镜。这是比较 旧式的荧光显微镜。
观察效果的差异。
Page 52
二向色镜对激发光波长的光（即透过激发滤光片的光） ，有很高的反射率。
而对由标本发出的荧光波长区的光，则有很高的透射率 ，即二色向镜起着反射激发光和透过荧光的重要作用。
Page 22
二、滤色镜系统
一个滤光镜系统（即一个滤光块）由激发滤色 镜、二向色镜、阻挡滤色镜（三部分组成。
通过以上激发滤光片、二向色镜、阻挡滤光片 的相应组合，可以形成多种不同的激发方法，如紫 外（UV）、紫（V） 、兰（B）和绿（G）等（这些 名称是以激发光主波长的颜色而定的）。
汞灯能以最小的表面发出最大数量的紫外光和蓝光 ，且光亮度大，光度稳定。它是用石英玻璃制作，中间呈 球形，有两个钨电极，内充一定数量的汞和少量氩氖混合 气体。
Page 15
一、光源
工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气 压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气 压力，这一过程一般约需5～15min。
其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进 行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样 品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。
Page 5
透射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 暗场聚光镜
汞灯箱
激发滤色镜
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透射荧光显微镜原理
目镜
透射荧光显微镜原理
物镜
吸收滤色镜 暗场聚光镜
激发滤色镜
汞灯
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荧光染料均有一定的吸收光谱（激发峰值）， 利用滤色镜对光线选择吸收的能力，选用其透射光谱 ，恰为荧光染料的最大吸收光谱（激发峰值）的激发 滤色镜，以便从汞灯发出的广谱光波中，选择透过最 宜波段的光线供用。
Page 19
二、滤色镜系统
2、阻挡滤色镜（barrier filter） 阻挡滤色镜是用来阻挡掉没有被标本吸收的激 发光和某些波长较短的光线以及没有被选择透过的荧 光，以防伤害眼睛。 阻挡滤色镜的选用，应视荧光染料的荧光光谱 而定，要能够最大限度的透过所需荧光并阻断短波光 以及不需要波长的荧光。
Page 35
四、荧光显微镜使用方法
3.用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调 整光源中心,使其位于整个照明光斑中央。
4.放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意： 未装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼损伤； 用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊油镜； 高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启 动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。
反射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
分色镜 物镜 标本
汞灯
激发滤色镜
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实验原理
某些物质经波长较短的光照射后，分子被激 活,吸收能量后呈激发态。
其能量部分转化为热能或用于光化学反应外 ，相当一部分则以波长较长的光能形式辐射出来， 这种波长长于激发光的可见光称为荧光。
荧光显微镜是利用一定波长的光激发标本发 射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧 光图像。
Page 33
透射式
落射式
Page 34
四、荧光显微镜使用方法
1．打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最 亮点。
2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所 要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻 断滤片。 落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要 求的激发滤片／二向色镜／阻断滤片的插块。
Page 11
荧光光源的作用 荧光光源不是作为照明的，而是 作为荧光色素产生荧光的激发光 。
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实验原理
荧光有两种类型，一种是标本自身的原有荧光（自发 荧光），另一种是利用荧光色素和细胞的特定部分反应所产 生的荧光（次生荧光）。
自发荧光：在生物的某些组织中，经紫外线照射后能 直接发射出荧光的称为自发荧光（或直接荧光）。如植物组 织中的叶绿素，经紫外线照射后，即可发出红色荧光。
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反射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
分色镜 物镜 标本
汞灯
激发滤色镜
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反射荧光显微镜的构造
紫外线 保护罩
吸收滤色镜 激发滤色镜
孔径光栏（FS） 视场光栏（AS）
分色镜 汞 灯
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反射式荧光显微镜原理
落射光激发的荧光法是近代显微镜检术中 新发展出来的一种强有力的反差增强法。
超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解 离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和 蓝紫光，足以激发各类荧光物质。
超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良 好的散热条件，工作环境温度不宜太高。
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一、光源
200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的 情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命 愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。
任课教师：齐云峰
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实验二
荧光显微镜的使用
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实验目的
掌握荧光显微镜的结构、原理 及其使用方法。
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实验用品 荧光显微镜及荧光装置附件。 人口腔上皮细胞装片，植物茎部组 织装片。
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实验原理
荧光显微镜是一种较为常用的光学显微镜。它 是由光源、滤色镜系统和光学系统等主要部件组成 。
由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因 此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发 生爆炸时造成操作。
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二、滤色镜系统
滤色镜按用途或功能，主要分为两类： 1、激发滤色镜（exciter filter）
对于光源发出的混合光，选择透过能使标本产 生荧光的特定波长的光，同时阻挡对激发荧光无关的 光。
口腔上皮细胞
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口腔上皮细胞 荧光
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松树茎部横切面
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松树茎部横切面 荧光
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松树茎部横切面
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松树茎部横切面 荧光
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向日葵茎部横切
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向日葵茎部横切 荧光
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头发
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头发 荧光
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它将激发荧光用的光源改在物镜的上方， 光由物镜上方经反光镜射入物镜去激发样品， 从样品上被激发的荧光经物镜成像并穿透反光 镜而由目镜观察。
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2．反射式荧光显微镜
如换用不同的激发滤片／双色束分 离器／阻断滤片的组合插块，可满足不 同荧光反应产物的需要。
此种荧光显微镜的优点是视野照明 均匀,成像清晰,放大倍数愈大荧光愈强 。
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荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：
1. 照明方式通常为落射式，即光源通过物镜 投射于样品上；
2. 光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通 显微镜；
3. 有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可 见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护 人眼。
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荧光素的特性
荧光素
激发波长 发射波长
五、注意事项
1. 荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观察。 2. 使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激
发光源，保护眼睛。
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实验报告
实验目的 实验用品 实验原理（荧光显微镜的原理） 实验方法（荧光显微镜的操作方法） 思考题
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六、思考题
1、什么是荧光？它是怎样发生的？ 2、荧光显微镜为什么要以汞灯为光源？ 3、激发滤色镜和阻断滤色镜的功能及区别？ 4、描述样品在荧光显微镜下与光学显微镜下
DAPI
372
456
AMC A
350
450
Hoe chst 33258
365
465
FITC
490
520
Acridine O range 4 9 0
590
Acridine Ye llow
470
550
C Y3
552
565
TRITC
541
572
Propidium Iodide 5 3 0
615
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不过有的滤镜也可以透光分界波长命名，如K530，就 是表示阻挡波长530nm以下的光而透过530nm以上的光。还有 的厂家的滤镜完全以数字命名，如美国Corning厂的NO.5-58 ，即相当于BG12。
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二、滤色镜系统
3、二向色镜（DM）
二向色镜位于汞灯激发滤色镜构成的平行光轴与目镜 和物镜构成的竖直光轴的两轴垂直相交处,斜向安装于光路之中 。与照明光路成45°角，承担色光的分流作用。
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二、滤色镜系统
滤镜一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后 面字母代表玻璃，数字代表型号特点。
如德国产品（Schott）BG12，就是种蓝色玻璃，B是 蓝色的第一个字母，G是玻璃的第一个字母；
我国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于 BG12的蓝色滤镜名为QB24，Q是青色（蓝色）拼音的第一个 字母，B是玻璃拼音的第一个字母。
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什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能 状态转变为高能状态，再回到低能状态 时释放出的光。 即：物质吸收短波光，发射出的长波光 。
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荧光的性质
保持固有的荧光特性 荧光波长＞激发波长 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、 荧光效率
尼康所提供的滤光块种类很多，按客户要求选 择配套。
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三、荧光显微镜的光路 荧光显微镜按激发光对样品的激发方向
或方式，分有两种： 1．透射式荧光显微镜 2．反射式（落射式）荧光显微镜
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1．透射式荧光显微镜
激发光束通过聚光器穿过标本材料来激发荧 光的，诱发的荧光从物镜前方进入物镜。这是比较 旧式的荧光显微镜。
观察效果的差异。
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二向色镜对激发光波长的光（即透过激发滤光片的光） ，有很高的反射率。
而对由标本发出的荧光波长区的光，则有很高的透射率 ，即二色向镜起着反射激发光和透过荧光的重要作用。
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二、滤色镜系统
一个滤光镜系统（即一个滤光块）由激发滤色 镜、二向色镜、阻挡滤色镜（三部分组成。
通过以上激发滤光片、二向色镜、阻挡滤光片 的相应组合，可以形成多种不同的激发方法，如紫 外（UV）、紫（V） 、兰（B）和绿（G）等（这些 名称是以激发光主波长的颜色而定的）。
汞灯能以最小的表面发出最大数量的紫外光和蓝光 ，且光亮度大，光度稳定。它是用石英玻璃制作，中间呈 球形，有两个钨电极，内充一定数量的汞和少量氩氖混合 气体。
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一、光源
工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气 压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气 压力，这一过程一般约需5～15min。
其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进 行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样 品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。
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透射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 暗场聚光镜
汞灯箱
激发滤色镜
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透射荧光显微镜原理
目镜
透射荧光显微镜原理
物镜
吸收滤色镜 暗场聚光镜
激发滤色镜
汞灯
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荧光染料均有一定的吸收光谱（激发峰值）， 利用滤色镜对光线选择吸收的能力，选用其透射光谱 ，恰为荧光染料的最大吸收光谱（激发峰值）的激发 滤色镜，以便从汞灯发出的广谱光波中，选择透过最 宜波段的光线供用。
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二、滤色镜系统
2、阻挡滤色镜（barrier filter） 阻挡滤色镜是用来阻挡掉没有被标本吸收的激 发光和某些波长较短的光线以及没有被选择透过的荧 光，以防伤害眼睛。 阻挡滤色镜的选用，应视荧光染料的荧光光谱 而定，要能够最大限度的透过所需荧光并阻断短波光 以及不需要波长的荧光。
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四、荧光显微镜使用方法
3.用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调 整光源中心,使其位于整个照明光斑中央。
4.放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意： 未装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼损伤； 用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊油镜； 高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启 动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。
反射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
分色镜 物镜 标本
汞灯
激发滤色镜
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实验原理
某些物质经波长较短的光照射后，分子被激 活,吸收能量后呈激发态。
其能量部分转化为热能或用于光化学反应外 ，相当一部分则以波长较长的光能形式辐射出来， 这种波长长于激发光的可见光称为荧光。
荧光显微镜是利用一定波长的光激发标本发 射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧 光图像。
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透射式
落射式
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四、荧光显微镜使用方法
1．打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最 亮点。
2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所 要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻 断滤片。 落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要 求的激发滤片／二向色镜／阻断滤片的插块。
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荧光光源的作用 荧光光源不是作为照明的，而是 作为荧光色素产生荧光的激发光 。
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实验原理
荧光有两种类型，一种是标本自身的原有荧光（自发 荧光），另一种是利用荧光色素和细胞的特定部分反应所产 生的荧光（次生荧光）。
自发荧光：在生物的某些组织中，经紫外线照射后能 直接发射出荧光的称为自发荧光（或直接荧光）。如植物组 织中的叶绿素，经紫外线照射后，即可发出红色荧光。
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反射荧光显微镜原理
吸收滤色镜
分色镜 物镜 标本
汞灯
激发滤色镜
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反射荧光显微镜的构造
紫外线 保护罩
吸收滤色镜 激发滤色镜
孔径光栏（FS） 视场光栏（AS）
分色镜 汞 灯
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反射式荧光显微镜原理
落射光激发的荧光法是近代显微镜检术中 新发展出来的一种强有力的反差增强法。
超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解 离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和 蓝紫光，足以激发各类荧光物质。
超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良 好的散热条件，工作环境温度不宜太高。
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一、光源
200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的 情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命 愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。