最新基因敲除小鼠的构建_图文.ppt
建立基因敲除小鼠颈动脉粥样硬化模型ppt课件
ELK
injured
EK
Mean Intimal and Medial Cross-sectional Areas
of EK and ELK Mice 8 Weeks after Injury
10
8
*
EK
ELK
6
Mean Area(um2X104)
4
**
2
0
media intimal
carotid artery counterstained with ORO and haematoxylin
noninjured
ELK
injured
EK
lipid deposit after carotid artery injury by FeCl3 for 8 weeks
carotid artery counterstained with ORO and haematoxylin
Future Works
PAI-1↑
？ LPL↓ ？
Other
？Pathways
Neointima formation↑
Thank You！
118.3±7.91
64.54±6.10
109.7±4.46
EK (n=3)
85.19±17.74 61.61±3.14 109.53±2.90P value0.190.68
0.98
Animal Body Weight of ELK and EK Mice Fed HCC
30
NS NS
ELK
NS
EK
carotid artery stained with H&E
noninjured
敲除鼠的构建
如何设计条件性基因敲除小鼠模型摘要：小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可谓是“生命科学的好帮手”。
很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家参考。
小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可谓是“生命科学的好帮手”。
很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家参考。
条件性基因敲除小鼠的设计利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。
它们都是位点特异性重组酶系统。
这里以Cre/LoxP系统为例。
比如在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。
将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre 的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。
此外，若与控制Cre表达的其他诱导系统(比如CreERT2)相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。
Cre/loxP系统来源于噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两个组成成分：一个是一段长34bp的DNA序列(LoxP序列)，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
LoxP的方向由中间这8个碱基决定。
这段LoxP序列是Cre重组酶识别的位点。
令一个组成部分是Cre重组酶。
它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成的蛋白。
Cre可以介导两个LoxP位点的重组，从而引起两个LoxP之间DNA序列的缺失。
如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下，可以得到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠，也叫Cre工具小鼠。
跟Flox小鼠交配之后，可以得到条件性基因敲除小鼠。
所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列。
这段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。
这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。
建立基因敲除小鼠颈动脉粥样硬化模型(英文)PPT课件-27页精选文档
ELK
injured
EK
lipid deposit after carotid artery injury by FeCl3 for 8 weeks
carotid artery stained with ORO
noninjured
ELK
injured
EK
lipid deposit after carotid artery injury by FeCl3 for 8 weeks
noninjured
ELK
injured
EK
Mean Intimal and Medial Cross-sectional Areas
of EK and ELK Mice 8 Weeks after Injury
10
8
*
EK
ELK
6
Mean Area(um2X104)
4
**
2
0
media intimal
61.61±3.14 0.0015
85.07±9.40 0.0016
The Plasma Total Cholesterol Levels of ELK and*EK Mice Fed HCC
1000
*
ELK
EK
750
NS
500
TC concentration(mg/dl)
250
0 ELK-0wk EK-0wkELK-4wksEK-4wksELK-8wksEK-8wks
carotid artery stained with H&E
ELK
EK
lipid deposit after carotid artery injury by FeCl3 for 4 weeks
基因敲除小鼠技术专题
oCassette替换掉。这样的小鼠其全身所有的组 织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除 鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理
的影响，而且这个基因没有胚
胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（ConditionalKnockout）
条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个 loxP位点放到目的基因一个或几个
DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲 除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异 性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载
体导入到胚胎干细胞后外源的重组载
体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组， 如图1所示：
图2.基因敲除鼠制作过程示意图 1、Knockout载体设计与构建 根据研究项目具体情况和要求
胞注入特定品系小鼠囊胚中，然后将囊胚移植到 假孕的小鼠子宫中。待后代小鼠出生后，通过小 鼠的毛色中来源于ES细胞毛色的比例判断嵌合程
度的高低，以及该小鼠的后代中可能
获得生殖系传递能力。 4、由嵌合体小鼠繁殖出生殖遗传系Knockout小
鼠
将嵌合体小鼠与适当品系的小鼠交配，后代小鼠 出生后，通过PCR方式检测小鼠是否含有
蛋白，从而达到靶向操作内源性
基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目 标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影 响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使
基因操作变得更加简单方便。然而
重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠 杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织 特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特
定的组织或细胞中敲除该基因，而
该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有 胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组
Slug基因敲除小鼠模型的建立
Slug基因敲除小鼠模型的建立陈栋1 焦学龙1 高学军1 王磊2 石宝昌2 崔海宁2（1青岛大学医学院附属医院普外科山东青岛 266003）（2海南医学院附属医院普外科海南海口 517010）放射性肠道损伤是放、化疗治疗腹部及盆部肿瘤病人的常见并发症，肠道干细胞凋亡是导致损伤的主要原因[1-2]。
Slug是转录因子家族中编码锌指蛋白的基因，具有凋亡抑制作用，可保护细胞免受细胞毒性损伤[3]。
我们前期的研究发现，Slug过表达能保护体外IEC6细胞免于射线损伤[4]，但Slug敲除后能否促进体外、体内肠道干细胞损伤还不明确。
为研究Slug对放射性肠道损伤的作用，本研究首先建立Slug基因敲除小鼠模型，旨在为今后的研究做准备，也为放射性肠道损伤的预防治疗提供新思路。
1. 材料和方法1.1主要材料Slug基因敲除打靶载体由上海南方模式生物研究中心构建，各种限制性内切酶、T4、DNA连接酶、Taq酶及PCR试剂等购自TaKaRa及NEB公司，DNA marker购自晶美生物工程公司，质粒抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司。
细胞培养所需试剂为Invitrogen公司产品。
引物合成和测序由上海英骏生物技术有限公司完成。
ES细胞株Tc-1由美国国立卫生研究院的王中向博士惠赠。
C57BL/6J小鼠由南方生物模式研究中心提供。
鼠尾基因组DNA裂解液，PCR相关试剂，Southern印迹相关试剂购自TaKaRa公司。
[α-32P]dATP购自亚辉公司，硝酸纤维素膜购自S&S公司。
1.2 小鼠胚胎的获取与处理引颈处死妊娠14天的雌鼠，75%酒精消毒，打开腹腔、取出有胚胎的子宫。
在PBS中将胚胎从子宫中解剖出来，去除卵黄囊、羊膜和胎盘，将胎鼠在新的PBS中洗两次。
将胚胎的头和内脏去除，用消毒剪刀将胎鼠剪成小的碎片。
将胎鼠碎片转移到15 ml离心管，1000 rpm 离心2 min。
将上述处理的胚胎碎片弃上清，加入5 ml 0.25%EDTA-胰酶，37℃处理30 min，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，反复吹打，1000 rpm，离心2 min。
《基因敲除技术》PPT课件
1.什么是传统机械按键设计？
传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动PCBA上的开关按键来实现功 能的一种设计方式。
传统机械按键结构层图：
按键
PCBA
开关键
传统机械按键设计要点：
1.合理的选择按键的类型，尽量选择 平头类的按键，以防按键下陷。
2.开关按键和塑胶按键设计间隙建议 留0.05~0.1mm，以防按键死键。 3.要考虑成型工艺，合理计算累积公 差，以防按键手感不良。
系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带 Cre 的转基因动物的过程。
15
2.2利用随机插入突变进行基因敲除。
2.2.1 原理：
此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或 其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入 突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞 （原理见图5）[11,12] 。根据细胞的不同，插入载 体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细 胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA 转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲 除。
ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率 为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选 法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中 应用最多的是PNS法。
并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以 RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。近年 来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更 为简单方便的方法。
23
2.3.1 RNAi阻断基因表达的机理 双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂
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Future Works
PAI-1↑
？ LPL↓ ？
Other
？Pathways
Neointima formation↑
Thank You！
The Plasma Glucose Levels of ELK and EK Mice Fed HCC
150
ELK EK
100
50
0 ELK-0w k EK-0w k ELK-4w ks EK-4w ks ELK-8w ks EK-8w ks
0 week 4 weeks 8 weeks
ELK (n=4)
Lusis et al Circulation. 2004
Lipoprotein Lipase in the Arterial Wall
Pentikäinen et al Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002
Lipoprotein Lipase in the Arterial Wall
• Mary Beth DeYoung, Clifford Tom, David A. Dichek, et al Plasminogen Activator Inhibitor Type 1 Increases Neointima Formation in Balloon-Injured Rat Carotid Arteries. Circulation. 2001;104:1972-1977
0 week 4 weeks 8 weeks
ELK (n=4) EK （n=3）
P value
395.5±34.89
239.6±59.77 0.097
718.7±40.52 939.32±46.67
建立基因敲除小鼠颈动脉粥样硬化模型(英文)PPT课件
Common carotid arteries of apoE-/-, LPL+/- (ELK)mice (A) and apoE-/-, LPL+/+ (EK)mice (B) 8 weeks after ferric chloride injury
neointima formation after carotid artery injury by FeCl3 for 8 weeks
0 week 4 weeks 8 weeks
ELK (n=4) EK （n=3）
P value
395.5±34.89
239.6±59.77 0.097
718.7±40.52 939.32±46.67
530.7±59.52 0.04
686.08±56.66 0.018
GLU concentration(mg/dl)
noninjured
ELK
injured
EK
lipid deposit after carotid artery injury by FeCl3 for 8 weeks
carotid artery stained with ORO
noninjured
ELK
injured
EK
lipid deposit after carotid artery injury by FeCl3 for 8 weeks
noninjured
ELK
injured
EK
Mean Intimal and Medial Cross-sectional Areas
of EK and ELK Mice 8 Weeks after Injury