2发酵工业菌种制备原理和技术(2)(精)PPT课件
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发酵工程 第2章 发酵工业菌种PPT课件
lys.HCl 2.1 g/l
F6-16 (leu -, Thr -)
20.8 g/l
F9-50 (leu -, Thr -, AEC r)
33.5 g/l
42
代谢工程的定义
利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进 行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调 控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新 的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一 个新的学科领域。
13
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例：礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生 物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
14
的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选 高产菌。
28
放线菌的分离： 以产链霉素菌种的分离为例
（从退化菌种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
采用稀释法制平板，获取单菌落
根据高产菌的特点，选择目的菌落
筛ห้องสมุดไป่ตู้模型：形态依据
斜面保藏
高产菌恢复
放大培养，发酵液性能测试
物理：紫外，快中子
{ 诱变剂
化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍
35
（一）、诱变剂的作用原理（略） （二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题
化学诱变剂使用过程的安全性
亚硝酸：0.07MNa2HPO4 亚硝基胍：1MNaOH
诱变剂量的选择
诱变剂的选择 出发菌株的选择
36
（三）、诱变育种的一般步骤 (略)
发酵工艺 第2章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中国 缩写
ACCC
SH IA CCGMC AS-IV
CAF
IFFI
ID IV CIVBP
名称 中国农业微生物菌种保藏管理中 心 上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中 心 轻工业部食品发酵工业科学研究 所 中国医学科学院皮肤病研究所 中国医学科学院病毒研究所 中国兽医药品监察所
最常用的工业微生物
放线菌
– 链霉菌属 – 小单孢菌属 – 地中海诺卡氏菌 – 米苏里游动放线菌
藻类
藻类包括数种不同类以光 合作用产生能量的生物。 它们一般被认为是简单的 植物，并且一些藻类与比 较高等的植物有关。虽然 其它藻类看似从蓝绿藻得 到光合作用的能力，但是 在演化上有独立的分支。 所有藻类缺乏真的根、茎、 叶和其它可在高等植物上 发现的组织构造。藻类与 细菌和原生动物不同之处， 是藻类产生能量的方式为 光合自营性 ；琼脂（棕 藻）
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心 2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部 3、CSH：美国冷泉港研究所 4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所 5、IFO：日本发酵研究所（大阪） 6、NCTC：英国国立标准菌种收藏所 7、CBS：荷兰真菌中心保藏所
三、生产中常用菌种的分离、选 育（screening ）
（一）微生物菌种的分离 四步骤： 样品采集 增值培养 纯种分离 生产性能的测定
1.施加选择压力分离法
施加选择性压力分离法
主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营 养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、 氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微 生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到 使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如 可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物 分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生 物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在 分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加 选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗 生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。
最新发酵工程原理与技术第二章PPT课件
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几个应注意的问题
（1）出发菌株 出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。
几个应注意的问题
（2）复合诱变因素的使用 野生型菌株用单一诱变因素有时能取得好效果；老
菌种单一诱变因素重复使用突变效果不高，可利用复合 因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。
青霉菌选育：先以氮芥处理很短时间而不引起突变， 再用UV处理，可使诱变频率大为提高。提高突变频率可 获得高产菌株。
目的产物积累
微生物育种的目的
方法：突变、体内重组 体外重组（基因工程）
微生物菌种的选育
经典育种：自然选育和诱变育种 定向育种：转化、转导、接合、原生质体融合、代谢 调控和基因工程等。
自然选育
自然选育：利用菌种自然突变(Spontaneous Mutation)进 行菌种筛选的过程。 自然突变：微生物在没有人工参与下所发生的突变。 引起自然突变两个原因：多因素低剂量的诱变效应和互变 异构效应。
发酵工程原理与技术第二章
第一节 发酵工业微生物菌种的选育
微生物的特性及工业微生物的要求 发酵工业微生物菌种的分离和选育 发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏
发酵工业微生物菌种的分离和选育
微生物菌种的分离 微生物菌种的选育
微生物菌种的分离
施加选择性压力分离法 随机分离方法
自然突变
结果： 1、菌种衰退和生产质量下降； 2、对生产有益的突变。
为此，菌株应定期纯化，保存优良菌种(复壮)。 实际生产中，从高产批号中取样分离单菌落， 从中选 出稳定菌株用于生产。
自然选育
自然选育的优越性:简单易行,可以达到纯化菌 种,防止菌种衰退,稳定生产,提高产量的目的.
缺点:效率低,进展慢,很难使生产水平大幅度提 高.
几个应注意的问题
（1）出发菌株 出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。
几个应注意的问题
（2）复合诱变因素的使用 野生型菌株用单一诱变因素有时能取得好效果；老
菌种单一诱变因素重复使用突变效果不高，可利用复合 因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。
青霉菌选育：先以氮芥处理很短时间而不引起突变， 再用UV处理，可使诱变频率大为提高。提高突变频率可 获得高产菌株。
目的产物积累
微生物育种的目的
方法：突变、体内重组 体外重组（基因工程）
微生物菌种的选育
经典育种：自然选育和诱变育种 定向育种：转化、转导、接合、原生质体融合、代谢 调控和基因工程等。
自然选育
自然选育：利用菌种自然突变(Spontaneous Mutation)进 行菌种筛选的过程。 自然突变：微生物在没有人工参与下所发生的突变。 引起自然突变两个原因：多因素低剂量的诱变效应和互变 异构效应。
发酵工程原理与技术第二章
第一节 发酵工业微生物菌种的选育
微生物的特性及工业微生物的要求 发酵工业微生物菌种的分离和选育 发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏
发酵工业微生物菌种的分离和选育
微生物菌种的分离 微生物菌种的选育
微生物菌种的分离
施加选择性压力分离法 随机分离方法
自然突变
结果： 1、菌种衰退和生产质量下降； 2、对生产有益的突变。
为此，菌株应定期纯化，保存优良菌种(复壮)。 实际生产中，从高产批号中取样分离单菌落， 从中选 出稳定菌株用于生产。
自然选育
自然选育的优越性:简单易行,可以达到纯化菌 种,防止菌种衰退,稳定生产,提高产量的目的.
缺点:效率低,进展慢,很难使生产水平大幅度提 高.
发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术讲解
的水生环境中生长
种类：分属于子囊菌纲、担子菌纲及半知菌 类，目前已知的酵母菌有56属，大约500多种， 与其他类群比，种类要少得多。
分布：酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸 性环境，诸如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上， 特别是葡萄园和果园的土壤中，因而称为糖菌 （Sugar fungus）。
裂殖酵母
5. 担子菌——蘑菇（mushroom）
6. 藻类
许多国家已把藻类作为人类保健食品和饲料。 螺旋藻
可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻 类农场”获得氢能的报道。
三、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买 从发酵制品中分离目的菌株 自然界中分离筛选新的微生物菌种 菌种选育：自然选育、人工诱变、原生质体融 合、基因工程改造
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
我们的周围存在着多种多 样的微生物，它们和我们 的生活密切相关。
目前已知微生物约有10万种，分布在以下各界中：
原核生物界：例如细菌、蓝藻 真菌界：例如酵母菌 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
发酵工业对菌种的要求
能在廉价培养基上迅速生长，目的代谢产物产量高 培养条件易于控制 生长速度和反应速度快，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体和杂菌的能力强 遗传性状稳定，菌种不易变异退化 发酵过程产生泡沫少 对前体物质有耐受能力，不作为碳源利用 不是病原菌，不产生有害的生物活性物质
如何在后续的操作中使这种可能性实现？
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。
种类：分属于子囊菌纲、担子菌纲及半知菌 类，目前已知的酵母菌有56属，大约500多种， 与其他类群比，种类要少得多。
分布：酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸 性环境，诸如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上， 特别是葡萄园和果园的土壤中，因而称为糖菌 （Sugar fungus）。
裂殖酵母
5. 担子菌——蘑菇（mushroom）
6. 藻类
许多国家已把藻类作为人类保健食品和饲料。 螺旋藻
可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻 类农场”获得氢能的报道。
三、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买 从发酵制品中分离目的菌株 自然界中分离筛选新的微生物菌种 菌种选育：自然选育、人工诱变、原生质体融 合、基因工程改造
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
我们的周围存在着多种多 样的微生物，它们和我们 的生活密切相关。
目前已知微生物约有10万种，分布在以下各界中：
原核生物界：例如细菌、蓝藻 真菌界：例如酵母菌 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
发酵工业对菌种的要求
能在廉价培养基上迅速生长，目的代谢产物产量高 培养条件易于控制 生长速度和反应速度快，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体和杂菌的能力强 遗传性状稳定，菌种不易变异退化 发酵过程产生泡沫少 对前体物质有耐受能力，不作为碳源利用 不是病原菌，不产生有害的生物活性物质
如何在后续的操作中使这种可能性实现？
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。
第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术-PPT
筛选一些具有特殊性质得微生物时,需根据该微生物独特 得生理特性到相应得地点采样(极端环境)。如:
高温酶产生菌:温度较高得南方,或温泉、火山爆发处 及北方得堆肥中采集样品;
低温酶产生菌:寒冷得地方,如南北极地区、冰窖、深 海中采样;
耐压菌:海洋底部采样。 耐高渗透压酵母菌:通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处
菌种纯化就是指在特定环境中只让1种来自同一祖先得微生物 群体生存得技术。
菌株分离、筛选虽为两个环节,但却不能绝然分开,因为分离中 得一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌得筛选 一般包括两大部分:一就是从自然界分离所需要得菌株,二就是 把分离到得野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
3、分离思路
从自然界筛选
B、采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。
C、采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取 离地面5-15cm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑 料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等, 以备查考。为了使土样中微生物得数量与类型尽少变 化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。
别出来。
抗生素筛选
6、生产性能得测定
由于纯种分离后,得到得菌株数量非常大,如果对每 一菌株都作全面或精确得性能测定,工作量十分巨大, 而且就是不必要得。一般采用两步法,即初筛与复筛, 经过多次重复筛选,直到获得1～3株较好得菌株,供 发酵条件得摸索与生产试验,进而作为育种得出发菌 株。这种直接从自然界分离得到得菌株称为野生型 菌株,以区别于用人工育种方法得到得变异菌株(亦 称突变株)。
采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖得耐 高渗透压得酵母菌。
(3)含微生物样品得富集培养(优化得过程) ----施加选择性压力分离法
微生物工程发酵二菌种制备原理与技术精品PPT课件
防止退化的方法： • 尽量减少传代； • 经常进行纯化； • 创造良好的培养条件； • 单核细胞的移植传代； • 采用有效的保藏方法；
菌种的复壮
• 在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种 分离和测定生产性能等方法，从衰退的群 体中找到尚未衰退的个体，以达到恢复该 菌种原有性状的措施；
• 方法：纯种分离（单细胞分离）； 淘汰法； 寄生体内复壮法；
2.1.4菌种的制备原理和方法
菌株获得的主要方法： • 向菌种保藏机构索取；
➢ 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性
• 从自然界分离筛选； • 从某些发酵制品中分离；
从自然界筛选目标菌株的方法与步骤
含微生物样品的采集 （含微生物样品的富集培养）
微生物的分离 野生型目的菌株的筛选
放线菌 • 主要生产抗生素、某些特定的酶； • 常用菌种： • Streptomyces lividans; S. coelicolor; • S. hygroscopicus; Micromonospora echinospora; • Actinoplanes ferrugineus;
酵母 • 主要生产酒精、有机酸、 单细胞蛋白 常用菌种：
• Saccaromyces cerevisiae • Pichia pastoris • Candida glabrata • C. tropicals • Phaffia rhodozyma • Yarrowia lipolitica
霉菌 • 主要生产：抗生素、有机酸、酶、色素； • Penicillium chrysogenum • Aspergillus niger • A. oryzae • Rhizopus oryzae
2.1.5 适应性进化（菌株驯化）
发酵工程第二章发酵工业微生物菌种
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽 土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的 土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果 生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐 败物品，某些水域等。
新种分离与筛选的步骤
（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为 生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种， 更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆 壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒 性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的 毒性试验。
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂
李 先 磊
Fermentation Engineering
生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培 养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一 点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离 法。
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
李 先 磊
（二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择 性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。
2发酵工业菌种制备原理和技术(2)(精)
作为种子扩大培养的方法： ① 表面培养法 ② 固体培养法 ③液体培养法（三角瓶摇床震荡或转式培养）； ④载体培养法
24
固体培养法（曲法培养）
浅盘固体培养 深层固体培养
25
优点：
（1）酶活力高。 （2）生产过程中无菌程度要求不很严格。 （3）对于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以 有效的降低产品分离成本。
NICPB 卫生部药品生物制品监察所
IV
CIVBP
中国医学科学院病毒研究所
中国兽医药品监察所
CVCC
YM
兽医微生物菌种保藏管理中心
云南省微生物研究所
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国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心
2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部
3、CSH：美国冷泉港研究所
4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所
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微生物菌种保藏机构名称和缩写
中 国 缩写 ACCC SH IA CCGMC AS-IV CAF IFFI ID 名称 中国农业微生物菌种保藏管理中心 上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中心 轻工业部食品发酵工业科学研究所 中国医学科学院皮肤病研究所 缩写 ISF CACC SIA AS CFCC CICC CMCC 名称 中国农业科学院土壤肥料研究 所 抗菌素菌种保藏管理中心 四川抗菌素工业研究所 中国科学院微生物研究所 林业微生物菌种保藏管理中心 工业微生物菌种保藏管理中心 医学微生物菌种保藏管理中心
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（5）接种量
移入种子的体积 接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积
发酵工程 (第2章)
（b）营养缺陷型的意义 在营养缺陷型突变菌株中，生物合成途径中的 某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，末端产 物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。 只要在培养基中限量加入所要求的末端产物，克服 生长障碍，就能使中间产物积累。 营养缺陷型突变株具有明显的遗传标记，在杂 交育种中作为出发菌株，有利于杂交重组的分析。 营养缺陷型突变株具有明显的遗传标记，可以 作为基因工程中的受体菌，检出克隆基因的表达。
（二）微生物菌种的选育
1、自然选育 不经过人工处理，利用微生物自然突变进行 菌种选育的过程称为自然选育。 自然选育简单易行，可以达到纯化菌种，防 止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。 自然选育的一般程序是将菌种制成菌悬液， 用稀释法在固体平板上分离单菌落，再分别测 定单菌落的生产能力，从中选出高水平菌种。
（2）抗肿瘤药物产生菌的分离。 原理一（p21）： 临床上抗肿瘤药物大部分是直接作用于核酸或 抑制核酸生物合成的物质，由于微生物和人的核 酸结构与生物合成方式有许多共同之处，所以大 部分抗肿瘤药物也具有抗菌活性，据此发展出利 用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的方法。 <1> 生化诱导分析法（BIA） <2> SOS显色法
c 、不形成孢子只通过芽殖的“假酵母”属半知菌。
工业上常用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等
4、霉菌（mould）
霉菌非系统演化分类的单元。凡生长在营养 基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统 称霉菌。 工业上常用的霉菌有： 藻状菌纲：根霉，毛霉，犁头霉 子囊菌纲：红曲霉 半知菌类：曲霉，青霉。
所有菌都长
完全培养基上 长成单孢菌落 基本培养基 完全培养基 轻压在绒布上 无菌丝绒布 橡皮箍 接上所有菌落的绒布 转印在新鲜 的培养基上
第二章发酵工业微生物菌种ppt课件
第二章 发酵工业微生物菌 种制备原理和技术
2019
-
1
第一节 发酵工业微生物菌种的选育
一、工业微生物的特点 1. 能够利用廉价的原料，或使用来源丰富的原料. 2.菌体温度应适应较高的温度. 3. 遗传性能要相对稳定 4.菌对所采用的设备和生产过程的适应性 5.菌的产物得率和产物在培养基中的浓度 6.产物容易从发酵液（细胞）中提取
2019
-
6
(3) 放线菌 霉菌 放线菌是由不同长短的纤细菌丝所形成 霉菌与人类日常生活密切相关。除了用于传 的单细胞微生物。放线菌是抗生素的主 统的酿酒、制酱油外，近代广泛用于发酵工 要产生菌。除抗生素外，放线菌在甾体 业和酶制剂工业。工业上常用的霉菌，有子 激素生物合成和酶制剂生产上也有广泛 囊菌纲的红曲霉、藻状菌纲的毛霉、根霉和 应用。 犁头霉，以及半知菌纲的曲霉及青霉等
2019 17
自然选育在工业生产上的意义 问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？ 回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。
2019
-
18
自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备 平板分离 挑选单菌落(注意形态的观察) 发酵试验
7. 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 201）细菌 发酵工业上常用的细菌大多是杆菌，如枯草芽 孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、梭 状芽孢杆菌大肠杆菌等。 (1) 醋酸杆菌（Acetobacter）：用于酿 醋，把乙醇氧化成乙酸。 (2) 假单胞菌（Pseudomonas）
2019 8
2019
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1
第一节 发酵工业微生物菌种的选育
一、工业微生物的特点 1. 能够利用廉价的原料，或使用来源丰富的原料. 2.菌体温度应适应较高的温度. 3. 遗传性能要相对稳定 4.菌对所采用的设备和生产过程的适应性 5.菌的产物得率和产物在培养基中的浓度 6.产物容易从发酵液（细胞）中提取
2019
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(3) 放线菌 霉菌 放线菌是由不同长短的纤细菌丝所形成 霉菌与人类日常生活密切相关。除了用于传 的单细胞微生物。放线菌是抗生素的主 统的酿酒、制酱油外，近代广泛用于发酵工 要产生菌。除抗生素外，放线菌在甾体 业和酶制剂工业。工业上常用的霉菌，有子 激素生物合成和酶制剂生产上也有广泛 囊菌纲的红曲霉、藻状菌纲的毛霉、根霉和 应用。 犁头霉，以及半知菌纲的曲霉及青霉等
2019 17
自然选育在工业生产上的意义 问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？ 回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。
2019
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18
自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备 平板分离 挑选单菌落(注意形态的观察) 发酵试验
7. 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 201）细菌 发酵工业上常用的细菌大多是杆菌，如枯草芽 孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、梭 状芽孢杆菌大肠杆菌等。 (1) 醋酸杆菌（Acetobacter）：用于酿 醋，把乙醇氧化成乙酸。 (2) 假单胞菌（Pseudomonas）
2019 8
《发酵工业菌种》PPT课件
物活性物质和毒素。
编辑ppt
6
（二）分离筛选原理与技术
1. 筛选的指导思想 2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 3. 新种分离筛选原理与技术
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7
1. 筛选的两种指导思想
先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。 分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
结果有两种可能：
▪ 获得适于工业发酵菌株 ▪ 只获得选育所需的出发菌株
选择性分离技术 富集液体培养技术 施加选择压力，进行定向筛选 固体培养技术
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17
A.富集液体培养
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长
或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式
▪ 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题
随机分离技术举例
抗生素产生菌的筛选
药理活性化合物产生菌的筛选
生长因子产生菌的筛选
多糖产生菌的筛选
编辑ppt
22
高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素；
使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物
阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
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B. 固体培养技术
常用于分离某些酶产生菌 选择压力：在选择培养基中加入所需酶
的基质
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21
随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速 灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
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（二）分离筛选原理与技术
1. 筛选的指导思想 2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 3. 新种分离筛选原理与技术
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1. 筛选的两种指导思想
先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。 分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
结果有两种可能：
▪ 获得适于工业发酵菌株 ▪ 只获得选育所需的出发菌株
选择性分离技术 富集液体培养技术 施加选择压力，进行定向筛选 固体培养技术
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A.富集液体培养
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长
或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式
▪ 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题
随机分离技术举例
抗生素产生菌的筛选
药理活性化合物产生菌的筛选
生长因子产生菌的筛选
多糖产生菌的筛选
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22
高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素；
使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物
阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
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20
B. 固体培养技术
常用于分离某些酶产生菌 选择压力：在选择培养基中加入所需酶
的基质
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21
随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速 灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术
第二章 发酵工业微生物菌种 制备原理和技术
发酵工程 工业生产水平的
生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件
三个决定要素
生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工程工 业生产的第一环节。
本章内容
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
第二节 自然界中微生物菌种的选择性分离
第三节 微生物菌种的选育
第四节 微生物菌种的退化、复壮和保藏 第五节 工业微生物菌种的扩大培养 第六节 种子培养基及其制备
集的培养物到固体培养基，分离优势微生物的单
菌落。
移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。
连续富集培养（恒化式富集培养）
改变限制性基质浓度来控制两种菌的比生长速率。 用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。
固体培养基的使用
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
常用于分离酶产生菌，选择培养基中常含有所
需的基质，以便促使酶产生菌的生长，并在菌落
使目的微生物在种群中占优势，使筛选 1. 目的：
变得可能。
2. 两种方案：
（1）施加选择性压力分离法：采用特定的有利于 目的微生物富集的条件进行培养，使目的微生物 占优势，以实现快速分离纯化的目的。 （2）随机分离法：不能提供任何有助于筛选产生 菌的信息时，只能通过随机分离法进行分离。
（1）施加选择性压力分离法
酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
发酵工程 工业生产水平的
生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件
三个决定要素
生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工程工 业生产的第一环节。
本章内容
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
第二节 自然界中微生物菌种的选择性分离
第三节 微生物菌种的选育
第四节 微生物菌种的退化、复壮和保藏 第五节 工业微生物菌种的扩大培养 第六节 种子培养基及其制备
集的培养物到固体培养基，分离优势微生物的单
菌落。
移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。
连续富集培养（恒化式富集培养）
改变限制性基质浓度来控制两种菌的比生长速率。 用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。
固体培养基的使用
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
常用于分离酶产生菌，选择培养基中常含有所
需的基质，以便促使酶产生菌的生长，并在菌落
使目的微生物在种群中占优势，使筛选 1. 目的：
变得可能。
2. 两种方案：
（1）施加选择性压力分离法：采用特定的有利于 目的微生物富集的条件进行培养，使目的微生物 占优势，以实现快速分离纯化的目的。 （2）随机分离法：不能提供任何有助于筛选产生 菌的信息时，只能通过随机分离法进行分离。
（1）施加选择性压力分离法
酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
发酵工业菌种PPT课件
随机分离方法
(用筛选方案- 检测系统进行间接分离）
富集液体培养 固体培养基条件培养 (初筛)
菌种纯化
复筛
菌种纯化
初步工艺条件摸索
再复筛 生产性能测试
较优菌株1-3株
保藏及进一步做生产试验 或作为育种的出发菌株
某些必要试验和 毒性试验等
含微生物样品的采集
采样时应注意的问题: 土壤微生物的分布 采土深度 土壤植被情况 采样季节 土壤的酸碱度
.
1
本章内容
一、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术 二、发酵工业菌种改良
.
2
一、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术
（一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 （二）分离筛选原理与技术 （三）应用举例
.
3
1. 菌种选择的总趋势
野生菌→变异菌 自然选育→代谢控制育种 诱发基因突变→基因重组的定向育种
金黄色葡萄球菌209p 枯草杆菌6633 大肠杆菌 耻垢分枝杆菌607 白色念珠菌 青霉菌
代表微生物类型
革兰氏阳性球菌 革兰氏阳性杆菌 革兰氏阴性肠道细菌
结核杆菌 酵母状真菌 丝状真菌
药理活性化合物产生菌的筛选
药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一 个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到 治疗的目的。
筛选模型：目标酶
.
26
生长因子产生菌的筛选
筛选模型：营养缺陷型试验菌 筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进
营养缺陷型试验菌生长
.
27
氨基酸产生菌的筛选
样品
预处理
初筛（除真菌）
在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（copy 法）
平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 u.v线杀死长好的菌落
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1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
本章内容
一、常用的工业微生物菌种选育 二、工业微生物种子的扩大培养 三、种子培养基及其制备
2
第一节 常用的工业微生物菌种选育
微生物工程工业生产水平 的三个决定要素:
生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件 生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程 工业生产的第一环节.
3
一．工业常用微生物
细菌：枯草杆菌，短杆菌，大肠杆菌 酵母：酿酒酵母（啤酒，葡萄酒），酒
26
液体深层培养法
27
优点： （1）生产效率高，便于自动化管理。 （2）生产过程中温度、溶氧、pH值等参数可以实现全
面控制。 （3）通常生产液体种子，整个生产周期较短。 缺点： （1）无菌程度要求高，相对生产设备投资较大。 （2）对于某些种类的发酵，液体培养因投资大、生产
密度大而难以实现。
28
精酵母，假丝酵母 霉菌：黑曲霉，土曲霉，米曲霉，红曲
霉，根霉，木霉，青霉 放线菌：单孢菌 其他：藻类
4
最常用的工业微生物
细菌
枯草芽孢杆菌 醋酸杆菌 棒状杆菌 短杆菌 大肠杆菌
5
最常用的工业微生物
酵母菌
酿酒酵母 假丝酵母属
产朊假丝酵母 解脂假丝酵母 热带假丝酵母
毕赤酵母属、汉逊酵母属
浅盘固体培养 深层固体培养
25
优点：
（1）酶活力高。 （2）生产过程中无菌程度要求不很严格。 （3）对于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以
有效的降低产品分离成本。
缺点：
（1）生产劳动强度较大，占地面积大，不宜自动化生产。 （2）周期长。 （3）培养过程中环境条件控制较难。 （4）生产过程中，由于无菌程度较低，其菌种不纯。
17
（3）种子罐级数的确定 种子罐级数：是指制备种子需逐级
扩大培养的次数，取决于：
菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖 速度；
所采用发酵罐的容积
18
✓ 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少， 二级发酵。 茄子瓶→种子罐→发酵罐
✓ 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子 发芽，产生菌丝 ）→二级种子罐 （ 27˚C,10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌 丝体）→发酵罐
为每次发酵罐的投料提供相当数量的 代谢旺盛的种子。
12
种子扩大培养定义
种子扩大培养：是指将保存在砂土管、 冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种 接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇 瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数 量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子。
13
种子制备的过程大致可分为：
实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段
14
1.实验室种子制备 实验室种子的制备一般采用两种方式
固体培养基培养孢子 液体培养法
15
2.生产车间种子制备
（1）种子罐的作用：
种子罐
主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌 （丝）体，接入发酵罐能迅速生长， 达到一定的菌体量，以利于产物的 合成。
16
（2）种子罐接种： 微孔接种法 火焰保护法 压差法
缩写
ISF
CACC SIA AS CFCC CICC CMCC NICPB CVCC YM
名称 中国农业科学院土壤肥料研究 所 抗菌素菌种保藏管理中心 四川抗菌素工业研究所 中国科学院微生物研究所 林业微生物菌种保藏管理中心 工业微生物菌种保藏管理中心 医学微生物菌种保藏管理中心 卫生部药品生物制品监察所 兽医微生物菌种保藏管理中心 云南省微生物研究所
的一个方面
21
（4）种龄
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐 或发酵罐时的培养时间。 种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期，细胞活力强，菌体浓度相对较大， 但是最终由实验结果定。
22
（5）接种量
移入种子的体积 接种量＝ —————————
接种后培养液的体积
接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长 繁殖的速度。
10
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心 2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部 3、CSH：美国冷泉港研究所 4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所 5、IFO：日本发酵研究所（大阪） 6、NCTC：英国国立标准菌种收藏所 7、CBS：荷兰真菌中心保藏所
11
第二节 工业微生物种子的扩大培养 菌种扩大培养的目的：
通常接种量，细菌1~5%，酵母菌5~10%， 霉菌7~15%、有时20~25%。
23
3、发酵工业种子培养
⑴静置培养法（厌气性发酵）； ⑵通气性培养（好气性发酵）；
作为种子扩大培养的方法： ① 表面培养法 ② 固体培养法 ③液体培养法（三角瓶摇床震荡或转式培养）； ④载体培养法
24
固体培养法（曲法培养）
6
最常用的工业微生物
霉菌 曲霉属 米曲霉 黑曲霉 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉 根霉属 德氏根霉 米根霉、小麦曲根霉 红曲霉属 紫红曲霉
7
最常用的工业微生物
放线菌
链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
8
微生物工业对菌种的要求
能在廉价原料制备的培养基上迅速生长 和生成所需的代谢产物产量高。
培养条件易于控制 生长迅速，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体能力强 菌种不易变异退化 安全性（不是病源菌，不产毒素）
9
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中国 缩写
ACCC
SH IA CCGMC AS-IV CAF IFFI ID IV CIVBP
名称
中国农业微生物菌种保藏管理中心
上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中心 轻工业部食品发酵工业科学研究所 中国医学科学院皮肤病研究所 中国医学科学院病毒研究所 中国兽医药品监察所
几种深层培养法
①放大法 ②两步法 ③控制培养法 ④分批培养法(间歇发酵法) ⑤连续培养法 ⑥补料分批培养法(流加法)
✓ 放线菌：生长更慢，采用四级发酵 ✓ 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用
一级种子
19
20
确定种子罐级数需注意的问题
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会； 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一
般2-4级。 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要
本章内容
一、常用的工业微生物菌种选育 二、工业微生物种子的扩大培养 三、种子培养基及其制备
2
第一节 常用的工业微生物菌种选育
微生物工程工业生产水平 的三个决定要素:
生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件 生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程 工业生产的第一环节.
3
一．工业常用微生物
细菌：枯草杆菌，短杆菌，大肠杆菌 酵母：酿酒酵母（啤酒，葡萄酒），酒
26
液体深层培养法
27
优点： （1）生产效率高，便于自动化管理。 （2）生产过程中温度、溶氧、pH值等参数可以实现全
面控制。 （3）通常生产液体种子，整个生产周期较短。 缺点： （1）无菌程度要求高，相对生产设备投资较大。 （2）对于某些种类的发酵，液体培养因投资大、生产
密度大而难以实现。
28
精酵母，假丝酵母 霉菌：黑曲霉，土曲霉，米曲霉，红曲
霉，根霉，木霉，青霉 放线菌：单孢菌 其他：藻类
4
最常用的工业微生物
细菌
枯草芽孢杆菌 醋酸杆菌 棒状杆菌 短杆菌 大肠杆菌
5
最常用的工业微生物
酵母菌
酿酒酵母 假丝酵母属
产朊假丝酵母 解脂假丝酵母 热带假丝酵母
毕赤酵母属、汉逊酵母属
浅盘固体培养 深层固体培养
25
优点：
（1）酶活力高。 （2）生产过程中无菌程度要求不很严格。 （3）对于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以
有效的降低产品分离成本。
缺点：
（1）生产劳动强度较大，占地面积大，不宜自动化生产。 （2）周期长。 （3）培养过程中环境条件控制较难。 （4）生产过程中，由于无菌程度较低，其菌种不纯。
17
（3）种子罐级数的确定 种子罐级数：是指制备种子需逐级
扩大培养的次数，取决于：
菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖 速度；
所采用发酵罐的容积
18
✓ 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少， 二级发酵。 茄子瓶→种子罐→发酵罐
✓ 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子 发芽，产生菌丝 ）→二级种子罐 （ 27˚C,10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌 丝体）→发酵罐
为每次发酵罐的投料提供相当数量的 代谢旺盛的种子。
12
种子扩大培养定义
种子扩大培养：是指将保存在砂土管、 冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种 接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇 瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数 量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子。
13
种子制备的过程大致可分为：
实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段
14
1.实验室种子制备 实验室种子的制备一般采用两种方式
固体培养基培养孢子 液体培养法
15
2.生产车间种子制备
（1）种子罐的作用：
种子罐
主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌 （丝）体，接入发酵罐能迅速生长， 达到一定的菌体量，以利于产物的 合成。
16
（2）种子罐接种： 微孔接种法 火焰保护法 压差法
缩写
ISF
CACC SIA AS CFCC CICC CMCC NICPB CVCC YM
名称 中国农业科学院土壤肥料研究 所 抗菌素菌种保藏管理中心 四川抗菌素工业研究所 中国科学院微生物研究所 林业微生物菌种保藏管理中心 工业微生物菌种保藏管理中心 医学微生物菌种保藏管理中心 卫生部药品生物制品监察所 兽医微生物菌种保藏管理中心 云南省微生物研究所
的一个方面
21
（4）种龄
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐 或发酵罐时的培养时间。 种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期，细胞活力强，菌体浓度相对较大， 但是最终由实验结果定。
22
（5）接种量
移入种子的体积 接种量＝ —————————
接种后培养液的体积
接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长 繁殖的速度。
10
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心 2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部 3、CSH：美国冷泉港研究所 4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所 5、IFO：日本发酵研究所（大阪） 6、NCTC：英国国立标准菌种收藏所 7、CBS：荷兰真菌中心保藏所
11
第二节 工业微生物种子的扩大培养 菌种扩大培养的目的：
通常接种量，细菌1~5%，酵母菌5~10%， 霉菌7~15%、有时20~25%。
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3、发酵工业种子培养
⑴静置培养法（厌气性发酵）； ⑵通气性培养（好气性发酵）；
作为种子扩大培养的方法： ① 表面培养法 ② 固体培养法 ③液体培养法（三角瓶摇床震荡或转式培养）； ④载体培养法
24
固体培养法（曲法培养）
6
最常用的工业微生物
霉菌 曲霉属 米曲霉 黑曲霉 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉 根霉属 德氏根霉 米根霉、小麦曲根霉 红曲霉属 紫红曲霉
7
最常用的工业微生物
放线菌
链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
8
微生物工业对菌种的要求
能在廉价原料制备的培养基上迅速生长 和生成所需的代谢产物产量高。
培养条件易于控制 生长迅速，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体能力强 菌种不易变异退化 安全性（不是病源菌，不产毒素）
9
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中国 缩写
ACCC
SH IA CCGMC AS-IV CAF IFFI ID IV CIVBP
名称
中国农业微生物菌种保藏管理中心
上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中心 轻工业部食品发酵工业科学研究所 中国医学科学院皮肤病研究所 中国医学科学院病毒研究所 中国兽医药品监察所
几种深层培养法
①放大法 ②两步法 ③控制培养法 ④分批培养法(间歇发酵法) ⑤连续培养法 ⑥补料分批培养法(流加法)
✓ 放线菌：生长更慢，采用四级发酵 ✓ 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用
一级种子
19
20
确定种子罐级数需注意的问题
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会； 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一
般2-4级。 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要