凯氏定氮法测定食品中蛋白质
食品中蛋白质凯氏定氮法测定比较
蛋白质测定涉及企业生产和监督 检测众多领域。本次测验用凯氏定氮 法检测，在操作过程中总结出两仪器 方 法 的 适 用 条 件 及 操 作 事 项， 以 便 在 检 测 工 作 中 更 好 的 掌 握 蛋 白 质 的 检测。 1 检测试剂
所 需 试 剂 均 为 分 析 纯， 检 测 用 水 为 实 验 室 合 格 水。 混 合 催 化 剂（ 硫 酸 铜和硫酸钾），硼酸溶液（20 g/L）， 溴 甲 酚 绿 指 示 剂（10 g/L）， 甲 基 红 指 示（10g/L）， 亚 甲 基 蓝 指 示 剂 （10 g/L）， 氢 氧 化 钠（400 g/L）， 硫酸，甲基红溴甲酚绿混合指示液。 （0.050 mol/L）硫酸标准滴定溶液。 2 检测用设备
事项
7.2 凯氏定氮法操作时的注意事项
混匀的固体 0.5 g 左右、半固体 2 g
操作时注意仪器整体装置的密闭
左右、液体摇晃均匀 10 g 左右。这样 性，水蒸气烧瓶要做空蒸试验，保证
的结果比较稳定。开始时控制火力，
（下转 149 页）
147 Apr. 2021 CHINA FOOD SAFETY
测试。连续做空白测试，结果一致后， 6 结果比较
仪器稳定即可连续测试，空白结果最
以 奶 粉 为 例， 两 种 方 法 的 检 测 结
大值减去最小值小于 0.05 mL 时，仪 果见表 1。 表 1 两种方法的检测结果表
编号和方法
称取样品 质量 /g
蛋白质含量检测 结果 （/ g/100g）
质控样 浓度值
连接好 加甲基红指示剂 3 滴和硫酸 1 mL，使 蒸馏水显酸性，加热蒸馏瓶内的水保 持沸腾。
打 开 装 置 冷 凝 水， 接 收 瓶 加 入 10.0 mL 硼酸溶液及 3 滴混合滴定指 示液。接收瓶放在冷凝管的下端插入
凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量
关键词 ： 凯氏定氮 ； 测定 ； 食品 ； 蛋白质
食 品 种类很 多 ， 品 中 ｐｏ的性质 和含量 各 不相 同 ， 食 ｒ 而且其 他成 分 ， 碳水 化合 物 ， 肪 和维生 素 的干扰成 分 如 脂 很多 ， 因此 ｐｏ的测 定 通 常 利 用 经 典 的凯 氏定 氮 法 将 样 ｒ 品消化成 铵 盐蒸 馏 ， 用标准 酸 液吸 收 ， 用标 准酸 或碱 液滴 定， 由样 品 中含 氮量计 算 出 ｐｏ的含量 。 由于食 品 中 ｐｏ ｒ ｒ 含 量不 同又 分为凯 氏定氮 常量 法 、 半微 量法 和微 量法 ， 但 它们 的基本 原理 都是 一样 的 。 我们 在检 验食 品 中 ｐｏ时 ， 往 只限 于测 定总 氮 量 ， ｒ 往 然 后乘 以 ｐｏ ｒ 核算 等数 ， 到蛋 白质 含 量 ， 际上包 括 核 得 实
酸、 生物 碱 、 含氮类 脂 、 叶啉 和 含 氮 色素 等 非 蛋 白质 氮 化 合 物 ， 称 为粗 ｐｏ 故 ｒ。
１ 凯 氏常 量定 氮法
气 逸 出。
吸收与滴定 ： 蒸馏过程 中放 出的氨可用一定量 的标
准硫 酸或 标准 盐酸 溶 液进 行 氨 的 吸 收 ， 然后 再 用 标 准 氢
ｐ ｏ ＝总 氮 ％ ×Ｋ ｒ％
氢 化钾 盐类来 提 高沸 点 。其 理 由随着 消化过 程硫 酸 的不 断地被 分解 ， 水分 的逸 出而 使硫 酸钾 的浓度 增大 ， 沸点 增 加 。加速 了有 机 的分 解 。但 硫 酸 钾加 入量 不 能太 大 ， 否 则 温度太 高 ， 生成 的硫 酸氢 铵也会 分解 ， 出氨而 造成 损 放
实验一食品中蛋白质含量测定凯氏定氮法
营养技能实训指导≤烹饪营养与安全≥课程组福州黎明职业技术学院药学系2007年02月目录1、实训一食物中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）2、实训二食物中脂肪含量的测定（索氏抽提法）3、实训三荧光法测定食物中维生素B24、实训四大学生食谱编制与计算5、实训五用配餐软件配制幼儿园一周食谱6、实训六烹饪营养配餐与菜单设计7、实训七厨房用具砧板的卫生调查（细菌菌落总数测定）8、实训八厨房卫生调查（大肠菌群快速检测法）实训一食物中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）一、目的与要求1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。
2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。
二、实验原理蛋白质是含氮的化合物。
食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。
因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白三、仪器与试剂（一）试剂1、硫酸铜（CuSO4·5H20）2、硫酸钾3、硫酸（密度为1.8419g/L）4、硼酸溶液（20g/L）5、氢氧化钠溶液（400g/L）c——盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）；0.0140 ——1.0mL 盐酸[c(HCl) 1.000mol / L]标准滴定溶液相当的氮的质量（g）；m——样品的质量（g）；F——氮换算为蛋白质的系数，一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；高梁为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵5.30。
计算结果保留三位有效数字。
六、注意事项及说明1、本法也适用于半固体试样以及液体样品检测。
半固体试样一般取样范围为2.00g~5.00g；液体样品取样10.0mL~25.0mL（约相当氮30mg~40mg）。
微量凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量
微量凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量一、实验目的：1、了解微量凯氏定氮法测定蛋白质的卫生学意义。
2、熟悉蛋白质西数在蛋白质含量计算中的应用与凯氏定氮法测定蛋白质的操作过程。
3、掌握微量凯氏定氮法测定蛋白质的原理和方法。
二、实验原理：有机物中的氮在强热和浓硫酸作用下，消化生成硫酸铵，在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出氨气，释放的氨气采用硼酸液进行收集，再用已知浓度的盐酸标准溶液滴定，根据盐酸消耗量计算出氮含量，然后乘以相应的系数，计算得到蛋白质含量。
三、实验原始数据记录：HCL标准液的摩尔浓度：M=0.01mol/L空白滴定消耗HCL体积：V1=0.2ml样品滴定消耗HCL体积：V2=1.3ml样品消化液体积：V3=5ml样品质量W=0.212g四、结果计算：样品中蛋白质含量（g/100g）=[(V2-V1)*M*0.014*6.25]*100/(V3*W/100)=9.08五、结果分析及讨论：（1）凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量时，样品应是均匀的。
所以固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。
（2）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。
若沾附可用少量水冲下，以免样品消化不完全，使结果偏低。
（3）蒸馏前，样品和反应液从加样口加入，每加一次，用蒸馏水冲洗一次，再关闭加样口，并加少量蒸馏水封液，以防止漏气，导致结果偏低。
（4）氨气收集管口应没入指示剂中，防止氨气溢出，导致结果偏低。
（5）利用负压可将反应室内的溶液吸出，在加适量蒸馏水冲洗，反复几次，可清洗反应室。
（6）滴定终点以绿色消失为准，终点稍过即为紫红色。
（7）这种测算方法本质是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算。
只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量。
思考题（1）消化时为什么只能用浓硫酸，而不用浓硝酸或高氯酸？答：凯氏定氮的基本原理是使有机物中的氮转化为铵盐，然后加碱蒸出氨气，然后酸碱滴定。
其中消化作用就是使有机氮变为铵盐，如果用硝酸或者高氯酸，在加热、酸性情况下硝酸会氧化铵根，生成氮气、一氧化氮等物质，从而使定氮结果偏低或无法定出。
凯氏定氮法检测食物中蛋白质含量与误差分析
结语
食品行业的飞速发展与人们对食 品安全的愈加重视都给食品质量检测 提出更高的要求，作为质量检测的从 业者，需对食品进行更加严格和准确 的检测。
凯氏定氮法检测食物中蛋白质含量与误差分析
□ 石红伟 大连普兰店市产品质量监督检验所
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食品安全导刊
2016年11月
DOI:10.16043/ki.cfs.2016.33.091 越来越多的人开始关注自身健康 与食品安全问题，精确地测定食品中 蛋白质含量对食品质量检测、食品安 全 都 极 为 重 要。 新 的 国 家 标 准《 食 品 中 蛋 白 质 的 测 定》（ＧＢ／Ｔ ５００９．５－ ２０１０）给出凯氏定氮法、分光光度法 和燃烧法 ３ 种可用于食品中蛋白质的 检验方法。其中凯氏定氮法在现阶段 检测中的使用最为广泛，其具有适用 范围广，检测试验重现性好，准确度 和灵敏度高， 被测样品用量少等优点， 因此本文主要具体介绍凯氏定氮法的 步骤和原理并分析其误差。
T
echnology
科技
分析与检测
的蒸发效率和吸收程度都直接决定检 测结果的准确度。 滴定 滴定主要目的定量测量蒸馏得到 的溶液中的铵根离子。其基本原理是 利用弱碱性的硼酸铵与强酸反应生成 铵盐和硼酸。一般采用已知浓度的稀 盐酸或稀硫酸对溶液进行滴定试验， 根据消耗的 ＨＣｌ 或 Ｈ２ＳＯ４ 的量计算出蒸 馏后溶液中氨的含量，折算成样品中 氮元素的含量，从而根据蛋白质中氮 元素的比例，通过计算得到被测样品 中蛋白质的含量。 F＝６．２５。 多次测量取平均值减小偶然误差 整个测量中涉及大量试剂的配制 使用，操作与读数，各种环境因素的 干扰等，这些都会使测量中产生偶然 误差，因此在蛋白质含量的测量中， 最终测量结果需要进行多次重复性试 验，并将得到的结果取算数平均值表 示， 以 此 减 小 测 量 的 偶 然 误 差， 并 且 如 果 待 测 样 品 蛋 白 质 的 含 量 即： Ｘ ≥ １ ｇ／１００ ｇ，其结果需要保留三位 有效数字；如果待测样品蛋白质的含 量即：Ｘ ＜ １ ｇ／１００ ｇ，其结果只需要 保留两位有效数字即可。 其他含氮物质的干扰 通过凯氏定氮法的基本原理与操 作步骤可发现，使用该方法检测时， 第一步消化的本质是将样品中的氮元 素全部转化生成硫酸铵，即凯氏定氮 法测量的是被测样品中有机物中含有 氮元素的总量，因此该办法并无法消 除样品中其他有机物中含有的氮元素 对测量结果的影响，如尿素、三聚氰 胺等。当年三鹿公司使用的蛋白质检 测方法便为凯氏定氮法，最终未能检 测出原料中的三聚氰胺而导致食品安 全事件。除去样品中非蛋白质部分有 （１） 机物中氮元素对整个测量的影响，要 先去除非蛋白质中的氮元素再进行具 体测量，或用其他方法测出非蛋白质 中的氮含量，再用总氮含量减去该值 再进行折算。
凯氏定氮法测定蛋白质含量
凯氏定氮法测定蛋白质含量简介凯氏定氮法（Kjeldahl method）是一种常用的测定蛋白质含量的方法，它通过将样品中的有机氮转化为氨，然后将氨转化为氨基氮，再由氨基氮计算得出蛋白质的含量。
这个方法的优点是稳定可靠，适用于各种类型的样品。
实验原理凯氏定氮法的实验原理如下：1.样品预处理：将待测样品进行预处理，去除样品中的非氮有机物。
这样可以确保凯氏定氮方法只测定到蛋白质中的氮。
2.消化反应：将预处理后的样品与硫酸相结合，加热至沸腾。
在这个过程中，有机氮将被转化为氨。
3.碱化反应：将消化后的样品中的硫酸中和，加入过量的氢氧化钠溶液，使样品呈碱性。
4.蒸馏捕收：将碱化后的样品进行蒸馏，捕集捕集样品中的氨。
5.滴定：将捕集到的氨溶液与酸反应，使用盐酸或硫酸等强酸进行滴定，直至中和反应结束，测定出反应过程中消耗的酸的体积。
6.计算：根据滴定所消耗的酸的体积，计算出样品中的氨的量，再根据氨和蛋白质含氮的摩尔比例，计算出样品中蛋白质的含量。
实验步骤以下是凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验步骤：1.准备样品：根据实验需要，准备待测样品。
样品的选择应根据实验目的和样品的特性进行。
2.样品预处理：将样品经过细碎、研磨等处理，去除样品中的非氮有机物。
3.消化反应：将预处理后的样品与浓硫酸相结合，加热至沸腾。
消化时间一般为2小时。
4.碱化反应：将消化后的样品中的硫酸中和，加入过量的氢氧化钠溶液，使样品呈碱性。
5.蒸馏捕收：将碱化后的样品进行蒸馏，捕集捕集样品中的氨。
6.滴定：将捕集到的氨溶液与酸反应，使用盐酸或硫酸等强酸进行滴定，直至中和反应结束。
7.计算：根据滴定所消耗的酸的体积，计算出样品中的氨的量，再根据氨和蛋白质含氮的摩尔比例，计算出样品中蛋白质的含量。
实验注意事项1.在进行样品消化时，必须控制好加热温度，避免样品的溢出和烧焦。
2.在进行滴定时，应注意控制滴液的速度，避免过量的酸滴入。
3.实验过程中需注意个人安全，避免触及强酸和强碱。
凯氏定氮法测定蛋白质含量
1、按图装好凯氏定氮装置。向蒸汽发生器中的水中 加数滴甲基红指示剂、几滴H2SO4及数粒沸石
2、移取10.0ml样品消化液，经进样口注入反应室内，用 少量水冲洗进样口，然后加入10ml 50% NaOH溶液于反 应室内，塞好玻璃塞，防止氨的逸出。从开始回流记时， 蒸馏4min，移动冷凝管下口使其离开接收液面。再蒸馏， 用纯水洗冷凝管下口，洗液流入吸收液内。 三、NH3的标定 用0.05mol.L-1HCl标准溶液滴定至暗红色为终点。 四、蛋白质含量的计算 蛋白质（%）=总氮量（%）×6.25
反应式为： H2SO4==SO2+H2O+[O]
R. CH.COOH+[O]==R.CO.COOH+NH3 NH3 R.CO.COOH+[O]==nCO2+mH2O
3 2 4 4 2 ，收集于 4 2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出 NH H3BO3 溶液 3 中。
2NH +H SO ==(NH ) SO
2008年当奥运圣火熄灭以后，我国各地的新闻版 面相继都在大篇幅的报道关于“大头娃娃”的新 闻。 根据医院的诊断，这些婴儿所患的都是营养不良 综合征，而扼杀这些幼小生命的“元凶”，正是 蛋白质等营养元素指标严重低于国家标准的劣质 婴儿奶粉。
导致“大头娃娃”出现的一个原因就是我们 在食品蛋白质检验过程中存在的问题：通常 我们利用凯氏定氮法测定食品中的氮含量， 再利用以下公式计算出食品中的蛋白质含量
四．解决凯氏定氮法弊端
解决问题的根本方法，是直接测试食品中的真蛋白
质含量。因为，如果能够一次直接测定食品中真蛋白质含 量，以真蛋白质含量为标准，那么就堵住了市场监管上的 漏洞，使伪劣产品无所遁形。因此添加假蛋白质物质，如
凯氏定氮法测定蛋白质原理及操作
一、概述蛋白质是生命活动中不可或缺的重要物质，其含量的测定在生物化学研究和食品加工领域具有重要意义。
针对蛋白质含量的测定方法有许多种，其中凯氏定氮法是一种经典且常用的测定方法，本文将就凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作进行详细介绍。
二、凯氏定氮法原理1. 基本原理凯氏定氮法是通过测定样品中氨基氮的含量来间接测定蛋白质含量的方法。
蛋白质是由氨基酸构成的，而氨基酸中含有氮元素，故可以通过测定样品中氮元素的含量来推算出样品中蛋白质的含量。
2. 操作步骤（1）样品的预处理：将待测样品进行适当的预处理，通常是将样品中的有机物燃烧成气体，从而将其中的氮元素转化为氮气。
（2）氮气的收集：收集样品燃烧产生的氮气，通常是通过化学吸收剂的吸收来将氮气纯化。
（3）氮气的测定：将纯化后的氮气进行定量测定，得出氮气的含量。
（4）蛋白质含量的计算：根据氮气的含量，通过一定的计算公式来推算出样品中蛋白质的含量。
三、凯氏定氮法操作注意事项1. 样品的选择选择代表性好的样品进行测定，避免样品中含有其他干扰物质，影响测定结果的准确性。
2. 仪器的使用严格按照仪器的操作说明进行操作，保证测定过程的准确性和精确度。
3. 数据的处理对测定得到的数据进行严格的处理，计算过程中不应出现错误，以确保蛋白质含量的测定结果准确可靠。
四、凯氏定氮法测定蛋白质的优缺点1. 优点（1）测定范围广：凯氏定氮法可以适用于各种类型的样品，包括食品、饲料、生物组织等。
（2）测定结果可靠：经过严格的样品预处理和操作步骤，测定结果具有较高的准确性和精确度。
2. 缺点（1）操作繁琐：凯氏定氮法的操作步骤相对繁琐，需要较长的操作时间。
（2）不适用于含氮杂质的样品：如果样品中含有其他氮元素化合物的干扰物质，则可能影响凯氏定氮法的测定结果。
五、结语凯氏定氮法作为一种经典且常用的蛋白质测定方法，其原理和操作步骤相对简单明了，但需要严格遵守操作规范，以确保测定结果的准确性和可靠性。
蛋白质的测定—凯氏定氮法测定食品中蛋白质
食品中蛋白质的测定——凯氏定氮法
实验原理
• 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为 二氧化碳和水逸出样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵加碱蒸馏， 使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量 可计算出蛋白质的含量。
仪器
500ml凯 氏烧瓶
定氮蒸馏 装置
凯氏定氮法测食品中蛋白质的注意事项
（9）硼酸吸收液的温度不应超过40°C，如高于40°C可置于冷 水浴中。
（10）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色， 在酸性溶液中呈红色。
课后思考
• 凯氏定氮法测定 食品中蛋白质还 有哪些需要注意？
常量蒸馏按下式计算: 微量蒸馏按下式计算：
W c(V2 V1 ) 0.014 F 100 m
W c(V2 V1 ) 0.0 1 4 F 1 0 0 m 10 100
食品中蛋白质的测定——凯氏定氮法
实验步骤——计算 • 式中W—蛋白质的质量分数，%； • c—盐酸标准液的浓度，mol/L； • V1—空白滴定消耗标准液量，mL； • V2—试剂滴定消耗标准液量，mL； • m—样品质量，g； • 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； • F—蛋白质系数。
• 凯氏定氮步骤包括消化、蒸馏、 吸收、滴定、计算。
凯氏定氮法测食品中蛋白质的注意事项
（1）凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量为粗蛋白
（2）所有试剂应用无氨蒸馏水配制
（3）消化过程应注意转动凯氏烧瓶，促进消化完全 （4）若样品含脂肪或糖较多时，易产生大量泡沫可采用小火或者可加入 少量辛醇、液体石蜡或硅油等消泡剂 （5）控制消化时间 ，一般消化至透明后，继续消化30min即可，但当含 有特别难以氨化的氮化合物的样品，消化时间需适当延长；
凯氏定氮法测定食品中蛋白质
T echno logy科技工艺技术
蛋白质被认为是构成生物体细胞组织的重要成分。
食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源，具有糖类和脂肪不可替代的作用。
含氮量是蛋白质区别于其他有机化合物的重要标志。
在检验食品中蛋白质时，通常是先检定出食品中的总氮量，然后乘以蛋白铜除作为催化剂外，还可以指示消化终点的到达，有机物全部消化完全后，溶液呈现清澈的蓝绿色，硫酸铜还可以做蒸馏时碱性反应的指示剂。
蒸馏
消化液中的硫酸铵在碱性环境下会
DOI:10.16043/ki.cfs.2016.24.079。
凯氏定氮法测定蛋白质含量
凯氏定氮法测定蛋白质含量摘要：凯氏定氮法被广泛应用于测定蛋白质含量。
本文主要介绍凯氏定氮法的原理、步骤和应用，并对该方法的优缺点进行了分析和讨论。
结果表明，凯氏定氮法具有简便、灵敏度高、重现性好等优点，适用于各种样品的蛋白质含量测定。
关键词：凯氏定氮法，蛋白质含量，测定方法，优缺点引言：蛋白质是生物体内最基本的组成成分之一，对于了解生物过程、疾病诊断和治疗等方面具有重要作用。
因此，准确测定蛋白质含量对于科学研究和医学实践具有重要意义。
目前，常用的蛋白质测定方法包括比色法、光谱法、生物学活性法和凯氏定氮法等。
其中，凯氏定氮法因其简便、灵敏度高、重现性好等优点而被广泛应用。
一、凯氏定氮法的原理凯氏定氮法是基于蛋白质中含有氮元素这一特点进行测定的。
该方法的原理是将样品中的蛋白质完全燃烧后，收集生成的氮气，并用浓碱溶液吸收氮气生成氨水。
然后使用酸滴定法测定可滴定酸的用量，从而间接计算出样品中蛋白质的含量。
二、凯氏定氮法的步骤凯氏定氮法的步骤主要包括样品的预处理、加热燃烧、氨水吸收和酸滴定等。
1. 样品的预处理：将待测样品称取适量，根据样品的特性选择适当的方法进行分解或加热处理，以使蛋白质完全释放出来。
2. 加热燃烧：将经过预处理的样品放入燃烧器中，加热到适当温度，使样品中的蛋白质完全燃烧产生氮气。
3. 氨水吸收：将生成的氮气通过吸收瓶中的浓碱溶液，生成氨水。
氨水的生成量与样品中蛋白质的含量成正比。
4. 酸滴定：用标准酸溶液滴定氨水中的可滴定酸，测定可滴定酸的用量，进而计算出样品中蛋白质的含量。
三、凯氏定氮法的应用凯氏定氮法广泛应用于生物化学、食品科学、环境监测等领域的蛋白质含量测定。
其应用范围包括但不限于以下几个方面：1. 食品科学：凯氏定氮法可以用于测定食品中的蛋白质含量，包括肉类、豆类、谷物等。
2. 生物化学：凯氏定氮法可用于测定细胞培养基中蛋白质的含量，用于生物过程的研究和细胞培养的质量控制。
3. 环境监测：凯氏定氮法可用于测定水样中蛋白质的含量，用于环境污染的监测和评价。
凯氏定氮法测定蛋白质含量
半微量凯氏定氮法测定蛋白质含量(一)方法原理样品与硫酸一同加热消化, 分解有机质, 释放出的NH3 与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中。
在定氮消化瓶中,用氢氧化钠中和硫酸铵生成氢氧化铵,加热又分解NH3 ,用硼酸吸收, 用标定过的盐酸或硫酸滴定, 从而计算出总氮量, 换算为蛋白质量。
(二) 仪器、设备1. 仪器分析天平: 感量0.0001克；实验用粉碎机；半微量凯氏蒸馏装置；半微量滴定管, 容积10毫升；硬质凯氏烧瓶: 容积25毫升, 50毫升；锥形瓶: 容积150毫升；电炉: 600瓦。
2. 试剂(1) 盐酸: 分析纯, 0.02mol/L, 0.05mol/L标准溶液(邻苯二甲酸氢钾法标定)；(2) 氢氧化钠: 工业用或化学纯, 40%溶液(W/V)；(3) 硼酸: 分析纯, 2%溶液(W/V)；(4) 硼酸混合指示剂: 溴甲酚绿0.1克, 甲基红0.1克分别溶于95%乙醇中,混合后稀至100毫升, 将混合指示剂与2%硼酸溶液按 1:100比例混合, 用稀酸或稀碱调节PH值为4.5, 使呈灰紫色, 此溶液放置时间不宜过长, 需在1个月之内使用；(5) 加速剂: 五水合硫酸铜(分析纯)10克, 硫酸钾(分析纯)100克在研钵中研磨, 仔细混匀, 过40目筛；(6) 浓硫酸: 比重1.84, 无氮；双氧水: 分析纯,30%；蔗糖: 分析纯；(7) 双氧水硫酸混合液(简称混液): 双氧水、硫酸、水的比例为3:2:1, 即在100毫升蒸馏水中,慢慢加入200毫升浓硫酸, 待冷却后, 将其加入300毫升30%双氧水, 混匀, 此混液可一次配制500～1000毫升贮藏于试剂瓶中备用, 夏天最好放入冰箱或阴凉处贮藏, 室温(20℃)上下时不必冷藏, 贮藏进间不超过1个月。
(三) 操作步骤1. 样品的选取和制备选取有代表性的种子(带壳种子需脱壳)挑拣干净, 按四分法缩减取样, 取样量不得少于20克。
将种子放于60～65℃烘箱中干燥8小时以上, 用粉碎机磨碎, 95%通过40目筛, 装入磨口瓶备用。
食品中蛋白质含量测定(凯氏定氮法,Kjeldahl Method)
食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法，Kjeldahl Method）一、目的与要求1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。
2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。
二、实验原理蛋白质是含氮的化合物。
食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。
因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。
三、仪器与试剂（一）试剂1、硫酸铜（CuSO4·5H20）2、硫酸钾3、硫酸（密度为1.8419g/L）4、硼酸溶液（20g/L）5、氢氧化钠溶液（400g/L）6、0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。
7、混合指示试剂：0.1%甲基红乙溶液液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。
8、黄豆粉。
（二）仪器微量定氮蒸馏装置：如图3- 所示。
图3-微量凯氏定氮装置1、电炉；2、水蒸气发生器（2L平底烧瓶）；3、螺旋夹a；4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；5、反应室；6、反应室外层；7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。
四、实验步骤1、样品消化称取黄豆粉约0.3g（±0.001g），移入干燥的100mL凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。
试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。
食品中蛋白质的测定
食品中蛋白质的测定一、目的对公司产品中的蛋白质测定制定标准操作规程，检验室操作人员按本规程操作，保证公司产品中的蛋白质检测结果准确。
二、范围本操作规范适用于食品中蛋白质的测定。
三、依据GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》，第一法凯氏定氮法。
四、实验原理食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量计算氮含量，再乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
五、仪器与试剂配制1、高温炉：凯氏定氮仪。
2、分析天平：感量为1mg 。
3、硼酸溶液（20g/L ）：称取20g 硼酸，加水溶解后并稀释至1000mL 。
4、氢氧化钠溶液（400g/L ）：称取40g 氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100mL 。
5、硫酸标准滴定溶液[c （21H 2SO 4）]0.0500mol/L 或盐酸标准滴定溶液[c （HCl ）]0.0500mol/L 。
6、甲基红乙醇溶液(1g/L):称取0.1g 甲基红,溶于95%乙醇,用95%乙醇稀释至100mL 。
7、亚甲基蓝乙醇溶液(1g/L):称取0.1g 亚甲基蓝,溶于95%乙醇,用95%乙醇稀释至100mL 。
8、溴甲酚绿乙醇溶液(1g/L):称取0.1g 溴甲酚绿,溶于95%乙醇,用95%乙醇稀释至100 mL 。
9、A 混合指示液:2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合。
10、B 混合指示液:1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。
本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的三级水。
六、实验步骤1、自动凯氏定氮法称取充分混匀的固体试样0.2g 2g 、半固体试样2g 5g 或液体试样10 g 25 g(约当于30mg 40mg 氮),精确至0.001 g,至消化管中,再加入0.4g 硫酸铜、6g 硫酸钾及20mL 硫酸于消化炉进行消化。
用凯氏定氮法测定食品中的蛋白质含量
２ 分析过 程
试样制备 ： 固体样品 ： 取有代表性的样品至少 ２ ０ ， ０ ｇ 用研
圉
新 疆 孳教 业
钵捣碎 、 研细 ； 易捣碎 、 细 的样 品应切 （ ） 不 研 剪 成细粒 ； 干固 体样 品用 粉碎机粉碎 ； 液体 样 品 ： 充分混匀 的液 体样 品至 取 少 ２ ０ 。粉状样品 ： ０ｇ 取有代 表性 的样 品至少 ２０ （ ｌ ０ ｇ ￣ 粉粒较 ／ ｌ 大也应用研钵 研细 ）混合 均匀 ； 状样 品： ， 糊 取有代 表性 的样 品至少 ２ ０ ， ０ ｇ混合均匀 ； 固液体样 品 ： 固、 按 液体 比例 ， 取有代
的蛋 白质 系数而求 出蛋 白质的含量 ， 此法 的结果称为粗蛋 白
实验 室常规仪器及下列各项 ： 凯 氏烧瓶 ：０ｒｌ可调式 电炉 ； 汽蒸馏装 置 ； 肉机 ： ５Ｏ ； ａ 蒸 绞
篦孔 径不超过 ｉ ｔ； ｎ 组织捣碎机 ； ｏ 粉碎机 ； 研钵 ： 玻璃或瓷质 ； 化学消化器 ； 氏定氮仪； 凯 空气滤过器。
转化为氨与硫 酸结合成硫酸铵 。 然后取消化液的 １ ０ ／ 加碱蒸 １ 馏 ， 氨 蒸 出 ， 硼酸 吸收后 再 以标 准盐 酸 或硫 酸溶 液滴 使 用 定四 。根据标 准酸 消耗量可计算 出蛋 白质的含量。包括消化、
蒸馏 、 吸收 、 滴定 ４ 个步骤。
１ ． 全量 凯 氏定 氮 法 ．２ ２
１２ 试 验 方 法 ．
１２ １ 微 量 凯 氏定 氮 法 ．．
质含量 ： 由于样品中含有少量非蛋 白质含氮化合物 ， 如核酸 、 生物碱 、 氮类脂 、 含 卟啉 以及含氮 色素等非蛋 白质的含氮化 合物． 氏定氮法是测定总有机氮量较为准确 、 作较为简单 凯 操
食品蛋白质测定中凯氏定氮法凯氮测定回收率试验
4.3当三角瓶内溶液达到150 mL左右时，降低定氮仪的接收台，使定氮仪蒸馏出口导管脱离接收液液面。用蒸馏水冲洗蒸馏出口导管，再蒸馏1min后，停止蒸馏。
4.4用硫酸标准滴定溶液滴定，记下滴定体积。
100.7
17
20.35
15
14.993
99.95
18
20.36
15
15.001
100.0
19
20
27.10
20
20.004
100.0
0.07%
20
27.20（舍）
20
20.078
100.4
21
27.12
20
20.018
100.1
22
27.10
20
20.004
100.0
注：表中数据按4d法取舍
计算样液中氮含量时以吸取样品体积为0mL作为空白v0。
4.5同时做空白实验一个。
5．结果计算
v0=0.05ml，v1=4.38ml，v2=4.39ml
0.09690×（4.38-0.05）×0.01401
N1%= ———————————————×100=20.97
0.5607×25/500
0.09690×（4.38-0.05）×0.01401
N2%= ———————————————×100=21.02
10
6.90
5
5.0102
100.2
11
10
13.60
10
9.9833
99.83
0.74%
12
凯氏定氮法测定蛋白质的方法分析
凯氏定氮法测定蛋白质的方法分析作者：李杉杉来源：《现代食品》 2018年第21期摘要：凯氏定氮法是最常用的蛋白质检测方法之一，在实际检测过程中会出现消化时间长、易起泡、易结晶等问题，本文针对这些问题提出相应的解决方法。
关键词：凯氏定氮法；蛋白质；检测；解决方法蛋白质在生物体内非常重要，几乎参与所有的生命活动，蛋白质不仅与新陈代谢、免疫和生物进化有很大关系，而且还提供很多信息。
蛋白质含量常作为衡量食品中营养价值高低的一项重要指标，因此蛋白质含量的检测在食品分析中尤为重要，一直以来都是研究的热点。
根据GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》，在食品中蛋白质的测定方法有凯氏定氮法、分光光度法和燃烧法[1]。
虽然凯氏定氮法操作复杂、试剂消耗大，但其测试结果准确性和重现性好，是目前测定有机化合物含氮量最常用，也是最经典的方法之一[2]。
本文分析凯氏定氮法在实际操作中存在的问题。
1 测定原理及仪器1.1 测定原理凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法[3]，在食品中的蛋白质在催化剂催化并加热条件下，蛋白质分解后的产物氨与硫酸结合生成硫酸铵。
碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收游离氨后以标准硫酸或标准盐酸滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量[4]。
1.2 仪器与试剂（1）仪器。
天平、定氮蒸馏装置、自动凯氏定氮仪和消化炉。
（2）试剂。
硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂、亚甲基蓝指示剂、氢氧化钠和95% 乙醇。
2 测定方法优点及存在的问题2.1 测定方法优点2.1.1 准确度高凯氏定氮的测定结果相对准确，重现性好，在国内各大检验机构中比较普及。
2.1.2 灵敏度低，抗干扰凯氏定氮法的灵敏度低、干扰少，适用于0.2 ～ 1.0 mg 氮，误差为（±2%），且样品使用量少[5]。
2.1.3 应用广泛凯氏定氮法应用很广泛，几乎适用所有形态的食品，对于一些类似于不溶解的样品，也能适用凯氏定氮法测定蛋白质。
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1
2
样品与浓硫酸和催 化剂一同加热消化， 使蛋白质分解，其 中碳和氢被氧化为
二氧化碳和水逸出
样品中的有机氮 转化为氨与硫酸
结合成硫酸铵
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3
加碱蒸馏，使氨 蒸出，用硼酸吸 收后再以标准盐
酸溶液滴定
2.实验步骤
消化 蒸馏
吸收、滴定
计算
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第一步：样品消化
样品与浓硫酸加热消化，硫酸使有机物脱水 并破坏有机物，C、H氧化为二氧化碳、水逸出，蛋 白质分解为氨、与硫酸结合生成硫酸铵、留在溶液 中
性质的数值曲线。
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2.标准曲线绘制
（1）配置一定浓度（10mg/ml）的蛋白质标准溶液； （2）分别量取4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、
10ml蛋白质标准液于7支50ml比色管中； （3）向上述7支试管中分别加入1ml四氯化碳后、用
碱性酒石酸铜溶液稀释至50ml，振最摇终、测静定止1h； 溶液中不能有
来构成自身的蛋
白质
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2 维持酸碱平衡、 水平衡
4 维持物质的代 谢及运转
6
营养指标、
食品生产工艺
指标。
常见食物中蛋白质的含量
螺旋藻
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牛肉
5
常见食物氮系数
氮系数：蛋白质含氮量的倒数，常用6.25表示。
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6
蛋白质测定方法
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7
二、凯氏定氮法测定蛋白质（粗蛋白）
凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应 的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。
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19
吸收液变蓝色后继 续蒸馏5分钟，将冷 凝管尖端提离液面 再蒸馏1min，用蒸 馏水冲洗冷凝管尖 端，取下接收瓶， 关闭电源
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20
（3）滴定
取下接收瓶，用0.1000mol/L的盐酸或硫酸 标准溶液滴定至终点。
滴定前
滴定终点
同时做一试剂空白实验，记精品录文档空白滴定消耗盐酸的体积。21
通入蒸汽开始蒸馏
取10ml消化稀释液沿小玻璃杯移入反 应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻 璃塞，向小玻璃杯内加入10ml40%NaOH, 提起玻璃塞，使NaOH缓慢流入反应室， 立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加 水使之密封。
加入NaOH溶液后颜色 为深蓝色或褐色
冷凝管下口浸入 硼酸溶液中
加10ml硼酸溶液和 混合指示剂2～3d
消化
对原子的前处理，使被测物质进入 溶液中，使不溶变为可溶、有机物分解 为可溶性无机物
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（1）消化
总反应式：
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%）
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11
消化装置 “自动回流消化仪”
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定氮消化的不同状态
C2uSO 42H2SO 42Cu4SO 2H2OS02
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第二步——蒸馏
(NH4)2SO4+2NaOH→NH3+Na2SO4+2H2O
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注意事项：
氢氧化钠需过量、若不够，会生成
01
H2S,H2S是强酸，会使溶液颜色变红
02
防止样液中氨气逸出。
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(3）吸收与滴定
吸收：加热蒸馏所放出的氨，硼酸溶液 滴定：盐酸标准溶液，
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凯氏定氮法 测定食品中蛋白质
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一、概述
蛋白质是以氨基酸为最小构成单元的大分子
的含氮化合物，它是由20种氨基酸通过酰氨键
以一定方式结合，并具有一定的空间结构。
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3
生理功能及在食品中的作用
1 生命的物质基 础
3 遗传信息的表 达方式
人及动物需要从 5
食品得到蛋白质
及其分解产物，
仪器：
消化炉
自动蒸 馏装置
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25
1、原理及适用范围 2、特点：
（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶， 红外线加热的消化炉。
（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟 可消化完毕。
（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定， 自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录， 12分钟完成1个样。
2 N3 H 4 H 3 B3 O (N4 )2 H B 4 O 7 5 H 2 O (N4 )2 H B 4 O 7 5 H 2 O 2 H C 2 Nl4 C H 4 lH 3 B3O
硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8×10-10），用酸滴定不影响 指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用 硫酸、盐酸溶液也可用作吸收剂。
消泡 碳化
澄清
RCH2(NH2)COOH+H2SO4→精品C文O档 2+H2O+SO2+ (NH4）2SO4
消化过程中试剂作用
硫酸钾：提高溶液沸点、加快反应进程；
K 2 SO 4 H 2 SO 4 2 KHSO 4
硫酸铜（蓝绿色）：催化作用
褐色
2Cu4S OC2uSO 4SO 2O2
C2Cu4S OC2uSO 4SO 2CO 2
（4）取上清液在2000r/min离心沉5m淀in、560nm测定 吸光度，绘制标准曲线。
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3.样品测定
样品含量需在40-100mg内。
4.结果计算（mg/100g）
X m100 m1
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30
燃烧法
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双缩脲法（分光光度法）
1.原理——双缩脲反应
碱性条件下、双缩脲与硫酸铜作用生成紫红色配 合物的反应。
KOH、CuSO4、
肽键（-CO-NH-）与双缩酒置脲石结酸构钾相钠似配、能呈现此
反应。
560nm处、由颜色深浅判定蛋白质含量多少。
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标准曲线
标准曲线（standard curve）是指通过测定一系 列已知组分的标准物质的某理化性质，而得到的
实验注意事项—消化
（1）不时转动凯氏烧瓶、缓和沸腾消化 （2）消化至呈透明后，继续消化30分钟，一般消化
时间约4小时 （3）可加如少量辛醇、硅油做消泡剂 （4）样品不易澄清时可冷却后加入30%过氧化氢2-
3ml
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22
小结
精品文档
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24
自动凯氏定氮仪法
在凯氏定氮法的基础上发展起来的自动凯氏 定氮仪法，具有安全、高效、准确的优点。
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各步骤操作细节图解：
样品消化→蒸馏→滴定 （1）样品消化
盖上小漏斗
瓶口不能对着人
先小火炭化，无泡沫 后，加大火力，液体 变蓝绿透明，继续加
热微沸30分钟
样品+0.4g硫酸 铜+6g硫酸钾 消+化20终m点l浓硫酸+
玻珠数粒
45度角
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18
（2）蒸馏
将消化液全部转移 到100ml容量瓶中