药学基础实验-细胞和免疫学技术实验部分思考题

以计数酵母菌为例

(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数.

(2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4-5

个酵母细胞为宜,一般稀释10倍即可.

(3)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖专用的厚玻

片.

(4)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌

液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血

球计数室内.

(5)计数时,如果使用16格×25格规格的计数室,要按对角线位,取左上,右上,左下,右下4个中格(即100个小格)的酵母菌数.如果规格为25格×16格的计数板,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数.

(6)当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左方线上的酵母细胞).

(7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数.

3.计算公式

(1)16格×25格的血球计数板计算公式:

酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数/100×400×10四次方×稀释倍数

(2)25格x16格的血球计数板计算公式:

酵母细胞数/ml=80小格内酵母细胞个数/80×400×10四次方×稀释倍数

思考题：

试验43:动物细胞的原代培养

1．如何提高原代细胞培养的成功率?（就是注意事项）1．培养材料的选择，尽量选取胚胎或幼小的生物体组织或者繁殖能力较强的组织，如肿瘤组织等。2．要注意无菌操作，其要求应高于外科手术。3．整个取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡酒精时间不能过长，以保证胚胎细胞活性。4．运用消化法时胰酶温度应低于37~C，浓度只需平时消化细胞浓度的一半。因为此过程不像消化培养细胞时的1－10 min，而是至少20 min，先消化下来的细胞在此胰酶消化液中可存活10 min以上。如果胰酶作用过强，则这些细胞易被损伤不易生存。5．如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时再使之与培养基接触，勿使组织块漂浮起来。如果组织块没有贴壁，则细胞不易生长，即使生长也因没有贴在瓶壁上而无法收集到。

2．为克服微生物污染采取了哪些措施?1.器皿准备中的预防：用于细胞培养的器皿应该严格消毒，做到真正洁净；应该无菌的物品，要做到消毒严格、真正无菌2操作过程中的预防；主要包括：超净台内放置的所有培养瓶瓶口不能与风向相逆，不允许用手触及器皿的无菌部分，如瓶口和瓶塞内侧；在安装吸管冒、开启或封闭瓶口操作时要经过酒精灯烧灼，并在火焰附件工作；吸取培养液、细胞悬液等液体时，应专管专用，防止污染扩大或造成培养物的交叉污染；使用培养液前，不易较早开启瓶口；开瓶后的培养瓶应保持斜位，避免直立；不再使用的培养液应立即封口；培养的细胞在处理之前不要过早的暴露空气中；

实验44 传代细胞的培养

1 细胞传代培养的目的是什么：

是组织培养常规保种方法之一，可以获得大量实验所需的细胞。

2 如何保证在传代过程中不被微生物污染

尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。如发现污染，一般弃置污染细胞，如必须挽救可加含有抗生素的培养基反复清洗，随后培养基中加入大量的抗生素，并经常更换培养基。

实验46 动物细胞的冻存与复苏

1 如何运用“缓慢冻存，快速复苏”的原理保存细胞

冻存管在4℃冰箱中存放30分钟，转放-20℃冰箱中1.5~2h，再转入-80℃冰箱中 4~12h后转移到液氮中（-196℃）保存。复苏时直接放进37℃水浴锅中。

2 冻存液的作用：保护细胞，可是溶液冰点降低，加之在缓慢冻结下，细胞内水分透出，减少了冰晶形式，避免细胞损伤。

实验50 淋巴细胞转化实验

1 试比较淋巴细胞转化实验的优缺点

╮(╯▽╰)╭我不知道

2 淋巴细胞转化试验有何意义？

淋巴细胞转化率的高低反映机体的细胞免疫水平可作为测定机体免疫功能的指标之一。淋巴细胞转化试验不但可作为变态反应性疾病和免疫缺陷性疾病的辅助诊断，还可用于自身免疫性疾病和肿瘤病因的研究以及预后判断。一般情况下新生儿淋巴细胞转化率稍高，老年人偏低。

实验51 琼脂免疫扩散实验

1 双向免疫扩散试验主要用于哪些方面。

双向免疫扩散可根据沉淀线的位置、数量、形状以及对比关系，对抗原或抗体进行定性分析，常用于抗原和抗体的纯度鉴定以及抗体效价测定。

该方法简便易行，结果稳定可靠，临床曾用于诊断和分析某些疾病，如检测AFP、HBsAg等。但敏感度较低，试验所需时间较长，只能定性，不能定量，仅适用于大量普查项目。

2 为什么抗原、抗体要选择适当比例？

抗原抗体反应有一个平衡,浓度不合适,影响免疫复合物的形成。在比例适当处可形成可见的沉淀线。

53 酶联免疫吸附试验 ELISA

1 ELISA有哪些类型，其原理各是什么？

（1）双抗体夹心法。。。原理：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结合，则属于双位点夹心法。若采用固相载体上的抗原和酶标抗原

分别与样品中被检测抗体分子结合，则是双抗原夹心法。

（2）间接法原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体，如羊抗人IgG 抗体)与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。

（3）竞争法可用于抗原和小分子半抗原的定量测定，也可对抗体进行检测。已测抗体为例，使待测抗体和酶标抗体竞争与固相抗原结合，结果如待测抗体含量越多，与固相抗原结合的酶标抗体就越少，显色越浅，二者呈负相关。

（4）捕获法（亦称反向间接法）ELISA，主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定。原理设计为：先将针对IgM的第二抗体（如羊抗人IgMμ链抗体）连接于固相载体，用以结合（“捕获”）样品中所有IgM（特异或非特异），洗涤出去IgG等无关物质，然后加入特异抗原与待检IgM结合；再加入抗原特异的酶标抗体，最后形成固相二抗- IgM-抗原-酶标抗体复合物，加酶底物作用显色后，即可对样品中待检IgM是否存在及其含量进行测定。

2 可能影响ELISA 试验结果的因素有哪些？

（1）试剂的选择（2）加样，可能原因：1）血清或血浆标本分离不好即进行加样；2）手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)；3）加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。（3）孵育，可能原因：

1)孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；

2)孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。（4）洗板，可能原因：1)采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉2)采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。3)反应板过多造成洗板等待时间长。（5）显色，可能原因：1)显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂；2) 加显色剂时溅出孔外造成液体回流。（6）终止，可能原因如加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。所以在加终止液时应避免产生气泡。（（7）读板，如读板时板底不清洁等。应保证酶标板清洁。

3 试述ELISA技术的应用

ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。酶免疫试验（EIA）结合光学显微镜或电子显微镜可进行抗原定位与结构的研究，用酶标记抗原或抗体结合免疫扩散及免疫电泳可提高试验的敏感性。在实际应用方面可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病学及传染病学等方面密切相关。

54 T淋巴细胞E-玫瑰花形试验

1 简述E-玫瑰花形试验原理

由于人和动物的T细胞表面有绵羊红细胞受体，因此红细胞可以附到T细胞的周围，形成玫瑰花样的细胞团，而B细胞表面没有绵羊红细胞受体，不能形成玫瑰花环，因此可以用该方法鉴别T、B淋巴细胞，以及从血液中分离纯化T细胞。

2 常用的淋巴细胞的分离方法有哪些？

1.纯淋巴细胞群的采集：①粘附贴壁法；②吸附柱过滤法；③磁铁吸引法。

2.淋巴细胞亚群的分离原则①E花环沉降法；②尼龙毛柱分离法；③亲和板结合分离法；④磁性微球分离法及荧光激活细胞分离仪分离法。