(种子学课件)种子超低温贮藏
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2.冷冻和解冻技术 不同种子的冷冻和解 冻特性有差异，需分别探讨，以掌握合 适的降温和升温速度。
3.包装材料的选择 根据报道，包装材料 有牛皮纸袋，铝箔复合袋等。有的包装 材料能使种子与液氮隔绝，如种子与液 氮直接接触，有些种子会发生爆裂现象， 而影响种子的寿命。
4.添加冷冻保护剂 常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜 (DMSO)、甘油、PEG等，也有报道脯氨酸的效果很好。 使用冷冻保护剂的量应是足够起到冷冻保护作用，但 又不超过渗透能力和中毒的界限。 （渗透性冷冻保护剂主要包括二甲基亚砜、甘油、聚乙二 醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞 冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外 产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电 解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤， 同时细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱 水皱缩。在使用渗透性冷冻保护剂时，需要一定时间 进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作 用。)
二、不同种类种子对液氮低温反应的差异
根据种子对液氮低温的反应，将种 子分为三种类型(Stanwood，1985)：①忍 耐 干 燥 又 忍 耐 液 氮 的 种 子 (desiccationtolerant LN2-tolerant seed)；②忍耐干燥对 液氮敏感的种子(desiccation-tolerant LN2sensitive seed)'③对干燥和液氮均敏感的 种 子 (desiccation-sensitive LN2-sensitive seed)。
种子含水量超过HMFL，冷冻到一定 温度，种子死亡。例如，小麦种子含水 量高于26．8％，冷冻到-7℃则发芽率下 降到25％(表2)。根据试验，小麦种子含 水 量 为 5.7 ％ ～ 16.4 ％ ， 在 液 氮 温 度 (196℃) 冷 冻 保 存 24 个 月 之 后 发 芽 率 仍 在 92%～96%，同对照相比没有明显差异。
2.种子超低温贮藏的应用和意义
这种保存方式不需要机械空调设备 及其他管理，冷源是液氮，容器是液氮 罐，设备简单，保存费用只相当于种质 库保存的1／4。液氮保存的种子不需要 特别干燥，一般收获后，常规干燥即可， 也能省去种子的活力监测和繁殖更新， 是一种省事、省工、省费用的种子低温 保存新技术。适合于长期保存珍贵稀有 种质。
2.忍耐干燥对液氮敏感的种子
许多果树和坚果类作物如李属、胡桃属、榛属
和咖啡属的植物种子属于这种类型。这类种子 多数能干燥到含水量10％以下，但是不能忍耐40℃以下的低温。例如榛子含水量可降到6％， 冷冻到0～-20℃不失去生活力。但是当温度降低 到-40℃以下种子生活力受损。忍耐干燥对液氮 敏感的种子多数含有较高的贮存类脂(如脂肪等)， 有的种含量高达60％～70％。含油量是否是引 起种子对液氮敏感的因素，尚不清楚。这类种 子的寿命一般少于5年。研究这类种子的保存技 术非常必要。因为这类种子多属于主要经济作
物种，目前还只能无性保存。如果建立了超低
温冷冻保存技术，可改进这类植物种质长期保 存的方法从而改良育种和繁殖技术。
3.对干燥和液氮均敏感的种子 这类种子就是顽拗型种子，它们的
寿命很短，难以保存。
三、种子超低温贮Hale Waihona Puke Baidu的技术关键
1.寻找适合液氮保存的种子含水量 只有 在合适的含水量范围内，种子才能在液 氮内存活。
(种子学课件）种子超低温贮藏
一、种子超低温贮藏的概念和意义
1.种子超低温贮藏的概念
种子超低温贮藏是指利用液态氮(196℃)为冷源，将种子等生物材料置于 超低温下(一般为-196℃)，使其新陈代谢 活动处于基本停止状态，而达到长期保 持（种子）寿命的贮藏方法。
在 -196℃ 低 温 下 ， 原 生 质 、 细 胞 、 组织、器官或种子代谢过程基本停止并 处于“生机暂停”的状态，大大减少或 停止了与代谢有关的劣变，从而为“无 限期”保存创造了条件。
表1 不同含水量种子经LN2保存7天后的发芽率（石思信等，1985）
适 合 于 冷 冻 保 存 的 最 高 含 水 量 (high moisture freezing limits，HMFL)就是种子 含水量的临界值。在同一植物种中这个
临界值有一个不大的变动范围，但是植 物种间有明显的差异(表2)。
表2 几种作物种子冷冻时含水量的临界值
较多的研究报道认为，冷冻和解冻速率对多数
植物种子冷冻到液氮温度影响不大。然而莴苣 和芝麻种子却不一样。Roos(1981)用莴苣种子 做试验，其含水量接近于HMFL值即19％，发 现用200℃／min的速率冷冻几乎百分之百的成 活，若用22．2℃／min或更低的速度冷冻，生 活力明显下降。水分非常低的芝麻种子以1～ 30℃／min缓慢冷却时，几乎100％存活而不受 水分的影响。但以200℃／min冷冻时，种子生
5.解冻后的发芽方法 经液氮贮存后种子的 发芽方法是一个容易被研究者忽视的问 题，液氮保存顽拗型种子难以成功，可 能与保存后的发芽方法不当有关，致使 还有生活力的种子在发芽过程中受损伤 或死亡。如茶籽在超低温保存后，最适 发芽方法是在5％水分(W／Ⅳ)沙床中于 5℃土1℃预吸处理15d，然后移到25℃发 芽。预处理后的种子，细胞膜修复能力 增强，渗漏物减少，发芽率提高(Hu等， 1994)。
1.忍耐干燥和液氮的种子
多数农作物，园艺作物种子都能忍 耐干燥和液氮低温。目前，已有许多研 究者成功地将这类种子冷却到液氮温度， 再回升到室温，不损害种子生活力。但 是外在因素如冷冻解冻速度，种子含水 量等能影响种子对液氮的反应。
种子含水量过高在冷冻和解冻过程 中死亡，含水量过低又会导致种子生活 力的部分丧失。不同的植物种种子都有 一个适宜的含水量范围。
活力随含水量下降而下降。冷冻速率对种子生
活力的影响同种子含水量有关，假如种子含水
量在适宜范围内，则慢速或快速冷冻对多数种 子的成活率没有明显影响。
在冷冻和解冻过程中，由于温度的剧烈变 化，种子要经受极大的物理压力。如果 种子的细胞间质承受不了这种压力，就 会产生物理损伤。当种子在回升到室温 之前在液氮蒸汽上停留一段时间可减少 损伤，因此损伤产生在冷冻和解冻过程 中。当种子只暴露在液氮气相中（约150 ℃），种子没有损伤，小部分损伤发 生在-150 ℃~-196 ℃之间。
3.包装材料的选择 根据报道，包装材料 有牛皮纸袋，铝箔复合袋等。有的包装 材料能使种子与液氮隔绝，如种子与液 氮直接接触，有些种子会发生爆裂现象， 而影响种子的寿命。
4.添加冷冻保护剂 常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜 (DMSO)、甘油、PEG等，也有报道脯氨酸的效果很好。 使用冷冻保护剂的量应是足够起到冷冻保护作用，但 又不超过渗透能力和中毒的界限。 （渗透性冷冻保护剂主要包括二甲基亚砜、甘油、聚乙二 醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞 冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外 产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电 解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤， 同时细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱 水皱缩。在使用渗透性冷冻保护剂时，需要一定时间 进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作 用。)
二、不同种类种子对液氮低温反应的差异
根据种子对液氮低温的反应，将种 子分为三种类型(Stanwood，1985)：①忍 耐 干 燥 又 忍 耐 液 氮 的 种 子 (desiccationtolerant LN2-tolerant seed)；②忍耐干燥对 液氮敏感的种子(desiccation-tolerant LN2sensitive seed)'③对干燥和液氮均敏感的 种 子 (desiccation-sensitive LN2-sensitive seed)。
种子含水量超过HMFL，冷冻到一定 温度，种子死亡。例如，小麦种子含水 量高于26．8％，冷冻到-7℃则发芽率下 降到25％(表2)。根据试验，小麦种子含 水 量 为 5.7 ％ ～ 16.4 ％ ， 在 液 氮 温 度 (196℃) 冷 冻 保 存 24 个 月 之 后 发 芽 率 仍 在 92%～96%，同对照相比没有明显差异。
2.种子超低温贮藏的应用和意义
这种保存方式不需要机械空调设备 及其他管理，冷源是液氮，容器是液氮 罐，设备简单，保存费用只相当于种质 库保存的1／4。液氮保存的种子不需要 特别干燥，一般收获后，常规干燥即可， 也能省去种子的活力监测和繁殖更新， 是一种省事、省工、省费用的种子低温 保存新技术。适合于长期保存珍贵稀有 种质。
2.忍耐干燥对液氮敏感的种子
许多果树和坚果类作物如李属、胡桃属、榛属
和咖啡属的植物种子属于这种类型。这类种子 多数能干燥到含水量10％以下，但是不能忍耐40℃以下的低温。例如榛子含水量可降到6％， 冷冻到0～-20℃不失去生活力。但是当温度降低 到-40℃以下种子生活力受损。忍耐干燥对液氮 敏感的种子多数含有较高的贮存类脂(如脂肪等)， 有的种含量高达60％～70％。含油量是否是引 起种子对液氮敏感的因素，尚不清楚。这类种 子的寿命一般少于5年。研究这类种子的保存技 术非常必要。因为这类种子多属于主要经济作
物种，目前还只能无性保存。如果建立了超低
温冷冻保存技术，可改进这类植物种质长期保 存的方法从而改良育种和繁殖技术。
3.对干燥和液氮均敏感的种子 这类种子就是顽拗型种子，它们的
寿命很短，难以保存。
三、种子超低温贮Hale Waihona Puke Baidu的技术关键
1.寻找适合液氮保存的种子含水量 只有 在合适的含水量范围内，种子才能在液 氮内存活。
(种子学课件）种子超低温贮藏
一、种子超低温贮藏的概念和意义
1.种子超低温贮藏的概念
种子超低温贮藏是指利用液态氮(196℃)为冷源，将种子等生物材料置于 超低温下(一般为-196℃)，使其新陈代谢 活动处于基本停止状态，而达到长期保 持（种子）寿命的贮藏方法。
在 -196℃ 低 温 下 ， 原 生 质 、 细 胞 、 组织、器官或种子代谢过程基本停止并 处于“生机暂停”的状态，大大减少或 停止了与代谢有关的劣变，从而为“无 限期”保存创造了条件。
表1 不同含水量种子经LN2保存7天后的发芽率（石思信等，1985）
适 合 于 冷 冻 保 存 的 最 高 含 水 量 (high moisture freezing limits，HMFL)就是种子 含水量的临界值。在同一植物种中这个
临界值有一个不大的变动范围，但是植 物种间有明显的差异(表2)。
表2 几种作物种子冷冻时含水量的临界值
较多的研究报道认为，冷冻和解冻速率对多数
植物种子冷冻到液氮温度影响不大。然而莴苣 和芝麻种子却不一样。Roos(1981)用莴苣种子 做试验，其含水量接近于HMFL值即19％，发 现用200℃／min的速率冷冻几乎百分之百的成 活，若用22．2℃／min或更低的速度冷冻，生 活力明显下降。水分非常低的芝麻种子以1～ 30℃／min缓慢冷却时，几乎100％存活而不受 水分的影响。但以200℃／min冷冻时，种子生
5.解冻后的发芽方法 经液氮贮存后种子的 发芽方法是一个容易被研究者忽视的问 题，液氮保存顽拗型种子难以成功，可 能与保存后的发芽方法不当有关，致使 还有生活力的种子在发芽过程中受损伤 或死亡。如茶籽在超低温保存后，最适 发芽方法是在5％水分(W／Ⅳ)沙床中于 5℃土1℃预吸处理15d，然后移到25℃发 芽。预处理后的种子，细胞膜修复能力 增强，渗漏物减少，发芽率提高(Hu等， 1994)。
1.忍耐干燥和液氮的种子
多数农作物，园艺作物种子都能忍 耐干燥和液氮低温。目前，已有许多研 究者成功地将这类种子冷却到液氮温度， 再回升到室温，不损害种子生活力。但 是外在因素如冷冻解冻速度，种子含水 量等能影响种子对液氮的反应。
种子含水量过高在冷冻和解冻过程 中死亡，含水量过低又会导致种子生活 力的部分丧失。不同的植物种种子都有 一个适宜的含水量范围。
活力随含水量下降而下降。冷冻速率对种子生
活力的影响同种子含水量有关，假如种子含水
量在适宜范围内，则慢速或快速冷冻对多数种 子的成活率没有明显影响。
在冷冻和解冻过程中，由于温度的剧烈变 化，种子要经受极大的物理压力。如果 种子的细胞间质承受不了这种压力，就 会产生物理损伤。当种子在回升到室温 之前在液氮蒸汽上停留一段时间可减少 损伤，因此损伤产生在冷冻和解冻过程 中。当种子只暴露在液氮气相中（约150 ℃），种子没有损伤，小部分损伤发 生在-150 ℃~-196 ℃之间。