蛋白质免疫印迹技术精品课件
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western-blotting(蛋白免疫印迹)PPT课件
.
20
膜的选择
1. PVDF膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹 法中常用的一种固相支持物。
2. PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔 径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 大于20KD的蛋白选用0.45um的膜，小于20KD的 蛋白选用0.2um的膜。
1.含HRP的抗体； 2.发光试剂； 3.反应的杂质;
.
27
洗脱抗体
一抗洗脱 二抗洗脱 一抗种属来源不同时，strip二抗即可
.
28
三、显色
暗室曝光 Tanon 5200 全自动化学发光图像分析系统
.
29
Tanon 5200---性能特点
适用于高分辨率和高灵 敏度的图像拍摄；
可设定连续采样的次数、 起始及终止曝光时间， 进行动态连续拍摄，拍 摄得高质量的图片；
在裂解液中加入合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准
确性！ .
7
蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分 子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二 硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚 成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形 成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。
对
电转仪长期使用导致海绵变薄，
策
“三明治”结构不紧凑导致。
确保膜和胶块之间没有气泡
缓冲液中离子浓度太低，电流或电
压太高。转膜过程注意降温
.
34
四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 膜没有均匀浸湿 2. 膜或者缓冲液污染 3. 封闭不充分 4. 抗体与封闭剂出现交叉
蛋白质印迹课件
常用的固定化膜： NC膜（硝酸纤维素膜）和 PVDF膜。
《蛋白质印迹》PPT课件
优点
硝酸纤维素膜
(nitrocellulose filter membrane，NC膜)
1. 蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有较强的结合能力（80－100ug/cm2)。 2. 适用于各种显色方法，
同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、荧光显色； 3.背景低，信噪比高。 4. 转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间。
分离很宽分子量范围（6200KD）的蛋白质
适于分离小分子蛋 白质（10KD）
《蛋白质印迹》PPT课件
蛋白分子量标准 (marker)
未染色 marker
是最简单,最准确的marker。由于没有附带染料分子或者是标记 分子，所示大小正好是蛋白原本的大小。
现在的Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋 白比较。
Schleicher & Schull公司的实验表明，转移到NC膜上的蛋白4℃条件下保存5年依 然保持免疫识别特性，可以得到清晰可信的Western Blot结果。
《蛋白质印迹》PPT课件
➢ PAGE胶的孔径随 “Bis～Arc” 比率的增加而变小， ➢ 比率接近 1：20 时孔径达到最小值。 ➢ SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“Bis～Arc” 为1：29 配
制，研究表明它能分离分子量大小相差只有3% 的 蛋白质。
《蛋白质印迹》PPT课件
凝胶浓度与蛋白分离范围
考马斯亮蓝G-250与 高 蛋白质结合呈蓝色， （约1～ 在波长595nm吸收峰， 5μg/ml）, 在一定的范围内与蛋
白质的含量呈线性关 系
易受强碱性缓冲液， TritonX-100，SDS 等去污剂的影响
《蛋白质印迹》PPT课件
优点
硝酸纤维素膜
(nitrocellulose filter membrane，NC膜)
1. 蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有较强的结合能力（80－100ug/cm2)。 2. 适用于各种显色方法，
同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、荧光显色； 3.背景低，信噪比高。 4. 转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间。
分离很宽分子量范围（6200KD）的蛋白质
适于分离小分子蛋 白质（10KD）
《蛋白质印迹》PPT课件
蛋白分子量标准 (marker)
未染色 marker
是最简单,最准确的marker。由于没有附带染料分子或者是标记 分子，所示大小正好是蛋白原本的大小。
现在的Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋 白比较。
Schleicher & Schull公司的实验表明，转移到NC膜上的蛋白4℃条件下保存5年依 然保持免疫识别特性，可以得到清晰可信的Western Blot结果。
《蛋白质印迹》PPT课件
➢ PAGE胶的孔径随 “Bis～Arc” 比率的增加而变小， ➢ 比率接近 1：20 时孔径达到最小值。 ➢ SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“Bis～Arc” 为1：29 配
制，研究表明它能分离分子量大小相差只有3% 的 蛋白质。
《蛋白质印迹》PPT课件
凝胶浓度与蛋白分离范围
考马斯亮蓝G-250与 高 蛋白质结合呈蓝色， （约1～ 在波长595nm吸收峰， 5μg/ml）, 在一定的范围内与蛋
白质的含量呈线性关 系
易受强碱性缓冲液， TritonX-100，SDS 等去污剂的影响
蛋白质免疫印记课件
二、蛋白样品的定量
BCA法蛋白浓度测定
试剂：BCA工作液 ，双蒸水，蛋白标准液（ 将2mg/ml蛋白 溶 液 稀 释 至 2mg/ml,1mg/ml,0.5mg/ml, 0.125mg/ml, 0.0625mg/ml。）
管号 蛋白标准 液 ddH2O 样品 BCA(ML ) 0 100 0 10 2 1 50 50 10 2 2 25 75 10 2 3 12.5 87.5 10 2 4 6. 25 93.5 10 2 5 3.125 96.8 10 2
二、蛋白样品的定量
Lowry法
其原理为：蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络合使得肽
链伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条 件下与福林酚试剂反应，产生蓝色，在一定浓度范围 内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含 量成正比，由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含 量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准 。
额外的二抗孵育
Western blot应用
目的蛋白的表达量（定量）分析 目的蛋白的表达特性（定性）分析 目的蛋白的组织定位 目的蛋白与其它蛋白的互作
实验流程
实验成功要素
蛋白分离
转膜 封闭 洗涤 抗体孵育
蛋白抽提，蛋白定量，蛋白电泳
杂交膜的选择与处理，转膜条件的优化 封闭液的选择，封闭条件的优化 洗涤液的配制，洗涤时间及次数的选择 抗体的选择，抗体稀释倍数的优化
0.25mg/ml,
二、蛋白样品的定量
Bradford法敏感度高，并且与一系列干扰Lowry、 BCA法的还原剂（如DTT、巯基乙醇）相容。
与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受常用 浓度去垢剂的影响。
与Lowry法相比，BCA法操作更简单且稳定性更好
免疫印迹技术培训课件
免疫印迹技术
37
7、配胶注意事项
过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在4度放置2－3天。 配制30％丙烯酰胺储存液要过滤。
配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度 不均的情况。
要根据温度调整TEMED或AP的使用量。
水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平。
电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯
度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成
一个稳定而不断向阳极移动的界面。
➢由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集
聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数
百倍。
免疫印迹技术
免疫印迹技术
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1、BCA法蛋白定量
BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白质定量方法。该方法因快 速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍备 受专业人士的青睐。
原理是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形 成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比， 即可计算待测蛋白的浓度。
2.2 表面活性剂
溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白） 分为
1 阴离子型: SDS，脱氧胆酸盐
2 阳离子型: CPB和CTAB
3 双性离子型: CHAPS和Zwittergent系列
4 非离子型: Brij系列、Triton-100 、Nonidet P40、Tween 系列等
免疫印迹技术
Western Blot基本原理
一种将凝胶电泳与固相免疫结合起来的分子生物学技术。 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相 支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
westernblot详解PPT课件
蛋白质Marker
➢主要目的是确定靶蛋白的分子量大小； 使用预染的Marker还可以实时检测电泳 分离情况，并可以转移到膜上。
Fermentas
Prestained protein ladders Unstained protein ladders
第29页/共53页
上样缓冲液 Loading buffer
第6页/共53页
第7页/共53页
一 配分离胶
准备物品： 玻璃板 洗衣粉 灌胶架 移液枪 两个烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（ PH=8.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度 ） ，SDS（常温） 1 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦 洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在 通风处或烘箱中 2 配制分离胶： 玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡 在架子上准备灌胶。 先配制分离胶。配方如下：
1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（
5ml离心管）。
2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于
冰上。
3.10，000g ,4℃,10min,（5ml管）离心
4.取上清至1.5ml管，12，000g ,4℃,60min,
离心
5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存
第22页/共53页
3·1·2 蛋白样品浓度的测定方法
第18页/共53页
3·1 固定
①用ddH2O水冲洗一下玻璃板，将其放入电 泳槽中。注意，小玻璃板面向内，大玻璃板 面向外。
②向电泳槽中加入1x电泳液
• 5X电泳液缓冲液 ③Tr拔is（掉M梳W子1，2注1.1意4动）作轻柔。
优化蛋白质免疫印迹Western Blot精品PPT课件
Western Blot
2.转移膜的选择
（1）最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素 （Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜 做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。
挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
③拖尾
样品溶解不好
④纹理（纵向条纹）样品中含有不溶性颗粒。
⑤条带偏斜
电极不平衡或者加样位置偏斜。
⑥条带两边扩散 加样量过多
需要注意：
Western Blot
（1）凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀， 动作轻缓，放置加样孔出现不平。
（2）拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把 上样带扭曲。
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 15 10 7.5 5.0
线性分离范围（KD) 12-43 16-68 36-94 57-212
Western Blot
（2）避免电泳中出现以下情况
①条带呈笑脸状 凝胶不均匀冷却，中间冷却不好或电泳系统温
度偏高。
②条带呈皱眉状 可能是由于装置不合适，特别是 凝胶和玻璃
Western Blot
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot 一般流程
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
Western Blot
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
Western Blot（间接）一般流程:
三种膜的比较
Western Blot
western blot原理及操作方法ppt课件
常见问题
8.二抗的选择根据一抗的种属来源，如：一抗是兔抗大鼠目 的蛋白的抗体，则二抗应选择山羊或其他来源抗兔的抗体， 而且二抗要标记有同位素或酶。 9.条带两边扩散：加样量过多 10.条带两边高，中间凹 原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏 高
常见问题
11.条带呈皱眉状，中间高，两边低 原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡 板底部有气泡，或者两边聚合不完全 12.条带有拖尾现象 原因：样品溶解不好 13.混合搅拌速度时不宜太快，容易产生气泡影响聚合，导致 电泳带畸形。 太慢不均匀，特别是甘油
常见问题
3. 加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界 面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在 同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制 作用。也可以覆盖一层无水乙醇。
常见问题
4. 从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜保湿，避 免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 5.膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路 6.电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温 7.切滤纸和膜时，一定要戴手套，因为手上的蛋白会污 染膜
主要试剂
13.封闭缓冲液 封闭膜上的非特异性蛋白结合位点，防止一抗、二抗 的非特异性反应 • TBST Buffer 100 mL • 5 % Nonfat Milk 5g 14.一抗 15.二抗：羊抗兔IgG/HRP（辣根过氧化酶） 使试剂中的发光物氧化并发光 16. ECL检测试剂
操作步骤
提取总蛋白
主要试剂
8.10×转印Buffer（贮存液） 4℃保存 • 10×转印Buffer（贮存液）的配制： • 0.25 M Tris 30.28 g • 1.92 M Glycine 144.13 g • 三蒸水定容至 1000 mL • 1×Transfer Buffer（工作液）： • 10×Transfer Buffer 100 mL • 三蒸水 700 mL • 20 % 甲醇 200 mL
蛋白质免疫印迹实验(Western-BlotPPT课件
硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角 剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从 膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液 中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在 滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小 心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶 舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿 的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源 进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电 转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰 染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干 滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
.
1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
.
1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
免疫印迹法的实验技术PPT课件
根据实验结果和反馈，不断优化和改 进实验条件和方法，提高实验质量。
改进实验方法
积极探索和尝试新的实验方法和技术， 提高实验效率案例一：病毒抗原的检测
总结词
高效、准确
详细描述
免疫印迹法在病毒抗原检测中具有高效、准确的优点，能够快速识别病毒抗原， 为临床诊断和治疗提供有力支持。
疾病诊断
药物研发
通过检测患者血清或其他体液中的蛋白质 表达水平，辅助医生对疾病进行早期诊断 、分型和监测病情进展。
在药物筛选和药效评估过程中，利用免疫 印迹法检测药物对特定蛋白质表达的影响 ，从而评估药物的疗效和安全性。
生物标志物研究
蛋白质相互作用研究
通过免疫印迹法检测生物样本中特定蛋白 质的表达水平，有助于揭示生物标志物与 疾病发生、发展之间的关系。
存。
03
实验操作流程
样品处理与分离
样品选择
选择适当的组织或细胞样品，确保其具有代 表性。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和蛋白提取试剂，确保蛋 白质的完整性和活性。
细胞分离
根据细胞类型和实验需求，采用不同的分离 方法，如组织匀浆、离心等。
蛋白定量
采用BCA法、Bradford法等方法对提取的蛋 白进行定量，以便后续操作。
转印与封闭
01
02
03
转印膜选择
根据实验需求选择适当的 转印膜，如NC膜、PVDF 膜等。
转印条件
设置适当的电流、电压和 转印时间，确保蛋白质成 功转移至膜上。
封闭操作
采用合适的封闭液对转印 膜进行封闭，以减少非特 异性结合。
免疫反应与显色
一抗选择
根据实验目的选择特异性的一抗，确 保与目标蛋白的结合。
案例二：肿瘤标志物的检测
蛋白质免疫印迹技术及PPT课件
实验案例二：蛋白质相互作用分析
总结词
蛋白质相互作用分析有助于了解蛋白质之间的相互作用关系，进一步揭示生物学过程的分子机制。
详细描述
在实验中，首先将蛋白质样品进行分离和提纯，然后通过电泳分离蛋白质，再将其转移到膜上。接下 来，利用抗体技术检测两种蛋白质是否相互作用。这种方法可以用于研究蛋白质之间的相互作用关系 ，为生物学过程的研究提供重要信息。
归一化处理
将目标蛋白的密度与内参蛋白的密 度进行归一化，消除实验误差。
统计学分析
对实验组和对照组的数据进行统计 分析，比较组间差异。
数据分析的注意事项
数据可靠性
确保数据来源可靠，避免数据污染和误差。
数据可比性
确保实验条件一致，使数据具有可比性。
数据解读
结合生物学背景和实验目的，对数据进行合理解 读。
凝胶电泳
01
02
03
确定电泳条件
根据蛋白大小和分离需求， 选择合适的凝胶浓度和电 泳电压。
加样与电泳
将稀释后的蛋白样品加入 凝胶的加样孔中，开始电 泳分离蛋白质。
染色与脱色
电泳结束后，对凝胶进行 染色，使蛋白质条带显现 出来，然后进行脱色处理。
转膜
选择合适的转移膜
根据需要，选择NC膜、 PVDF膜等适合的转移膜。
实验操作流程
1. 样品制备
将细胞或组织提取蛋白，进行浓 度测定。
2. 阻断
将膜置于脱脂奶粉或BSA中，封 闭非特异性结合位点。
3. 抗体孵育
将抗体与膜在适当条件下孵育， 使抗体与目标蛋白结合。
6. 结果观察
通过荧光显微镜或其他成像设备 观察蛋白条带。
5. 显影
将荧光染料或其他标记物与抗体 结合，使蛋白在膜上显像。
Wesern-bloing蛋白免疫印迹实验ppt课件
子时要使梳子保持水平。）
④ 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，
槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
27
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
①测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋 白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白 变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。
2.结果分析
3.注意事项
四
实验室常见问题解答
20
蛋白样品制 备 蛋白含量测
定
21
在六孔板中，按照一 个孔添加150μL的比 例添加适量RIPA裂解 液，用枪吹打均匀以 充分接触细胞。
样品放置冰上 30min（中间混 匀5-6次）直至 裂解完全。
充分裂解后，1000014000g离心3-5分钟， 取上清，即可进行后续 的PAGE、Western和免 疫沉淀等操作
②加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃 板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样 器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气
泡也可能使样品溢出。）
28
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
浓缩胶80V电压跑20 分钟，可多跑几分钟； 分离胶180V电压跑 至底端。
疾病早期诊断
例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期 诊断中的应用[J]. 中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29.
5
检测样品中特异性蛋白质是否
④ 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，
槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
27
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
①测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋 白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白 变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。
2.结果分析
3.注意事项
四
实验室常见问题解答
20
蛋白样品制 备 蛋白含量测
定
21
在六孔板中，按照一 个孔添加150μL的比 例添加适量RIPA裂解 液，用枪吹打均匀以 充分接触细胞。
样品放置冰上 30min（中间混 匀5-6次）直至 裂解完全。
充分裂解后，1000014000g离心3-5分钟， 取上清，即可进行后续 的PAGE、Western和免 疫沉淀等操作
②加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃 板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样 器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气
泡也可能使样品溢出。）
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清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
浓缩胶80V电压跑20 分钟，可多跑几分钟； 分离胶180V电压跑 至底端。
疾病早期诊断
例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期 诊断中的应用[J]. 中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29.
5
检测样品中特异性蛋白质是否
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及中和反应等各种不同的反应类型。 因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用
血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应 （serologic reaction）。
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二、印迹法（blotting）
印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。
人体血清中IgG含量最多， IgA次之， IgM较 少， IgD和IgE微量。
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抗原抗体反应（antigen-antibody reaction）
是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发 生于体内（in vivo），也可发生于体外（in vitro）。
体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用； 体外反应：可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应
常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋 白质、核酸、激素等有机物。
抗原具有两方面的特性：免疫原性（immunogenicity） 和免疫反应性（immunoreactivity）。
免疫原性（immunogenicity）是指抗原刺激机体引起免疫应 答的能力。
免疫反应性（immunoreactivity）是指抗原与相应免疫应答 产物(即抗体)在体内或体外发生特异性结合反应的能力。
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当外源异体物质，如细菌、病毒、蛋白质、多 糖等进入动物机体后，可以激活机体免疫系统， 产生对外源物质的排除作用，从而保护机体免 受外源物质的侵害。
机体的这一特异免疫应答功能的细胞基础是淋 巴细胞。
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免疫应答的类型
（一）固有性免疫应答（innate immune response) 又称先天性免疫应答，非特异性免疫应答：是机体
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抗体的种类
抗体（antibodies，Ab)是专门对抗抗原特异 结构的球蛋白，故也称为免疫球蛋白 （immunoglobulins, Ig)。存在于血清、体液 中，是构成机体免疫作用的主要物质。
免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质的不同， 分为五种类型： IgG、 IgA、 IgM、 IgD和 IgE。
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（一）多克隆抗体的概念
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。 由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接
受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体 （Monoclone antibody）。 由多个抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种 各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起 就是多克隆抗体。 机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。
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淋巴组织
免疫活性细胞
免疫活性介质
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免疫系统功能的生理和病理表现
功能名称
生理功能 病理表现
免疫防御
清除病原微生物及其它抗原性异物 超敏反应（强） 免疫缺陷病（弱）
免疫自稳
清除损伤或衰老细胞
自身免疫性疾病
免疫监视
清除突变或畸变细胞 防止肿瘤发生 杀伤病毒感染细胞
肿瘤或病毒持续性 感染
在种系发育和进化过程中形成的免疫防御功能。
（二）适应性免疫应答（adaptive immune response） 又称获得性免疫应答，特异性免疫应答，是机体出
生后通过与抗原物质接触后所产生的一系列防御功能。 （具有特异性、多样性、记忆性、耐受性、自限性）
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抗原和免疫原性
抗原（antigens，Ag）是指能够刺激机体免疫活性细 胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特 异性反应的物质。
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抗原的分类
抗原可以分为完全抗原和半抗原。 完全抗原：具有免疫原性和免疫反应性的抗原称
为完全抗原（complete antigen） 半抗原：只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原
称为半抗原（hapten），也称为不完全抗原 (incomplete antigen)。与蛋白质结合后成为完 全抗原。半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞 发生特异性结合反应。绝大多数多糖和所有类脂 都属于半抗原。
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二、实验原理
第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备 第二部分 Western－blotting 检测抗血清
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第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备
将适当的抗原物质注入动物体内，经过一定时间，动 物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清 称为免疫血清。
优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫 原性，以及动物应答的能力。此外，尚需考虑免疫途 径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因 素。
蛋白质免疫印迹技术
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一、免疫学
研究抗原物质的结构和功能； 免疫应答产物的结构和功能； 抗原刺激机体产生免疫应答的规律。
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免疫学的研究范围很广，与很多相关学科交织在 一起，并且发展成了很多学科，如免疫生物学、 免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。
随着免疫生物学的发展，人们发现在高等动物体 内存在着具有免疫功能的组织结构（即免疫系 统）。
方法。
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蛋白质免疫印迹检测技术
一、实验目的 二、实验原理 三、实验仪器 四、操作步骤 五、实验结果与分析 六、思考题
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一、实验目的
学习掌握动物抗血清的制备原理及技术 通过实际操作学会动物抗血清的制备 掌握Western－blotting的基本原理 熟悉Western－blotting的实验操作
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜 （NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段 的方法，称为Southern 印迹法。
人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对 RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电 泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法
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三、蛋白免疫印迹的应用
免疫印迹法 (immunoblotting test,IBT)，亦称酶联 免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB
是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术 相结合的杂交技术。
具有分析容量大、敏感度高、用的
血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应 （serologic reaction）。
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二、印迹法（blotting）
印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。
人体血清中IgG含量最多， IgA次之， IgM较 少， IgD和IgE微量。
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抗原抗体反应（antigen-antibody reaction）
是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发 生于体内（in vivo），也可发生于体外（in vitro）。
体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用； 体外反应：可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应
常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋 白质、核酸、激素等有机物。
抗原具有两方面的特性：免疫原性（immunogenicity） 和免疫反应性（immunoreactivity）。
免疫原性（immunogenicity）是指抗原刺激机体引起免疫应 答的能力。
免疫反应性（immunoreactivity）是指抗原与相应免疫应答 产物(即抗体)在体内或体外发生特异性结合反应的能力。
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当外源异体物质，如细菌、病毒、蛋白质、多 糖等进入动物机体后，可以激活机体免疫系统， 产生对外源物质的排除作用，从而保护机体免 受外源物质的侵害。
机体的这一特异免疫应答功能的细胞基础是淋 巴细胞。
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免疫应答的类型
（一）固有性免疫应答（innate immune response) 又称先天性免疫应答，非特异性免疫应答：是机体
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抗体的种类
抗体（antibodies，Ab)是专门对抗抗原特异 结构的球蛋白，故也称为免疫球蛋白 （immunoglobulins, Ig)。存在于血清、体液 中，是构成机体免疫作用的主要物质。
免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质的不同， 分为五种类型： IgG、 IgA、 IgM、 IgD和 IgE。
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（一）多克隆抗体的概念
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。 由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接
受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体 （Monoclone antibody）。 由多个抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种 各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起 就是多克隆抗体。 机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。
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淋巴组织
免疫活性细胞
免疫活性介质
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免疫系统功能的生理和病理表现
功能名称
生理功能 病理表现
免疫防御
清除病原微生物及其它抗原性异物 超敏反应（强） 免疫缺陷病（弱）
免疫自稳
清除损伤或衰老细胞
自身免疫性疾病
免疫监视
清除突变或畸变细胞 防止肿瘤发生 杀伤病毒感染细胞
肿瘤或病毒持续性 感染
在种系发育和进化过程中形成的免疫防御功能。
（二）适应性免疫应答（adaptive immune response） 又称获得性免疫应答，特异性免疫应答，是机体出
生后通过与抗原物质接触后所产生的一系列防御功能。 （具有特异性、多样性、记忆性、耐受性、自限性）
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抗原和免疫原性
抗原（antigens，Ag）是指能够刺激机体免疫活性细 胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特 异性反应的物质。
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抗原的分类
抗原可以分为完全抗原和半抗原。 完全抗原：具有免疫原性和免疫反应性的抗原称
为完全抗原（complete antigen） 半抗原：只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原
称为半抗原（hapten），也称为不完全抗原 (incomplete antigen)。与蛋白质结合后成为完 全抗原。半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞 发生特异性结合反应。绝大多数多糖和所有类脂 都属于半抗原。
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二、实验原理
第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备 第二部分 Western－blotting 检测抗血清
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第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备
将适当的抗原物质注入动物体内，经过一定时间，动 物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清 称为免疫血清。
优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫 原性，以及动物应答的能力。此外，尚需考虑免疫途 径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因 素。
蛋白质免疫印迹技术
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一、免疫学
研究抗原物质的结构和功能； 免疫应答产物的结构和功能； 抗原刺激机体产生免疫应答的规律。
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免疫学的研究范围很广，与很多相关学科交织在 一起，并且发展成了很多学科，如免疫生物学、 免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。
随着免疫生物学的发展，人们发现在高等动物体 内存在着具有免疫功能的组织结构（即免疫系 统）。
方法。
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蛋白质免疫印迹检测技术
一、实验目的 二、实验原理 三、实验仪器 四、操作步骤 五、实验结果与分析 六、思考题
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一、实验目的
学习掌握动物抗血清的制备原理及技术 通过实际操作学会动物抗血清的制备 掌握Western－blotting的基本原理 熟悉Western－blotting的实验操作
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜 （NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段 的方法，称为Southern 印迹法。
人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对 RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电 泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法
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三、蛋白免疫印迹的应用
免疫印迹法 (immunoblotting test,IBT)，亦称酶联 免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB
是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术 相结合的杂交技术。
具有分析容量大、敏感度高、用的