荧光探针医疗培训课件
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稀土荧光探针检测多巴胺及类似物PPT课件
治疗提供有力支持。
研究不足与展望
虽然该方法具有较高的灵敏度 和选择性，但在实际应用中仍 需进一步优化和完善。
对于某些特定样本或复杂基质， 可能需要进行预处理或富集步 骤以提高检测效果。
未来可以尝试将该方法与其他 技术相结合，以提高检测的准 确性和可靠性，降低误差和干 扰。
未来研究方向
深入研究荧光探针与多巴胺及类似物 的相互作用机制，为探针的设计和优 化提供理论支持。
实验结果与分析
荧光光谱分析
通过测量不同浓度的多巴胺及类似物 与稀土荧光探针的荧光光谱，可以观 察到明显的荧光信号变化。
荧光强度与浓度的关系
随着多巴胺及类似物浓度的增加，荧 光强度逐渐增强，表现出良好的线性 关系。
检测限与灵敏度
通过计算检测限和灵敏度，可以评估 该方法的实际应用价值。
干扰实验
考察其他物质对多巴胺及类似物检测 的干扰程度，以确定该方法的特异性。
的准确性。
高选择性
针对目标物质设计荧光探针， 可有效排除其他物质的干扰， 提高检测的选择性。
操作简便
荧光探针检测方法操作简便， 可实现快速、方便的检测，适 合于现场检测和临床应用。
广泛适用性
荧光探针检测方法可适用于多 种不同类型样本的检测，如生
物体液、组织切片等。
04
稀土荧光探针在多巴胺及类似物检测
不易受环境因素影响，稳定性 高。
稀土荧光探针的应用领域
生物成像
利用稀土荧光探针标记 生物分子，进行细胞和
组织成像。
化学分析
检测气体、液体和固体 样品中的目标分析物。
光学器件
制造高效、稳定的光学 器件，如激光器、发光
二极管等。
能源领域
研究太阳能电池、发光 材料等能源相关领域的
研究不足与展望
虽然该方法具有较高的灵敏度 和选择性，但在实际应用中仍 需进一步优化和完善。
对于某些特定样本或复杂基质， 可能需要进行预处理或富集步 骤以提高检测效果。
未来可以尝试将该方法与其他 技术相结合，以提高检测的准 确性和可靠性，降低误差和干 扰。
未来研究方向
深入研究荧光探针与多巴胺及类似物 的相互作用机制，为探针的设计和优 化提供理论支持。
实验结果与分析
荧光光谱分析
通过测量不同浓度的多巴胺及类似物 与稀土荧光探针的荧光光谱，可以观 察到明显的荧光信号变化。
荧光强度与浓度的关系
随着多巴胺及类似物浓度的增加，荧 光强度逐渐增强，表现出良好的线性 关系。
检测限与灵敏度
通过计算检测限和灵敏度，可以评估 该方法的实际应用价值。
干扰实验
考察其他物质对多巴胺及类似物检测 的干扰程度，以确定该方法的特异性。
的准确性。
高选择性
针对目标物质设计荧光探针， 可有效排除其他物质的干扰， 提高检测的选择性。
操作简便
荧光探针检测方法操作简便， 可实现快速、方便的检测，适 合于现场检测和临床应用。
广泛适用性
荧光探针检测方法可适用于多 种不同类型样本的检测，如生
物体液、组织切片等。
04
稀土荧光探针在多巴胺及类似物检测
不易受环境因素影响，稳定性 高。
稀土荧光探针的应用领域
生物成像
利用稀土荧光探针标记 生物分子，进行细胞和
组织成像。
化学分析
检测气体、液体和固体 样品中的目标分析物。
光学器件
制造高效、稳定的光学 器件，如激光器、发光
二极管等。
能源领域
研究太阳能电池、发光 材料等能源相关领域的
荧光探针 ppt课件
实验结论
RA荧光探针有如下优点：
①
灵敏度高、 选择性好
②
其荧光发射 波长在可见 区，用在细 胞中可避免 细胞自身荧 光和背景散 射的影响。
③
激发波长所 需的能量较 低,避免了高 能量的激发 波长对细胞 造成的潜在 伤害
。
④
在水溶液中 检测Cu2+的 有效pH范围 宽。
欢
迎 提
问
Thyoaunk
End
0 1
研究背景
检测原理
0 2
0 3
实验部分
实验结论
0
4
研究背景
Cu2 +
Cu2 + 生物体中基本的微量元素一; 生物体内过量摄入的铜也会产 生毒性; 采用荧光探针的方法检测铜离 子，尤其是跟踪其在化学反应 和生命活动中的作用过程具有 重要的意义．
检测原理
背景知识---荧光探针
• 典型的荧光探针由识别基团(受体)，荧光团和连接二者的 连接基团所组成。受体和底物结合后,导致受体分子光物理性 质的变化,具体表现为荧光团部分发生突光猝灭或增强。
实验部分
二、溶剂体系对RA和Cu2+反应的影响
可见，纯水或在纯乙腈中，Cu2+和探 针RA之间相互作用不明显，体系的荧 光强度很弱。当CH3CN/H2O的体积比 在1B9~9B1之间时，探针RA可对Cu2+ 进行很好地识别。其中，CH3CN/H2O 的体积比为1：1时，荧光强度已接近 最大；再增加乙腈的含量，虽然体系 的荧光强度未降低，但增加有机试剂 的用量对环境和生物体系的测试均不 利，因此选择V(CH3CN) /V(H2O)=1： 1进行测试。
Cu2+浓度逐渐增大，RA的荧光 强度大幅度增加，最大发射波长 由565 nm红移到571 nm，也证 明了探针分子发生了开环，形成 了共轭体系较大的荧光体系。
荧光探针
到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输
的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换
成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号(
荧光等)。
连接基团(S)，将信号报告基团和识别结合基
团连接起来，根据设计的不同连接基团可有多
种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链
烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有
输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强
作为一个检测标准
• 选用GAPDH作为内标基因
− FAM标记的ERBB2探针
− VIC标记的GAPDH探针
• 构建标准曲线
• 双重PCR反应
• 阴性对照
− 无RNA对照（空白）
− 无逆转录酶对照（基因组）
标准曲线
Color 1 – FAM
detection for
ERBB2
Color 2 - VIC
实时荧光PCR病毒检测
实时荧光PCR基因突变和临床
实时荧光PCR遗传病研究中应用
实时荧光PCR在肿瘤中应用
实时荧光PCR在环境微生物检测的应用
实时荧光PCR在肿瘤中应用
利用TaqMan法研究ERBB2 在正常或乳腺肿瘤组
织标本中的表达差异（相对标准曲线法）
• 已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以
− 灵敏度低
TaqMan探针法
• 水解型
− 报告基团，淬灭基团
− FRET（荧光谐振能量传递）
− 识别特异性产物
• 优点
− 特异性高，可准确定量
− 灵敏度高
− 设计不同标记的探针，可进行多重检测
• 缺点
− 一个探针只适用于一个为Fret机制没有荧光产生
发生水解fret机制消失，荧光发生
的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换
成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号(
荧光等)。
连接基团(S)，将信号报告基团和识别结合基
团连接起来，根据设计的不同连接基团可有多
种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链
烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有
输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强
作为一个检测标准
• 选用GAPDH作为内标基因
− FAM标记的ERBB2探针
− VIC标记的GAPDH探针
• 构建标准曲线
• 双重PCR反应
• 阴性对照
− 无RNA对照（空白）
− 无逆转录酶对照（基因组）
标准曲线
Color 1 – FAM
detection for
ERBB2
Color 2 - VIC
实时荧光PCR病毒检测
实时荧光PCR基因突变和临床
实时荧光PCR遗传病研究中应用
实时荧光PCR在肿瘤中应用
实时荧光PCR在环境微生物检测的应用
实时荧光PCR在肿瘤中应用
利用TaqMan法研究ERBB2 在正常或乳腺肿瘤组
织标本中的表达差异（相对标准曲线法）
• 已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以
− 灵敏度低
TaqMan探针法
• 水解型
− 报告基团，淬灭基团
− FRET（荧光谐振能量传递）
− 识别特异性产物
• 优点
− 特异性高，可准确定量
− 灵敏度高
− 设计不同标记的探针，可进行多重检测
• 缺点
− 一个探针只适用于一个为Fret机制没有荧光产生
发生水解fret机制消失，荧光发生
荧光探针的应用与进展课件
环境监测
污染物检测
荧光探针可以用于检测水体、土 壤等环境中的有害物质，如重金 属、有机污染物等，为环境污染 治理和生态保护提供技术支持。
生物毒性测试
荧光探针可以用来评估化学物质 对生物体的毒性作用，通过观察 荧光信号的变化，快速、准确地
评估环境中有害物质的风险。
生态研究
利用荧光探针标记生物个体或种 群，通过观察荧光信号的分布和 动态变化，研究生物在生态系统
开发适用于环境监测和食品安全检测的荧光探针，保障人类健康和 生态安全。
加强荧光探针的基础研究与人才培养
基础研究投入
加大对荧光探针基础研究的投入 ，支持科研团队开展创新性研究 ，推动荧光探针技术的持续发展 。
人才培养与交流
加强荧光探针领域的人才培养和 学术交流，鼓励跨学科合作与交 流，促进荧光探针技术的普及和 应用。
荧光探针与其他技术的结合应用
总结词
荧光探针与其他技术的结合应用是荧光探针领域的重 要发展方向，通过将荧光探针与其他技术相结合，可 以实现更高效、更准确的检测和诊断。
详细描述
随着各种技术的不断发展，研究者们将荧光探针与其 他技术相结合，如光学成像技术、质谱技术、纳米技 术等。这些技术的结合可以充分发挥各自的优势，提 高荧光探针的应用范围和效果。例如，将荧光探针与 光学成像技术相结合，可以实现生物体内的高清成像 和可视化检测；将荧光探针与质谱技术相结合，可以 实现蛋白质组学和代谢组学的高灵敏度检测。
荧光探针的分类
总结词
荧光探针可以根据激发波长、发射波长、荧光染料类型等进 行分类。
详细描述
根据激发波长，荧光探针可以分为紫外激发和可见光激发两 类；根据发射波长，可以分为长波长发射和短波长发射两类 ；根据荧光染料类型，可以分为荧光染料、荧光量子点、荧 光蛋白等类型。
荧光探针应用技术ppt课件
1
3
4
5
6
7
荧光是一种光致发光的冷发光现象。 当某种常温物质经某种波长的入射光 （通常是紫外线或X射线）照射，吸收光 能后进入激发态，并发射出比入射光的 的波长更长的发射光（通常波长在可见 光波段） 而且一旦停止入射光，发光现象也随之 立即消失。 具有这种性质的发射光就被称之为荧光。
53
生物医学研究与 荧光探针
54
55
原代培养视网膜色素上皮细胞细胞骨架的破坏 56
57
3T3-L1 cells
Adipose Triglyceride Lipase Lipid droplets DAPI fluorescent DNA dye
58
2009-10-16 20:20
59
60
在许多领域荧光探针已经取代放射性核素
标记技术成为标准的研究工具，在检测速度 和易用性方面都具有无可比拟的优点
随着激光扫描共聚焦显微镜在国内的引进
和广泛应用，以及流式细胞仪和荧光显微镜 在国内的普及，对各种荧光标记物的需求和 了解日益迫切。
73
主要内容
1. 荧光探针发展简史 2. 荧光探针基本理论及选择应用 3. 荧光探针负载技术 4. 绿色荧光蛋白的发现及其应用 5. 超敏检测技术 6. 荧光探针在病原生物学领域的应用 7. 激光扫描共聚焦显微镜技术简介及其荧光探针选择 8. 分子信标的原理、量子点荧光探针等介绍 9. 免疫荧光组织化学技术原理及应用
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荧光是一种光致发光的冷发光现象。 当某种常温物质经某种波长的入射光 （通常是紫外线或X射线）照射，吸收光 能后进入激发态，并发射出比入射光的 的波长更长的发射光（通常波长在可见 光波段） 而且一旦停止入射光，发光现象也随之 立即消失。 具有这种性质的发射光就被称之为荧光。
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生物医学研究与 荧光探针
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原代培养视网膜色素上皮细胞细胞骨架的破坏 56
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3T3-L1 cells
Adipose Triglyceride Lipase Lipid droplets DAPI fluorescent DNA dye
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在许多领域荧光探针已经取代放射性核素
标记技术成为标准的研究工具，在检测速度 和易用性方面都具有无可比拟的优点
随着激光扫描共聚焦显微镜在国内的引进
和广泛应用，以及流式细胞仪和荧光显微镜 在国内的普及，对各种荧光标记物的需求和 了解日益迫切。
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主要内容
1. 荧光探针发展简史 2. 荧光探针基本理论及选择应用 3. 荧光探针负载技术 4. 绿色荧光蛋白的发现及其应用 5. 超敏检测技术 6. 荧光探针在病原生物学领域的应用 7. 激光扫描共聚焦显微镜技术简介及其荧光探针选择 8. 分子信标的原理、量子点荧光探针等介绍 9. 免疫荧光组织化学技术原理及应用
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荧光探针的应用与进展PPT课件
Analytical Chemistry（Anal. Chem., 2016, 88,1821-1826）
荧光探针的应用进展
Analytical Chemistry（Anal. Chem., 2016, 88,1821-1826）
荧光探针的应用进展
结论 利用所合成制备的两种不同的Polymer-Py/γ-CD主客体复合物， 实现了对四种不同蛋白样品的特异性识别检测。不同的聚合物链与不 同的蛋白的结合常数不同，因而所构建的聚合物基质荧光探针对蛋白 具有良好的选择性。而通过调节聚合物链的长度，还可进一步调节蛋 白识别检测的灵敏度和选择性。 这个方法不但制备简单、普适性强，而且具有较高的荧光检测灵敏度 和较强的蛋白识别选择性，为构建新型聚合物基质的主客体复合物荧 光探针的制备及蛋白识别分析提供了新的研究思路。
Analytical Chemistry（Anal. Chem., 2016, 88,1821-1826）
荧光探针的应用进展
Simultaneous Near-Infrared and Two-Photon In Vivo Imaging of H2O2 Using a Ratiometric Fluorescent Probe based on the Unique Oxidative Rearrangement of Oxonium 利用比率荧光探针实现在体内对H2O2的近红外和双光子成像
给电子取代基如：-NH2，-NR2，OH，-OR和-CN。 吸电子取代基如：-C = O，COOH，-CHO，-NO2和-
外因
溶液的PH值、温度 激发光源的选择 溶剂的性质如极性、介 电常数 染料分子间相互作用等
荧光探针的选择原则
（1）荧光的定性或定量 定性一般选择单波长激发探针，定量最好选择双波长激发的比率探针 （2）荧光探针的特异性和毒性 （3）荧光探针的适用PH （4）激发波长与发射波长 斯托克斯位移 （5）荧光强度与荧光寿命 （6）光稳定性、漂白性 （7）荧光量子产率
选择性荧光探针分析PPT课件
识别基团和荧光基团形成络合物，当被分析物加入到该体系中时，由于 识别基团与被分析物的结合能力要强于识别基团与荧光基团的结合能力， 因此被测物将荧光基团置换出来，从而引起了整个体系荧光等化学参数的 变化，进而为仪器或者裸眼识别，该原理常用于设计阴离子荧光探针。
9
Cu2+
CN-
Cu(CN)2
3
4
化合物3以氟硼荧为荧光团修饰了DPA为识别基团，探针本身荧光 很强，但与铜离子络合后可形成结构3，从而淬灭了氟硼荧的荧光，加 入氰根离子后，由于铜离子与氰根离子的结合常数更大，从而把作为荧 光基团的氟硼荧衍生物从络合状态中置换出来得到结构4，使之进入溶 液，荧光恢复，而其它的阴离子没有这样的现象，因此可以实现对氰根 离子的检测。
13
2 1
基于光诱导电子转移机理设计的荧光分子探针
14
2、分子内电荷转移
分子内电荷转移荧光探针分子通常是荧光团 上同时连有推电子基团（电子给体）和吸电 子基团（电子受体）,通过π键提供电子转移的 通道，形成强的推-拉作用的共轭体系，其吸 电子基团或推电子基团本身充当识别基团的 一部分。当识别基团和被分析物结合后，作 为识别基团的供电子部分或拉电子部分的推 拉电能力发生的改变，整个体系的的π电子结 构重新分布，从而导致吸收光谱，发射光谱 发生变化，主要是光谱红移或蓝移 。
10
ห้องสมุดไป่ตู้
3、化学计量计法
探针分子 被分析物
新物质A
探针分子 被分析物
中间体
新物质B 新物质C
（I）被分析物和探针分子反应形成了共价化合物； （II）被分析物催化探针分子反应生成两种新物质。
11
荧光分子探针识别原理
荧光分子探针主要有如下几种识别机理： Ø光诱导电子转移机理（PET, photo-induced electron transfer） Ø分子内电荷转移机理（ICT, intramolecular charge transfer） Ø荧光共振能量转移机理（FRET, fluorescence resonance energy transfer） Ø形成激基缔合物（excimer/exciplex）
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Cu2+
CN-
Cu(CN)2
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化合物3以氟硼荧为荧光团修饰了DPA为识别基团，探针本身荧光 很强，但与铜离子络合后可形成结构3，从而淬灭了氟硼荧的荧光，加 入氰根离子后，由于铜离子与氰根离子的结合常数更大，从而把作为荧 光基团的氟硼荧衍生物从络合状态中置换出来得到结构4，使之进入溶 液，荧光恢复，而其它的阴离子没有这样的现象，因此可以实现对氰根 离子的检测。
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基于光诱导电子转移机理设计的荧光分子探针
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2、分子内电荷转移
分子内电荷转移荧光探针分子通常是荧光团 上同时连有推电子基团（电子给体）和吸电 子基团（电子受体）,通过π键提供电子转移的 通道，形成强的推-拉作用的共轭体系，其吸 电子基团或推电子基团本身充当识别基团的 一部分。当识别基团和被分析物结合后，作 为识别基团的供电子部分或拉电子部分的推 拉电能力发生的改变，整个体系的的π电子结 构重新分布，从而导致吸收光谱，发射光谱 发生变化，主要是光谱红移或蓝移 。
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ห้องสมุดไป่ตู้
3、化学计量计法
探针分子 被分析物
新物质A
探针分子 被分析物
中间体
新物质B 新物质C
（I）被分析物和探针分子反应形成了共价化合物； （II）被分析物催化探针分子反应生成两种新物质。
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荧光分子探针识别原理
荧光分子探针主要有如下几种识别机理： Ø光诱导电子转移机理（PET, photo-induced electron transfer） Ø分子内电荷转移机理（ICT, intramolecular charge transfer） Ø荧光共振能量转移机理（FRET, fluorescence resonance energy transfer） Ø形成激基缔合物（excimer/exciplex）
最新常用的定量PCR荧光探针-生物化学与分子生物学教学文案精品课件
着目标核酸分子拷贝(kǎobèi)数人为放大这样一个事实，因此，其阳性 结果的可信度不如Northern boltting 或 Southern boltting。
8
第八页，共45页。
核酸(hé suān)实验研究技术进展－1
例子：
RT-PCR检测 SHEEC食管癌 细胞 (xìbāo)NGAL基 因转录mRNA实 验结果
11
第十一页，共45页。
核酸实验(shíyàn)研究技术进展－
目标片段边缘序列的测定(cèdìng)结果有时不准确 例子
12
第十二页，共45页。
核酸(hé suān)实验研究技术进展－
第十三页，共45页。
Poly A tail
13
核酸实验研究技术(jìshù)进展
14
第十四页，共45页。
测定实验标本中目标核酸分子(fēnzǐ)的含量
常用的定量PCR荧光探针(tàn zhēn)-生物化学与分子生物学
第一页，共45页。
核酸实验研究技术(jìshù)进展－
1) 杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的特异性探针(tàn zhēn)。
2) Dot blotting：不经过电泳，直接把检测样本点在一个适宜载体上， 针对目标DNA分子或RNA分子进行杂交检测。
27
第二十七页，共45页。
核酸实验研究(yánjiū)技术进
28
第二十八页，共45页。
核酸(hé suān)实验研究技术进
适时(shìshí)荧光定量PCR Real time fluorescent quantitation PCR
29
第二十九页，共45页。
核酸实验(shíyàn)研究技术进
第十九页，共45页。
8
第八页，共45页。
核酸(hé suān)实验研究技术进展－1
例子：
RT-PCR检测 SHEEC食管癌 细胞 (xìbāo)NGAL基 因转录mRNA实 验结果
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核酸实验(shíyàn)研究技术进展－
目标片段边缘序列的测定(cèdìng)结果有时不准确 例子
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核酸(hé suān)实验研究技术进展－
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Poly A tail
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核酸实验研究技术(jìshù)进展
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第十四页，共45页。
测定实验标本中目标核酸分子(fēnzǐ)的含量
常用的定量PCR荧光探针(tàn zhēn)-生物化学与分子生物学
第一页，共45页。
核酸实验研究技术(jìshù)进展－
1) 杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的特异性探针(tàn zhēn)。
2) Dot blotting：不经过电泳，直接把检测样本点在一个适宜载体上， 针对目标DNA分子或RNA分子进行杂交检测。
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核酸实验研究(yánjiū)技术进
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核酸(hé suān)实验研究技术进
适时(shìshí)荧光定量PCR Real time fluorescent quantitation PCR
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核酸实验(shíyàn)研究技术进
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荧光探针PPT课件
.
荧光探针
1
.
什么是荧光探针？
荧光探针就是以荧光物质作为指示剂,并在一定波长 光的激发下使指示剂产生荧光,通过检测所产生的荧光实 现对被检测物质的定性或者定量分析。
荧光探针受到周围环境的影响，使其发生荧光发射 发生变化，从而使人们获知周围环境的特征或者环境中 存在的某种特定信息。
2
.
荧光探针的优点
12
.
Thanks for attention
13
7
.
分子信标是一种由寡聚核酸形成的发夹型分子。它包 括一个环，环由与靶分子互补的核酸碱基序列组成； 干为两列互补的碱基序列，在分子信标中，荧光基团 共价地连接在其干部分的一个末端，猝灭基团也靠共 价键连接在干部分的另一末端。
8
.
分子信标未与靶分子结合时，由于干部分两列互 补碱基对之间的氢键连接，使得荧光基团与猝灭基团 距离很近，荧光基团将能量转移给猝灭基团而发生荧 光猝灭；当分子信标与序列互补的靶分子结合时，环 与靶序列杂交而形成了比干部分更长更稳定的碱基对 氢键连接，分子信标发生构型的变化，干部分被打开， 从而使荧光基团远离猝灭基团，荧光基团产生的荧光 得到几乎100%恢复，且所检测到的荧光强度与溶液中 靶标的量成正比。
Fluorephore Spacer hv
F
S
Receptor R
Analyte
.
strongly fluorescent
识别基团决定了探针分子的选择性和特异性，荧光基 团则决定了识别的灵敏度，而连接体部分则可起到分 子识别枢纽的作用。
4
.
荧光基团和识别基团二者连接在同一个共轭体系中，荧 光基团是该体系中最基本的组成部分，一般为芳香族的 稠环化合物，其目的是将分子识别转换成不同形式的荧 光信号，如荧光强度的增强或减弱、荧光寿命的变化、 光谱的移动等。识别基团是为了实现这一选择性识别而 合成的探针结构单元，是决定荧光分子探针和被检测体 结合的灵敏度与选择性的部分，通常也称为受体。
荧光探针
1
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什么是荧光探针？
荧光探针就是以荧光物质作为指示剂,并在一定波长 光的激发下使指示剂产生荧光,通过检测所产生的荧光实 现对被检测物质的定性或者定量分析。
荧光探针受到周围环境的影响，使其发生荧光发射 发生变化，从而使人们获知周围环境的特征或者环境中 存在的某种特定信息。
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荧光探针的优点
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Thanks for attention
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分子信标是一种由寡聚核酸形成的发夹型分子。它包 括一个环，环由与靶分子互补的核酸碱基序列组成； 干为两列互补的碱基序列，在分子信标中，荧光基团 共价地连接在其干部分的一个末端，猝灭基团也靠共 价键连接在干部分的另一末端。
8
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分子信标未与靶分子结合时，由于干部分两列互 补碱基对之间的氢键连接，使得荧光基团与猝灭基团 距离很近，荧光基团将能量转移给猝灭基团而发生荧 光猝灭；当分子信标与序列互补的靶分子结合时，环 与靶序列杂交而形成了比干部分更长更稳定的碱基对 氢键连接，分子信标发生构型的变化，干部分被打开， 从而使荧光基团远离猝灭基团，荧光基团产生的荧光 得到几乎100%恢复，且所检测到的荧光强度与溶液中 靶标的量成正比。
Fluorephore Spacer hv
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Receptor R
Analyte
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strongly fluorescent
识别基团决定了探针分子的选择性和特异性，荧光基 团则决定了识别的灵敏度，而连接体部分则可起到分 子识别枢纽的作用。
4
.
荧光基团和识别基团二者连接在同一个共轭体系中，荧 光基团是该体系中最基本的组成部分，一般为芳香族的 稠环化合物，其目的是将分子识别转换成不同形式的荧 光信号，如荧光强度的增强或减弱、荧光寿命的变化、 光谱的移动等。识别基团是为了实现这一选择性识别而 合成的探针结构单元，是决定荧光分子探针和被检测体 结合的灵敏度与选择性的部分，通常也称为受体。
第二讲-荧光探针
激发光谱：固定发射波长（一般为发射波段中感兴趣的峰位）， 扫描化合物的发射光强与入射光波长的关系曲线。
反映的是基态与所有与该荧光发射有关的能级之间的跃迁。
发射光谱：固定激发波长（一般为激发波段中感兴趣的峰位）， 扫描化合物的发射光强与发射光波长的关系曲线。
光谱
对同一个荧光化合物而言，在其激发光谱范围内，采用 任一波长进行激发，得到的荧光光谱只会有一个发射带。
荧光探针受到周围环境的影响，使其发生荧光发射发生变化，从而 使人们获知周围环境的特征或者环境中存在的某种特定信息。
荧光分子探针的优点
灵敏度高 选择性好 使用方便 成本低 不需预处理 不受外界电磁场影响 远距离发光
荧光分子探针的结构
荧光分子探针通常由三部分组成： 识别基团接收器（Receptor） 荧光基团报告器（Reporter） 连接器（Relay）
1、表面吸附：实验室常用的器皿如瓶子、吸管、移液 管、试管等对物质具有吸附能力。特别是使用有机溶剂时， 这种吸附更为严重。而且所用的溶剂极性越小，吸附作用越 显著。在稀溶液分析中，器壁的吸附作用是不能忽略的。
克服表面吸附的办法：（1）减少表面接触的机会；（2）使 用非极性有机溶剂时 ，加入少量极性溶剂（如乙醇）；
一般溶剂效应：溶剂的折射率和介电常数对荧光物质荧 光性质的影响。
特殊溶剂效应：荧光物质和溶剂分子之间的特殊化学作 用，如氢键。
一般溶剂效应是普遍存在的 ，而特殊溶剂效应则决定于 溶剂和荧光体的化学结构。特殊溶剂效应所引起的荧光物质 的荧光性质的变化往往比一般溶剂效应所引起的显著 。
（三）温度
温度是溶液荧光的重要影响因素。 一般而言，溶液中荧光物质的荧光量子 产率和荧光强度随温度的降低而增强， 随着温度的升高而减弱。在检测温度系 数（温度每升高1°C，溶液荧光变化的 百分数）大的样品或进行荧光参数的精 确测量[如荧 光各向异性（荧光偏振） 的测定）时，应使用恒温装置。
反映的是基态与所有与该荧光发射有关的能级之间的跃迁。
发射光谱：固定激发波长（一般为激发波段中感兴趣的峰位）， 扫描化合物的发射光强与发射光波长的关系曲线。
光谱
对同一个荧光化合物而言，在其激发光谱范围内，采用 任一波长进行激发，得到的荧光光谱只会有一个发射带。
荧光探针受到周围环境的影响，使其发生荧光发射发生变化，从而 使人们获知周围环境的特征或者环境中存在的某种特定信息。
荧光分子探针的优点
灵敏度高 选择性好 使用方便 成本低 不需预处理 不受外界电磁场影响 远距离发光
荧光分子探针的结构
荧光分子探针通常由三部分组成： 识别基团接收器（Receptor） 荧光基团报告器（Reporter） 连接器（Relay）
1、表面吸附：实验室常用的器皿如瓶子、吸管、移液 管、试管等对物质具有吸附能力。特别是使用有机溶剂时， 这种吸附更为严重。而且所用的溶剂极性越小，吸附作用越 显著。在稀溶液分析中，器壁的吸附作用是不能忽略的。
克服表面吸附的办法：（1）减少表面接触的机会；（2）使 用非极性有机溶剂时 ，加入少量极性溶剂（如乙醇）；
一般溶剂效应：溶剂的折射率和介电常数对荧光物质荧 光性质的影响。
特殊溶剂效应：荧光物质和溶剂分子之间的特殊化学作 用，如氢键。
一般溶剂效应是普遍存在的 ，而特殊溶剂效应则决定于 溶剂和荧光体的化学结构。特殊溶剂效应所引起的荧光物质 的荧光性质的变化往往比一般溶剂效应所引起的显著 。
（三）温度
温度是溶液荧光的重要影响因素。 一般而言，溶液中荧光物质的荧光量子 产率和荧光强度随温度的降低而增强， 随着温度的升高而减弱。在检测温度系 数（温度每升高1°C，溶液荧光变化的 百分数）大的样品或进行荧光参数的精 确测量[如荧 光各向异性（荧光偏振） 的测定）时，应使用恒温装置。
3.荧光探针
DNA was stained with 7-aminoactinomycin D (A-1310), and microtubules were labeled with anti– -tubulin antibodies in conjunction with fluorescein-labeled secondary antibody
化学荧光探针
笼锁化合物探针
笼锁化合物全称为光不稳定笼锁化合物，是人工使用 掩蔽基团修饰生物活性分子而合成的无荧光前体化合 物。当该物质被强光照射后，两基团之间的共价键解 离而释放出活性分子，这个过程称为解笼锁。由于光 化学反应的速度快，生物分子不需要经过弥散过程就 可以在光解部位发挥作用；当与激光共焦扫描显微镜 联用时，就可以达到极高的时空分辨率（时间上可达 毫秒级，空间上可达到微米甚至更低）；加上光解过 程的强度、时间和范围均可控制，生物活性物质的释 放极易调节，从而为研究生理过程提供了一个强有力 的工具。
华中科技大学生物医学光子学研究所 Instituted for Biomedical Photonics, HUST
动 物 细 胞 结 构 示 意 图
荧光探针的分类
化学荧光探针: 化学方法合成的。 基因荧光探针: 可遗传、由DNA编 码、蛋白质组成的。
化学荧光探针
细胞活性探针
• 标记活细胞；酯酶底物探针、过氧 化物酶底物探针和离子泵活性指示 探针 • 识别死细胞：死细胞探针有膜不透 性DNA探针和丹磺酰赖氨酸。 • 优点：灵敏，安全。 • 其他方法：比色法、同位素示踪 法。
Microtubules were labeled with mouse monoclonal anti– -tubulin antibody, biotin-XX goat anti–mouse IgG (H+L) antibody (B-2770) and Cascade Blue NeutrAvidin (A-2663).
荧光探针医疗培训课件
2/3/2021
荧光探针医疗
11
实验部分
四、离子选择性
在5Lmol/L RA的乙腈/水(体积比 1：1)溶液中分别加入50Lmol/L 不同种类的常见金属离子,室温 下反应2 h.被测试的金属离子有 Na+, K+, Mg2+,Ca2+, Mn2+, Cd2+, Cr3+, Co2+, Ni2+, Ag+, Pb2+, Zn2+, Fe3+, Hg2+和Cu2。
2/3/2021
荧光探针医疗
10
实验部分
三、pH对RA荧光光谱的影响
结果表明,探针RA在较宽的pH范围 内(4.1~10.5)主要以螺环形式存在, 其水溶液既无颜色又几乎无荧光, 表明它是一个对pH不敏感的荧光 分子探针,经拟合计算得pKa=3.00. 本论文选用CH3CN/H2O(体积比 1:1)体系进行试验。
2/3/2021
荧光探针医疗
9
Байду номын сангаас
实验部分
二、溶剂体系对RA和Cu2+反应的影响
可见，纯水或在纯乙腈中，Cu2+和探 针RA之间相互作用不明显，体系的荧 光强度很弱。当CH3CN/H2O的体积比 在1B9~9B1之间时，探针RA可对Cu2+ 进行很好地识别。其中，CH3CN/H2O 的体积比为1：1时，荧光强度已接近 最大；再增加乙腈的含量，虽然体系 的荧光强度未降低，但增加有机试剂 的用量对环境和生物体系的测试均不 利，因此选择V(CH3CN) /V(H2O)=1： 1进行测试。
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荧光探针医疗
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实验部分
测定荧光光谱
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实验部分 处，请联反应的影响
可以看出，反应刚开始时体系荧光 增强的速率较快，但1 h后荧光增强 的速率变慢,，2 h后荧光强度变化 很小，几乎形成了一个平台，说明 RA和Cu2+的反应基本完成。 本文选择RA和Cu2+反应2 h后进行 测试。
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实验部分 处，请联系网站或本人删除。
二、溶剂体系对RA和Cu2+反应的影响
可见，纯水或在纯乙腈中，Cu2+和探 针RA之间相互作用不明显，体系的荧 光强度很弱。当CH3CN/H2O的体积比 在1B9~9B1之间时，探针RA可对Cu2+ 进行很好地识别。其中，CH3CN/H2O 的体积比为1：1时，荧光强度已接近 最大；再增加乙腈的含量，虽然体系 的荧光强度未降低，但增加有机试剂 的用量对环境和生物体系的测试均不 利，因此选择V(CH3CN) /V(H2O)=1： 1进行测试。
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测定荧光光谱
Cu2+浓度逐渐增大，RA的荧光 强度大幅度增加，最大发射波长 由565 nm红移到571 nm，也证 明了探针分子发生了开环，形成 了共轭体系较大的荧光体系。
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光诱导电子转移机理(PET过程)---荧光增强
“turn －on”类型 原理：识别基团很强的给电子能力，能够将其处于最高占有轨道(HOMO)上的电子,转
入激发态的荧光团因电子激发而空出的HOMO，从而使突光团被光激发的电子无 法直接跃迁回基态轨道发出突光,从而导致突光团辞灭；但是当识别基团与被识别 客体相结合后,识别基团的给电子能力降低，使受体的HOMO低于荧光团的HOMO， 导致PET过程减弱,或不再发生,突光团能够放出荧光。
大多数报道的铜离子荧光分子探针都是荧光猝灭型的。探针识别客 体时荧光猝灭不仅不利于高通量信号输出，而且其它猝灭过程也易引起 干扰，所以开发高灵敏、高选择性的荧光增强型铜离子荧光分子探针具 有重要意义。
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检测原理 处，请联系网站或本人删除。
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四、离子选择性
在5Lmol/L RA的乙腈/水(体积比 1：1)溶液中分别加入50Lmol/L 不同种类的常见金属离子,室温 下反应2 h.被测试的金属离子有 Na+, K+, Mg2+,Ca2+, Mn2+, Cd2+, Cr3+, Co2+, Ni2+, Ag+, Pb2+, Zn2+, Fe3+, Hg2+和Cu2。
除了Hg2+有很小的荧光响应外, 其它常见的共存金属离子未表 现出荧光增强性能。 因此, RA是一个高选择性荧光增 强型Cu2+探针。
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铜离子含量的测定
在6.5×10-8~2.9×10-6mol/L范围内， Cu2+的浓度与相对荧光强度(△F=F-F0） 呈良好的线性关系，线性回归方程为△ F=3.43c-0.07(c的单位是10-6mol/L),相关 系数R2=0. 9989.测定11次探针空白,得标 准偏差为5.72×10-8,以3倍标准偏差计算 得到检出限为5. 0×10-8mol/L。
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三、pH对RA荧光光谱的影响
结果表明,探针RA在较宽的pH范围 内(4.1~10.5)主要以螺环形式存在, 其水溶液既无颜色又几乎无荧光, 表明它是一个对pH不敏感的荧光 分子探针,经拟合计算得pKa=3.00. 本论文选用CH3CN/H2O(体积比 1:1)体系进行试验。
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目
录
Contents
0 1
研究背景
检测原理
0 2
0 3
实验部分
实验结论
0
4
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研究背景 处，请联系网站或本人删除。
Cu2 +
Cu2 + 生物体中基本的微量元素一; 生物体内过量摄入的铜也会产 生毒性; 采用荧光探针的方法检测铜离 子，尤其是跟踪其在化学反应 和生命活动中的作用过程具有 重要的意义．
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研究背景 处，请联系网站或本人删除。
常见的检测方法
01
02
03
04
05
分光光度法 电化学法 灵敏度较低 选择性较差
原子吸收 光谱法
高效液相色 谱法
对仪器要求 较 高、分析 成本高
对仪器要求 较高、分析
成本高
荧光光谱法
简便、快捷 灵敏度高、 选择性好、 成本低等优 点
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背景知识---荧光探针
• 典型的荧光探针由识别基团(受体)，荧光团和连接二者的 连接基团所组成。受体和底物结合后,导致受体分子光物理性 质的变化,具体表现为荧光团部分发生突光猝灭或增强。
检测原理 本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之 处，请联系网站或本人删除。
背景知识---荧光探针的机理 ￭顺磁性荧光猝灭 ￭光诱导电子转移机理 ￭光诱导电荷转移机理 ￭荧光共振能量传递 ￭激基缔合物或激基络合物的形成
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顺磁性突光猝灭---猝灭型荧光探针
Cu2+是d9结构的顺磁性离子，荧光团系统内交叉能量传递(isc)速度更快， 促进了体系间跨越，使得激发单重态的荧光分子转变至三重态，这是 荧光猝灭的主要原因，对荧光具有极强的猝灭。
可以看出，反应刚开始时体系荧光 增强的速率较快，但1 h后荧光增强 的速率变慢,，2 h后荧光强度变化 很小，几乎形成了一个平台，说明 RA和Cu2+的反应基本完成。 本文选择RA和Cu2+反应2 h后进行 测试。
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二、溶剂体系对RA和Cu2+反应的影响
可见，纯水或在纯乙腈中，Cu2+和探 针RA之间相互作用不明显，体系的荧 光强度很弱。当CH3CN/H2O的体积比 在1B9~9B1之间时，探针RA可对Cu2+ 进行很好地识别。其中，CH3CN/H2O 的体积比为1：1时，荧光强度已接近 最大；再增加乙腈的含量，虽然体系 的荧光强度未降低，但增加有机试剂 的用量对环境和生物体系的测试均不 利，因此选择V(CH3CN) /V(H2O)=1： 1进行测试。
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测定荧光光谱
Cu2+浓度逐渐增大，RA的荧光 强度大幅度增加，最大发射波长 由565 nm红移到571 nm，也证 明了探针分子发生了开环，形成 了共轭体系较大的荧光体系。
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光诱导电子转移机理(PET过程)---荧光增强
“turn －on”类型 原理：识别基团很强的给电子能力，能够将其处于最高占有轨道(HOMO)上的电子,转
入激发态的荧光团因电子激发而空出的HOMO，从而使突光团被光激发的电子无 法直接跃迁回基态轨道发出突光,从而导致突光团辞灭；但是当识别基团与被识别 客体相结合后,识别基团的给电子能力降低，使受体的HOMO低于荧光团的HOMO， 导致PET过程减弱,或不再发生,突光团能够放出荧光。
大多数报道的铜离子荧光分子探针都是荧光猝灭型的。探针识别客 体时荧光猝灭不仅不利于高通量信号输出，而且其它猝灭过程也易引起 干扰，所以开发高灵敏、高选择性的荧光增强型铜离子荧光分子探针具 有重要意义。
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四、离子选择性
在5Lmol/L RA的乙腈/水(体积比 1：1)溶液中分别加入50Lmol/L 不同种类的常见金属离子,室温 下反应2 h.被测试的金属离子有 Na+, K+, Mg2+,Ca2+, Mn2+, Cd2+, Cr3+, Co2+, Ni2+, Ag+, Pb2+, Zn2+, Fe3+, Hg2+和Cu2。
除了Hg2+有很小的荧光响应外, 其它常见的共存金属离子未表 现出荧光增强性能。 因此, RA是一个高选择性荧光增 强型Cu2+探针。
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铜离子含量的测定
在6.5×10-8~2.9×10-6mol/L范围内， Cu2+的浓度与相对荧光强度(△F=F-F0） 呈良好的线性关系，线性回归方程为△ F=3.43c-0.07(c的单位是10-6mol/L),相关 系数R2=0. 9989.测定11次探针空白,得标 准偏差为5.72×10-8,以3倍标准偏差计算 得到检出限为5. 0×10-8mol/L。
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三、pH对RA荧光光谱的影响
结果表明,探针RA在较宽的pH范围 内(4.1~10.5)主要以螺环形式存在, 其水溶液既无颜色又几乎无荧光, 表明它是一个对pH不敏感的荧光 分子探针,经拟合计算得pKa=3.00. 本论文选用CH3CN/H2O(体积比 1:1)体系进行试验。
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研究背景
检测原理
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实验部分
实验结论
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Cu2 +
Cu2 + 生物体中基本的微量元素一; 生物体内过量摄入的铜也会产 生毒性; 采用荧光探针的方法检测铜离 子，尤其是跟踪其在化学反应 和生命活动中的作用过程具有 重要的意义．
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常见的检测方法
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分光光度法 电化学法 灵敏度较低 选择性较差
原子吸收 光谱法
高效液相色 谱法
对仪器要求 较 高、分析 成本高
对仪器要求 较高、分析
成本高
荧光光谱法
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背景知识---荧光探针
• 典型的荧光探针由识别基团(受体)，荧光团和连接二者的 连接基团所组成。受体和底物结合后,导致受体分子光物理性 质的变化,具体表现为荧光团部分发生突光猝灭或增强。
检测原理 本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之 处，请联系网站或本人删除。
背景知识---荧光探针的机理 ￭顺磁性荧光猝灭 ￭光诱导电子转移机理 ￭光诱导电荷转移机理 ￭荧光共振能量传递 ￭激基缔合物或激基络合物的形成
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顺磁性突光猝灭---猝灭型荧光探针
Cu2+是d9结构的顺磁性离子，荧光团系统内交叉能量传递(isc)速度更快， 促进了体系间跨越，使得激发单重态的荧光分子转变至三重态，这是 荧光猝灭的主要原因，对荧光具有极强的猝灭。