关于生物技术概论基因工程课件
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1、DNA酶切法
2、PCR法
3、DNA测序法
ddATP
模板+dNTP+测序引物+测序Taq酶
ddTTP
ddGTP
ddCTP
三、目的基因的表达载体构建
目的基因片段经验证正确后，需构建适合于受 体生物的基因表达载体。
表达载体的构建过程就是把目的基因的阅读框 架(编码序列)插入适宜的表达载体(空)的启动子、终 止子中间，形成表达框架。
(二)基因克隆步骤 1、目的基因片段的获得：PCR、酶切获得 2、目的基因片段的分离纯化：
电泳：分离 回收：从胶内提取、纯化并定量。 3、目的基因片段与克隆载体连接： 平末端连接：平末端酶酶切获得的或粘末端经补平后的片段的 连接。 粘末端连接：粘末端酶酶切后获得的片段的连接。 T/A克隆：经常规PCR反应获得的片段的连接。 4、目的基因片段重组克隆载体筛选验证 5、目的基因片段复制
抗性基因：Npt II：新霉素磷酸转移酶基因，抗卡那霉素
Hyg: 潮霉素磷酸转移酶基因,抗潮霉素 gentR:庆大霉素抗性 基因，抗庆大霉素 AmpR:氨苄青霉素抗性基因，抗青霉素类 TETR:四环素抗性基因,抗四环素 报告基因：Gus:催化溴取代葡萄糖转化无色-蓝色反应 Gfp:绿色荧光蛋白，合成绿色荧光蛋白 Lac（z）:催化溴取代半乳糖无色-蓝色转化反应
表达框架：启动子-目的基因的ORF-终止子
1、表达载体的作用：使该基因能够被 导入新的生物体、进行自主或整合复制并 在生物体中启动和表达。
一般情况下有三个串联的表达框架：-1-2-31、启动子-抗性基因的ORF-终止子 2、启动子-目的基因的ORF-终止子 3、启动子-报告基因的ORF-终止子
常用选择标记(编码基因):
关于生物技术概论 基因工程
➢基因片段的获得、验证和表达载体构建
为体外DNA重组，一般认为是基因工程的上 游技术；
➢转化和转化体筛选主要是进行目的基因
向目标生物体内的转移、体内重组和重组 体筛选鉴定，称为基因工程的下游技术。
基因片段获得 基因克隆验证
表达载体 构建
目的基因片段获得
克隆载体(空)
目的基因克隆载体
N 插入片段测序验证
Y
切出片段
表达载体(空)
目的基因表达载体
表达载体验证
N
Y
转化
Y
导入工程菌或病毒
介导生物验证
N
Fra Baidu bibliotek
直接转化
Y 生物介导转化
N
受体抗性筛选
N
Y
目的基因DNA检测
筛选
目的基因RNA检测
目的Protein检测 Protein 活性检测
室内\田间功能验证
一、目的基因的获得
1、目的基因 基因工程中用来改造生物个体或用于生产某种产物的有用基因。 2、目的基因获得方法 （1）化学合成法：按照预先设计的DNA序列，通过化学反应合成目 的基因片段的方法。
（2） PCR法：参照已知基因序列，在该基因序列 保守区域设计两个引物，用PCR反应获得两个 引物之间该基因DNA序列的方法。 引物来源：已知基因序列 片段获得：PCR 优点：操作容易、目的性强 缺点：不能克隆未知基因或序列同源性较 差的基因，含内含子
(3)RT-PCR法：参照已知基因序列，在该基因序 列保守区域设计两个引物，用PCR反应获得两个引 物之间该基因编码序列(mRNA)的方法。
（5）cDNA文库法：以生物体内mRNA合成cDNA 后直接克隆构建成cDNA文库，从中查找有用基因的 方法。
片段来源：mRNA逆转录 克隆载体：质粒载体 优点：便于获得表达的基因的序列，获得得 序列为编码序列无内含子，费用较低 缺点：无法获得未表达或表达水平较低基因
（六）T-DNA标签法 （七）mRNA差异显示法 （八）反向克隆法
(三)基因重组克隆筛选
将已经连接外源基因的载体(DNA)向受体生物 细胞中导入，从大量的受体中筛选出成功导入目 的基因克隆载体的个体，称为重组克隆筛选。
一般克隆载体的受体生物为大肠杆菌。常用 的筛选方法有两种：
1、抗生素抗性筛选 2、菌落蓝、白斑筛选
pUC19
筛选结果模式图
(四)载体上插入基因片段的验证
二、目的基因的克隆
在获得了目的基因片段后，为了 便于下一步操作，常需将该片段克隆 到克隆载体上，进行大量复制，并验 证该片段序列是否正确。
(一)克隆定义：
1．克隆(名词)：通过无性繁殖形成的与其 亲本一致的生物群体。
2．克隆(动词)：生物的无性繁殖。 3. 基因克隆：将目的基因片段连接到克隆
载体上并进行大量复制的过程。
合成方向：3-5 合成长度：10-500bp 优点：目的性强，商业化程度高、自动化程度较高
缺点：合成长度有限，设备昂贵
乙腈亚磷酸胺化学合成法 Step1：对在担体上的第一个碱基进行脱保护（DMTr基） 反应，用以准备附加下一个新的碱基。 Step2：活化新的碱基，准备和前一个碱基进行反应。 Step3：第二个碱基附加反应到第一个碱基上。 Step4：把第一个碱基没有和第二个碱基反应上的部分（反 应失败部分）加帽封死（Capping反应)，不让其进行进一 步延伸反应。 Step5：对第二个碱基和第一个碱基的连接部分进行氧化反 应，使3价磷变成5价磷，使合成产物变得更加稳定。如需 进一步合成延伸碱基时，再回到Step1进行合成。如此循环 往复，可以不断合成DNA碱基，直至合成完所需序列 Step6：从CPG担体上用氨水切离合成终了的Oligo DNA。
引物来源：已知基因序列 片段获得：RT-PCR 优点：操作容易、目的性强 缺点：不能克隆未知基因或序列同源性较差的基因
（4）基因组文库法：将基因组DNA切割成片段后 ，直接克隆构建成基因组文库，从基因组文库中 查找有用克隆的编码序列的方法。
片段切割：识别序列为4碱基的限制性内切酶 克隆载体：病毒、噬菌体、酵母人工染色体 优点：能够获得未知基因，能够对基因组所有基因进行研究 缺点:序列含内含子,基因通用性较差
2、生物表达系统的特异性
不同生物中，启动基因的表达需要不同的启 动子，在原核生物中，需要原核生物启动子和终止 子；在植物中，需要适合植物的启动子和终止子。
在原核生物中，经常使用的启动子有：T3、T7 和SP6启动子。
在植物中，经常使用的启动子有：CaMV 35S启
动子，胭脂碱合成酶基因终止子。
2、PCR法
3、DNA测序法
ddATP
模板+dNTP+测序引物+测序Taq酶
ddTTP
ddGTP
ddCTP
三、目的基因的表达载体构建
目的基因片段经验证正确后，需构建适合于受 体生物的基因表达载体。
表达载体的构建过程就是把目的基因的阅读框 架(编码序列)插入适宜的表达载体(空)的启动子、终 止子中间，形成表达框架。
(二)基因克隆步骤 1、目的基因片段的获得：PCR、酶切获得 2、目的基因片段的分离纯化：
电泳：分离 回收：从胶内提取、纯化并定量。 3、目的基因片段与克隆载体连接： 平末端连接：平末端酶酶切获得的或粘末端经补平后的片段的 连接。 粘末端连接：粘末端酶酶切后获得的片段的连接。 T/A克隆：经常规PCR反应获得的片段的连接。 4、目的基因片段重组克隆载体筛选验证 5、目的基因片段复制
抗性基因：Npt II：新霉素磷酸转移酶基因，抗卡那霉素
Hyg: 潮霉素磷酸转移酶基因,抗潮霉素 gentR:庆大霉素抗性 基因，抗庆大霉素 AmpR:氨苄青霉素抗性基因，抗青霉素类 TETR:四环素抗性基因,抗四环素 报告基因：Gus:催化溴取代葡萄糖转化无色-蓝色反应 Gfp:绿色荧光蛋白，合成绿色荧光蛋白 Lac（z）:催化溴取代半乳糖无色-蓝色转化反应
表达框架：启动子-目的基因的ORF-终止子
1、表达载体的作用：使该基因能够被 导入新的生物体、进行自主或整合复制并 在生物体中启动和表达。
一般情况下有三个串联的表达框架：-1-2-31、启动子-抗性基因的ORF-终止子 2、启动子-目的基因的ORF-终止子 3、启动子-报告基因的ORF-终止子
常用选择标记(编码基因):
关于生物技术概论 基因工程
➢基因片段的获得、验证和表达载体构建
为体外DNA重组，一般认为是基因工程的上 游技术；
➢转化和转化体筛选主要是进行目的基因
向目标生物体内的转移、体内重组和重组 体筛选鉴定，称为基因工程的下游技术。
基因片段获得 基因克隆验证
表达载体 构建
目的基因片段获得
克隆载体(空)
目的基因克隆载体
N 插入片段测序验证
Y
切出片段
表达载体(空)
目的基因表达载体
表达载体验证
N
Y
转化
Y
导入工程菌或病毒
介导生物验证
N
Fra Baidu bibliotek
直接转化
Y 生物介导转化
N
受体抗性筛选
N
Y
目的基因DNA检测
筛选
目的基因RNA检测
目的Protein检测 Protein 活性检测
室内\田间功能验证
一、目的基因的获得
1、目的基因 基因工程中用来改造生物个体或用于生产某种产物的有用基因。 2、目的基因获得方法 （1）化学合成法：按照预先设计的DNA序列，通过化学反应合成目 的基因片段的方法。
（2） PCR法：参照已知基因序列，在该基因序列 保守区域设计两个引物，用PCR反应获得两个 引物之间该基因DNA序列的方法。 引物来源：已知基因序列 片段获得：PCR 优点：操作容易、目的性强 缺点：不能克隆未知基因或序列同源性较 差的基因，含内含子
(3)RT-PCR法：参照已知基因序列，在该基因序 列保守区域设计两个引物，用PCR反应获得两个引 物之间该基因编码序列(mRNA)的方法。
（5）cDNA文库法：以生物体内mRNA合成cDNA 后直接克隆构建成cDNA文库，从中查找有用基因的 方法。
片段来源：mRNA逆转录 克隆载体：质粒载体 优点：便于获得表达的基因的序列，获得得 序列为编码序列无内含子，费用较低 缺点：无法获得未表达或表达水平较低基因
（六）T-DNA标签法 （七）mRNA差异显示法 （八）反向克隆法
(三)基因重组克隆筛选
将已经连接外源基因的载体(DNA)向受体生物 细胞中导入，从大量的受体中筛选出成功导入目 的基因克隆载体的个体，称为重组克隆筛选。
一般克隆载体的受体生物为大肠杆菌。常用 的筛选方法有两种：
1、抗生素抗性筛选 2、菌落蓝、白斑筛选
pUC19
筛选结果模式图
(四)载体上插入基因片段的验证
二、目的基因的克隆
在获得了目的基因片段后，为了 便于下一步操作，常需将该片段克隆 到克隆载体上，进行大量复制，并验 证该片段序列是否正确。
(一)克隆定义：
1．克隆(名词)：通过无性繁殖形成的与其 亲本一致的生物群体。
2．克隆(动词)：生物的无性繁殖。 3. 基因克隆：将目的基因片段连接到克隆
载体上并进行大量复制的过程。
合成方向：3-5 合成长度：10-500bp 优点：目的性强，商业化程度高、自动化程度较高
缺点：合成长度有限，设备昂贵
乙腈亚磷酸胺化学合成法 Step1：对在担体上的第一个碱基进行脱保护（DMTr基） 反应，用以准备附加下一个新的碱基。 Step2：活化新的碱基，准备和前一个碱基进行反应。 Step3：第二个碱基附加反应到第一个碱基上。 Step4：把第一个碱基没有和第二个碱基反应上的部分（反 应失败部分）加帽封死（Capping反应)，不让其进行进一 步延伸反应。 Step5：对第二个碱基和第一个碱基的连接部分进行氧化反 应，使3价磷变成5价磷，使合成产物变得更加稳定。如需 进一步合成延伸碱基时，再回到Step1进行合成。如此循环 往复，可以不断合成DNA碱基，直至合成完所需序列 Step6：从CPG担体上用氨水切离合成终了的Oligo DNA。
引物来源：已知基因序列 片段获得：RT-PCR 优点：操作容易、目的性强 缺点：不能克隆未知基因或序列同源性较差的基因
（4）基因组文库法：将基因组DNA切割成片段后 ，直接克隆构建成基因组文库，从基因组文库中 查找有用克隆的编码序列的方法。
片段切割：识别序列为4碱基的限制性内切酶 克隆载体：病毒、噬菌体、酵母人工染色体 优点：能够获得未知基因，能够对基因组所有基因进行研究 缺点:序列含内含子,基因通用性较差
2、生物表达系统的特异性
不同生物中，启动基因的表达需要不同的启 动子，在原核生物中，需要原核生物启动子和终止 子；在植物中，需要适合植物的启动子和终止子。
在原核生物中，经常使用的启动子有：T3、T7 和SP6启动子。
在植物中，经常使用的启动子有：CaMV 35S启
动子，胭脂碱合成酶基因终止子。