金雀异黄素对血管平滑肌细胞中活性氧生成的影响

金雀异黄素对血管平滑肌细胞中活性氧生成的影响作者：冯赞杰，李琴山，刘洋，陆红玲，余晓【摘要】目的：探讨金雀异黄素对氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein, ox LDL）诱导的血管平滑肌细胞中活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成的影响。

方法：以体外培养的人脐静脉平滑肌细胞（human umbilical vein smooth muscle cell, hUVSMC）为对象，用50 mg/L的ox LDL作用细胞2 h，并加入不同浓度金雀异黄素(10, 30, 90 μmol/L)对其进行干预，应用流式细胞技术和荧光分光光度法分别检测细胞内总ROS水平。

结果：hUVSMC经ox LDL刺激2 h后，细胞内ROS水平明显升高（P<0.01）；金雀异黄素（10 μmol/L）降低ox LDL诱导的细胞内ROS的增加；金雀异黄素（30, 90 μmol/L）则进一步提高细胞内ROS水平。

结论：金雀异黄素（10 μmol/L）可清除细胞内ROS，而金雀异黄素（30, 90 μmol/L）则增加细胞内ROS的生成。

【关键词】金雀异黄素；活性氧；氧化型低密度脂蛋白；血管平滑肌细胞［Abstract］Objective: To investigate the effect of genistein on reactive oxygen species(ROS) production in vascular smooth muscle cell(VSMC) induced by oxidized low density lipoprotein(ox LDL).Methods： Human umbilical vein smooth muscle cells were pretreated with genistein in differentconcentrations(10, 30, 90 μmol/L) and then treated by 50 mg/L of ox LDL for 2 hours. The levels of ROS were determined by using flowcytometry and fluorospectrophotometry. Results： The level of ROS in VSMC could be enhanced by ox LDL, genistein(10 μmol/L) might decrease the level of ROS induced by ox LDL, but when the concentration of genistein arrived at 30 μmol/L and 90 μmol/L respectively, it could further enhance the content of ROS. Conclusion： Genistein(10 μmol/L) might remove ROS, but genistein(30, 90 μmol/L) induced the generation of ROS in VSMC.［Key words］genistein; reactive oxygen species; oxidized low density lipoprotein; vascular smooth muscle cell 金雀异黄素又名染料木黄酮，富含于豆类植物中，化学结构为5, 7, 4′三羟异黄酮，属于植物雌激素［1］。

金雀异黄素具有心血管保护、抗肿瘤、抗氧化、防治骨质疏松、治疗绝经期综合征等多方面药理作用，有着广泛的应用前景。

目前，关于金雀异黄素潜在的不良反应及毒性作用正在研究之中。

已有研究发现，金雀异黄素的多种不良反应及毒性作用与其浓度有关，如高浓度金雀异黄素可导致鼠不育、胚胎畸形及神经毒性作用［2，3］；另外，金雀异黄素的某些作用具有双重性，如低浓度金雀异黄素可增加骨质的密度，而高浓度则对骨生成有抑制作用［4］。

抗氧化作用是金雀异黄素的基本药理作用。

Kruk等［5］报道，金雀异黄素可抑制活性氧（reactive oxygen species, ROS）的生成，抑制作用随金雀异黄素浓度增加而增强，呈剂量依赖关系。

而我室研究结果与其有一定差异，现报告如下。

1 材料与方法1.1 材料金雀异黄素（Sigma公司，lot：G6649）；改良Eagle培养基（DMEM，Gibco公司，lot：1136551）；胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)；胎牛血清（FBS，北京华美公司）；二甲基亚砜（DMSO，Amresco 公司）；2′,7′二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH DA，Sigma公司）；丙二醛（MDA）试剂盒、标准蛋白（南京建成生物公司）；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法1.2.1 人脐静脉血管平滑肌细胞培养采用张闻宇等［6］改良的贴壁法进行人脐静脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的原代培养，将培养的VSMC在倒置显微镜下观察并拍照，用平滑肌细胞特异性α-肌动蛋白（αactin）单克隆抗体免疫组织化学方法进行鉴定。

本实验所用细胞均为第3代。

1.2.2 低密度脂蛋白的分离鉴定和氧化修饰参照张林华等［7］一次性密度梯度超速离心法分离人血浆低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)，参照Kerry等［8］的方法对提取的LDL进行氧化修饰。

采用MDA试剂盒测定MDA值，判定LDL是否已氧化，用琼脂糖凝胶电泳鉴定氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox LDL）的纯度及氧化度。

1.2.3 实验分组分为6组：对照组；ox LDL（50 mg/L）组；ox LDL（50 mg/L）＋DMSO（0.5 ml/L）组；金雀异黄素（10, 30, 90 μmol/L）＋ox LDL （50 mg/L）组（分别标为: G1, G2, G3组）。

由于金雀异黄素易溶于DMSO和乙醇，几乎不溶于水，所以本实验用DMSO溶解金雀异黄素，DMSO在培养液中的终浓度为0.5 ml/L，为了消除DMSO对实验的干扰，特设ox LDL（50 mg/L）＋DMSO（0.5 ml/L）组为对照。

1.2.4 流式细胞仪检测VSMC中总ROS水平取生长状态良好的细胞，0.06%胰蛋白酶消化后以5×105细胞/瓶接种于25 cm2培养瓶内，孵育24 h后，换为含1% FBS的DMEM 液作用22 h，使细胞同步化。

更换PBS液，按分组加入金雀异黄素或DMSO预先孵育2 h，加入终浓度为50 mg/L的ox LDL作用1.5 h后各组再加入终浓度为10 μmol/L 的DCFH DA。

37℃避光孵育0.5 h 后，用含EDTA的胰蛋白酶消化细胞并收集至离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清。

每管沉淀内加入300 μl PBS吹散细胞，避光。

用流式细胞仪（美国BD公司）检测10 000个细胞内的平均荧光强度（激发波长488 nm，发射波长530 nm）。

1.2.5 荧光分光光度法检测VSMC中总ROS水平细胞处理同“μmol/L 的DCFH DA，37 ℃避光孵育0.5 h 后，取细胞，用荧光酶标仪（Applied Biosystems公司）测定荧光强度。

1.3 统计方法应用SPSS 13.0 统计软件进行数据处理，结果用±s表示。

采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 细胞培养与鉴定培养的细胞在显微镜下观察，呈现典型的“峰、谷”样结构特征（图1）。

αactin单克隆抗体免疫组织化学结果显示95%以上为阳性。

证明所培养的细胞为血管平滑肌细胞，并且纯度符合实验要求。

2.2 鉴定氧化修饰的LDL琼脂糖凝胶电泳结果显示ox LDL样品电泳迁移率明显大于LDL，Cu2＋氧化的LDL样品中MDA值为18.6～20.6 mmol/L，说明LDL 已充分氧化。

2.3 流式细胞仪检测VSMC中总ROS结果通过用流式细胞仪对各组细胞内产生的荧光强度进行测定，结果表明：与对照组相比，ox LDL可明显诱导细胞内ROS的增加，细胞内荧光强度由11.06±0.75增至30.65±2.09(P<0.01)。

与ox LDL＋DMSO组相比，金雀异黄素（10 μmol/L）可降低ox LDL 诱导的细胞内ROS的增加，细胞内荧光强度由27.93±1.63降至20.93±1.97(P<0.01)；而金雀异黄素（30，90 μmol/L）则可进一步提高ox LDL诱导的细胞内ROS的增加，细胞内荧光强度分别增至39.22±2.39和34.31±0.97(P<0.01)。

2.4 荧光分光光度法检测VSMC中总ROS结果用荧光酶标仪检测细胞内总ROS含量，结果如图2所示，与对照组相比，ox LDL组荧光强度明显升高(P<0.01)；预先加入终浓度为10 μmol/L的金雀异黄素进行干预后，细胞内荧光强度显著降低(P<0.01)；而30, 90 μmol/L金雀异黄素则可进一步增加细胞内荧光强度(P均<0.01)。

3 讨论已有研究表明，金雀异黄素具有抗动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）作用，但具体机制仍不完全清楚。

目前认为，血管壁细胞氧化应激产生过量的ROS是引发As的一个重要机制。

ROS 可通过激活核因子кB，诱导VSMC、血管内皮细胞和巨噬细胞表达多种炎症相关因子，参与血管壁炎症反应；还可刺激VSMC的增殖，从而促进As的发生发展。

金雀异黄素是公认的抗氧化剂，它能否通过抑制血管壁细胞内ROS的生成发挥抗As作用是我们感兴趣的问题。

氧化应激能引起血浆中LDL氧化修饰生成ox LDL。

ox LDL是致As的重要因素，并可诱导VSMC、血管内皮细胞产生ROS［9］。

应用流式细胞术和荧光分光光度法两种方法对VSMC中ROS 水平进行测定，结果均显示：当金雀异黄素浓度为10 μmol/L时，可降低VSMC中ox LDL诱导产生的ROS；当浓度达到30, 90 μmol/L 时，金雀异黄素反而促进ROS的生成。

金雀异黄素这样的双重作用可能与其分子结构及浓度有关。

研究表明，黄酮类化合物的抗氧化活性是由它分子结构中的酚羟基的数目及分布决定［10］，金雀异黄素属于黄酮类化合物中的异黄酮，其分子结构中含5，7，4′三个酚羟基，10 μmol/L金雀异黄素的酚羟基可能作为供氢体与自由基反应，使之形成相应的离子或分子，熄灭自由基，发挥其消除ROS作用；也有研究发现，某些黄酮类化合物发挥促氧化作用与其具体分子结构或浓度有关［11］， 30, 90 μmol/L金雀异黄素为什么导致ROS生成增加，值得深入研究。