植物微卫星引物开发方法_郭大龙

植物微卫星引物开发方法郭大龙　(河南科技大学林学院,河南洛阳471003)摘要　综述了开发植物微卫星引物的几种方法:搜寻核酸数据库和寻找已存在的微卫星引物;不同物种间共用;建立基因组文库;利用分子标记技术发展S SR引物。

此外,还比较了几种方法的优缺点。

关键词　微卫星;引物;开发;植物中图分类号　S127 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2007)18-05361-03Developm ent of the Micro satellite Prim er in Pla ntGU O Da-long　(College of Forestry,Henan University of Science and Techn ology,Luoyan g,Henan471003)A bstract　In this paper s everal methods of developing microsatellite primers in plants were su m marized:①to search the Database and find th e primers which were delivered;②to transfer them among the differen t s pecies;③to establis h gen omic library;④to d evelop SSR pri mer based on moleculars mark-ers.Furthermore,the ad vantages an d disadvantages of t he d ifferent methods were comp ared.Key w ords　Microsatellite;Prim er;Develop ment;Plan t 微卫星(Micr osa tellite,又叫Simple Seque nc e R epeat,SSR)以1～6bp的短核苷酸为基本单位,呈串联重复状广布于生物体整个基因组,具有分布广泛、多态性丰富、易于检测、进化所受选择压小、信息量大、以孟德尔方式分离、共显性遗传等特点。

在遗传多样性检测、种质鉴定及系谱分析、遗传连锁图谱构建、基因定位与标记辅助育种等领域中得到广泛应用。

微卫星标记检测的位点多态性水平明显高于R FL P标记,而且重复性优于R APD,与AFLP相比,不同的材料结果略有不同[1]。

随着微卫星标记在图谱上的丰富,将显现出更大的优势[2]。

但微卫星分析中引物的获得需要预先获知核酸序列,其广泛应用受限于从特定的物种中分离微卫星位点的难度和花费[3]。

因而微卫星引物的开发是应用该技术的关键。

何平[4]、唐荣华等[5]、Za ne等[6]对微卫星引物的开发方法作了一些综述。

笔者就微卫星引物开发及其最新进展进行了系统总结,并对这些方法的优劣加以比较。

1　搜寻核酸数据库和寻找已存在的微卫星引物从公用的D NA序列数据库(Ge nBa nk EMBL和DD BJ等)或从已发表的文章中查找所研究物种的微卫星DN A两翼序列和引物,在时间和费用上无疑都是最经济的[7]。

从数据库查询的方法已成功地用于许多物种,例如大豆[8]、玉米[9]、水稻[10]的微卫星标记。

Ka ntety等[11]分析了大麦、玉米、水稻、高粱和小麦核酸数据库中的序列,对发展微卫星引物的可能性进行了分析。

Ga o等[12]从小麦EST中分离出101个新的微卫星引物。

但是对大部分物种而言,已知序列信息远不能满足微卫星引物设计的需要。

随着大规模测序和EST计划的进行,cD NA和其他的序列信息会不断地注册到数据库中,可以获得的微卫星位点的数目会越来越多。

从发表的文献中搜索已经开发出的微卫星引物,也是个便捷方法。

在《Molec ular Ec olog y Notes》和《Conserva tion ge net-ic s》上还刊登有不同的物种中新发现的微卫星引物。

2　不同物种间共用微卫星侧翼序列在相近物种中具有一定的保守性,因而基金项目　河南科技大学人才科学研究基金。

作者简介　郭大龙(1978-),男,湖北十堰人,博士,副教授,从事种质资源和生物技术研究。

收稿日期　2007-03-03某一物种的微卫星引物可以在其相近的物种中使用,这样就大大地减少了检测微卫星位点的工作量。

微卫星在近缘种之间的通用性已有研究,但在属间应用还不多。

目前已知大豆[8]、水稻[13]、葡萄[14]等类群发展的专一的微卫星引物可在近缘种之间使用,同样在柑橘属[15]、芸薹属[16]以及猕猴桃属[17]的不同种之间可以共享某些引物。

Cipria ni等[18]从桃中开发的引物,能在桃属的栽培桃、罐藏桃中扩增出多态性片段,在近缘种如日本李、欧洲李、杏、甜樱桃和酸樱桃上也可得到扩增片段。

油橄榄中开发的微卫星引物在木樨科中的不同属中得到成功地扩增[19]。

苹果中分离的微卫星引物在梨的遗传多样性分析中得到成功地应用[20]。

Gao等[21]统计了水稻、小麦、大豆和玉米序列中的微卫星的类型和频率,从小麦中开发的引物有近一半在水稻、玉米和大豆中得到了成功扩增。

周涵滔等[22]利用从甘蓝型油菜中获得的2个微卫星引物对来自禾本科、十字花科、芸香科、锦葵科等12种经济作物的DN A进行PCR扩增,结果12份材料中所扩增出的主带大小一致。

总之,引物跨物种共用的有效程度可能与其亲缘关系的远近有关,但要确定微卫星引物在不同类群广泛应用的标准是困难的,目前对此尚无定论。

3　建立基因组文库建立基因组文库是开发微卫星引物中采用最多的方法,技术路线成熟。

基本步骤如下:①提取基因组D N A;②用限制性内切酶将基因组D NA切割成均匀的小片段,或者用超声波对基因组D NA进行断裂;③凝胶电泳,回收大小300～500bp的片段;④将回收片段克隆,使用标记探针进行杂交;⑤筛选出含有重复序列的克隆;⑥测序证实重复序列片段的存在;⑦在重复序列片段两端区域设计引物对,进行PCR扩增,检验引物的有效性;⑧对小量样本进行预试验,挑选出重复性好,具多态性的微卫星位点。

大多数的微卫星位点是用寡聚核苷酸探针从基因组文库中分离出来的。

从基因组文库中分离微卫星位点的传统方法在微卫星富集程度上效率很低,已经设计了很多方法用来提高效率,具体见Zane等[6]和Sdquirr ell等[26]的综述。

4　与分子标记技术结合4.1　利用RAPD筛选微卫星　Ender等[24]和Ue do等[25]通过R APD筛选微卫星。

他们首先在基因组D NA中进行R APD扩安徽农业科学,Journal of Anh ui Agri.Sci.2007,35(18):5361-5363 责任编辑　孙红忠　责任校对　李洪DOI:10.13989/ ki.0517-6611.2007.18.012增,然后在琼脂糖凝胶上电泳分离,片段通过Southern 杂交转移到尼龙膜上,与标记的微卫星探针进行杂交,阳性带纯化克隆后测序。

结果表明30个克隆中,21个包含微卫星。

该技术程序不需要建立和筛选基因组文库。

Ya ma moto 等[23]用此方法在梨中开发了8条微卫星引物。

Lunt 等[27]也采用R AP D 筛选微卫星,方法是先进行R APD 扩增,然后将扩增产物纯化后连接到质粒载体,转化大肠杆菌,用2套引物进行菌落PCR (M13正向和反向引物,M13正反向引物和重复序列引物),对2套PCR 体系产物有差别的克隆进行测序后设计引物。

Fr ydenberg 等[28]也采用相似的方法,不过他们是先进行总基因组D NA 酶切,然后电泳分离,片段纯化后克隆到载体中,再对克隆进行P CR 筛选。

用重复序列引物与SP6引物或者T7引物扩增,阳性克隆再用SP6和T7引物同时扩增,扩增产物纯化后测序。

4.2　利用AFLP 筛选微卫星　用链亲和素磁珠(Str epta vidin Ma gne Spher e Par amag enetic Pa rricles )来富集AFL P 片段中含微卫星的片段,是基于磁珠表面的链酶亲和素与标记于微卫星探针上的生物素之间的强且稳定的共价结合。

Ha kki 等[3]用AFL P 从小麦中分离微卫星位点。

方法是先进行Vos 等[29]的AFL P 预扩增。

预扩增产物与用生物素标记的微卫星探针进行杂交和吸附,洗涤非微卫星片段后,用相应AFL P 引物扩增收集到的D N A ,片段克隆测序后设计引物进行微卫星扩增。

Gao 等[30]从花生中选取了14个克隆测序,全部包含微卫星,其中5个为简并序列,7个用来设计引物,在花生中表现都较好。

He 等[31]也从花生中分离出了微卫星引物。

此外,Za ne 等[6]提出了一种称为FI ASCO (Fast Isolation by AFLP of Se -quences Containing Repe ats )的方法,实质上与Hakki 等[3]的方法相似。

Ya ma moto 等[32]用类似的方法从梨中开发出14对引物。

4.3　利用IS SR 筛选微卫星　I SSR (I nter -Simple Sequence Re -peat ),是Ziethle wic a 等[33]发展起来的一种基于微卫星的分子标记,与微卫星标记不同,该法是直接利用微卫星序列为引物,用P CR 扩增两个位于反向排列的微卫星之间的序列。

一套ISSR 引物可用于不同的物种。

Fisher 等[34]采用(CT )n 为核心序列,并在5′端锚定几个单核苷酸为引物,进行扩增得到P CR 产物,将这些产物回收纯化并克隆,对其中15个阳性克隆测序,发现13个含有(CT )n 重复,它们不仅存在于P CR 产物两端,亦存在于P CR 产物中间。

Davila 等[35]利用5′端锚定ISSR 引物扩增,对所得到的4个多态片段克隆测序,发现1个微卫星DN A 重复序列。

利用I SSR 片段克隆微卫星,测序后因重复片段核心序列所在区域大都在末端,一般情况下只能得到微卫星一端的引物,为了获得另一端的引物,应进行第2次克隆测序,须采用染色体步行的方法,设计出另一端引物,以获得一对完整的微卫星引物。

实际应用时主要有Vector ette PCR [36]和抑制PCR[37]两种。

Lench 等[38]采用Vectorette PCR ,用锚定的重复序列引物分离微卫星,从人的AMlDX 基因克隆中获得6个微卫星DN A 。

Ujino 等[39]用Vectorette PCR 从柯氏娑罗双中分离到8对微卫星引物,并在娑罗双属和龙脑香科中成功扩增。