如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养
单克隆抗体的制作流程
单克隆抗体的制作流程一、前期准备工作1. 确定目标抗体：根据研究需求确定需要制备的单克隆抗体。
2. 筛选免疫原：选择适合的免疫原，如蛋白质、多肽、细胞等。
3. 动物选择：选择适合的动物，如小鼠、大鼠、兔子等。
4. 免疫计划设计：设计出合理的免疫计划，包括免疫剂量、次数、间隔时间等。
二、免疫过程1. 免疫原制备：将所选的免疫原纯化或合成后进行检测和确认。
2. 免疫动物注射：将免疫原与佐剂混合后注射到动物体内，按预定计划进行多次注射。
3. 血清采集：在最后一次注射后采集动物血清，检测抗体滴度是否达到预期水平。
三、杂交细胞制备1. 细胞系选择：选择适合的细胞系如SP2/0或NS0等。
2. 细胞培养：将细胞系培养至稳定生长状态，并进行筛选和确认。
3. 细胞融合：将免疫小鼠脾细胞与SP2/0或NS0细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤筛选：利用HAT培养基对杂交瘤进行筛选，筛选出产生单克隆抗体的杂交瘤。
四、单克隆抗体制备1. 单克隆细胞培养：将单个杂交瘤细胞进行单克隆分离和培养。
2. 单抗酶标法检测：利用ELISA等技术检测单克隆抗体的特异性和亲和力。
3. 大规模培养：将筛选出的单克隆细胞进行大规模培养，得到足够多的单克隆抗体。
4. 纯化和鉴定：通过亲和层析、离子交换层析等技术对单克隆抗体进行纯化，并进行质量鉴定。
五、应用1. 体外实验应用：如ELISA、Western blotting等技术中作为检测试剂使用。
2. 体内实验应用：如流式细胞术、组织切片染色等技术中作为荧光标记或特异性结合试剂使用。
3. 临床应用：如治疗肿瘤、自身免疫性疾病等方面的治疗药物。
六、总结单克隆抗体的制备流程包括前期准备工作、免疫过程、杂交细胞制备、单克隆抗体制备和应用等环节。
其中，前期准备工作和免疫过程是制备成功的关键，而单克隆抗体制备需要经过多次筛选和鉴定才能得到高质量的单克隆抗体。
单克隆抗体在医学和生命科学领域有着广泛的应用前景，对于推动科学发展具有重要意义。
筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附法是一种常用的免疫学检测方法，用于检测细 胞表面抗原或分泌型抗原。该方法的基本原理是将特异性抗 体与酶结合，然后与细胞表面抗原或分泌型抗原结合，最后 通过酶反应显色来检测抗原的存在。
克隆化培养
克隆筛选
通过有限稀释法或流式细胞术等 方法，将杂交瘤细胞克隆化培养 ，以获得单克隆杂交瘤细胞。
培养条件
提供适宜的培养条件，如适宜的 培养基、温度、气体等，以保证 杂交瘤细胞的生长与繁殖。
抗体检测与筛选
抗体筛选
通过抗原结合试验进一步筛选出具有 高亲和力和特异性的杂交瘤细胞克隆。
抗体纯化
对筛选出的杂交瘤细胞克隆产生的抗 体进行纯化，以提高抗体的纯度和特 异性。
荧光激活细胞分选法的优点是灵敏度高、分辨率高、操作自动化，适用于大量细 胞的筛选。但是，该方法需要使用
细胞融合
选择合适的骨髓瘤细胞与免疫细胞融合
01
选择具有高免疫反应的骨髓瘤细胞系，如SP2/0、X63-
Ag8.653等，与免疫细胞融合，以产生杂交瘤细胞。
生物制品生产
抗体生产
杂交瘤细胞可以作为生产抗体的重要来 源，用于生产治疗性抗体或诊断试剂。
VS
细胞培养技术
通过筛选高表达量的杂交瘤细胞，可以优 化细胞培养技术，提高生物制品的生产效 率和质量。
05
杂交瘤细胞筛选的挑战与解决方案
克隆不稳定问题
克隆不稳定是指杂交瘤细胞在培养过程中出现生长缓慢、 停滞甚至死亡的现象，导致难以获得稳定表达抗体的细胞 株。
克隆扩大培养与建株
人教版教学课件[名校联盟]福建省三明市泰宁一中生物选修三22《动物细胞工程》课件2
![人教版教学课件[名校联盟]福建省三明市泰宁一中生物选修三22《动物细胞工程》课件2](https://img.taocdn.com/s3/m/51e8fc1d866fb84ae45c8da2.png)
思考题
1.植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细胞壁？
酶解法，如纤维素酶或果胶酶 2.动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？ 无需，因为动物细胞无细胞壁 3.植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？ 离心、电激等物理方法；PEG等化学方法 4.动物细胞融能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？ 能 还可以利用灭活的病毒进行诱导 5.植物体细胞杂交应先进行原生质体的融合再进行组织培养形 成完整的杂种个体，动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗？ 不能
细胞A
物理法 化学法
细胞B
仙台病毒
灭活的病毒
疱疹病毒
新城鸡瘟病毒
杂交细胞
有丝分裂
动物 细胞 融合
用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程
病毒颗粒 细胞核
细胞核
动物细胞融合
植物细胞A 植物细胞B
去壁
原生质体B
原生质体A
动物细胞A
动物细胞B
融合
杂种细胞
物理法 化学法
生物法： 灭活的病毒
愈伤组织
组培
杂种细胞
①在基础理论研究中具有重要意义 ②在疾病诊断、治疗和预防方面，具有 特异性强、灵敏度高 等优越性。 ③生物导弹
总结
动物细胞培养过程 两个过程 单克隆抗体制备过程 一个诱导细胞融合的新方法 －－灭活的病毒 三个“一” 一个新细胞－－杂交瘤细胞 一个优势－－单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势
教学反馈
单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合 后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞。在这种培养基上不 能存活、增殖的细胞是 （ ） ①B淋巴细胞 淋巴细胞自身融合细胞 ②小鼠骨髓瘤细胞 ③ B
④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 胞
杂交瘤细胞培养方法
杂交瘤细胞培养方法
杂交瘤细胞培养方法：
1. 杂交瘤的制备：
将骨髓瘤细胞与抗原刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞。
2. 细胞培养：
将杂交瘤细胞接种于含有高浓度鸟嘌呤或潘孔霉素的无血清培养基中进行培养。
3. 无血清培养基的制备：
取无血清培养基中所需的基础培养液（例如：DMEM、RPMI 1640等），添加必要的生长因子、维生素、矿物质和氨基酸等，经过过滤和灭菌处理即可。
4. 细胞培养条件：
培养杂交瘤细胞时，需保持其在适宜的温度、CO2浓度和湿度下生长，通常在37℃、5% CO2气氛下进行培养。
5. 细胞检测：
在培养过程中，需定期检测细胞形态、增殖情况、表达抗原的能力等，以确保细胞的纯度和功能性。
注意事项：
为避免污染和交叉感染，需采取有效的无菌技术和严格的操作规范；同时，在培养过程中应注意细胞的生长情况和营养状况，及时调整培养条件以保证细胞的最佳生长状态。
杂交瘤细胞培养及其注意事项
杂交瘤细胞培养及其注意事项单克隆抗体的应用是一项迅速发展的技术。
本文阐述了单克隆抗体制备前杂交瘤细胞的培养条件和应用，包括细胞的培养、培养基的选择，融合时期的选择，从而指导和优化实验室中杂交瘤的培养，促进融合细胞的融合率和后继单克隆抗体筛选实验的顺利进行。
标签：杂交瘤；细胞培养；单克隆抗体随着杂交瘤细胞株不断的建立和生产单克隆抗体的日益广泛应用，杂交瘤细胞的培养和优化不断得到改善，但是国内实验室设备和条件有限，多数的单克隆抗体的筛选还是应用基础的免疫抗原包被，结合Elisa方法联合有限稀释法来筛选单克隆抗体。
为了获得特异性较强的杂交瘤细胞株，融合前后细胞的培养以及杂交瘤的培养和储存，仍是基础实验室中必须注意和重视的技术。
1杂交瘤的起源和生产1.1杂交瘤所用的骨髓瘤细胞系1966年Petingel等在体外培养小鼠浆细胞成功。
Milstein等1972年由P3中用20μg 8-氮杂鸟嘌呤（8-azaguanine）筛选出缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的新细胞系，称之为P3-X63-Ag8。
由于X63本身分泌IgG1，形成的杂交瘤除分泌B细胞的特异性抗体外，同时分泌X63产生的抗体，因其抗体不纯，现多改用不分泌型骨髓瘤细胞系。
国内现已引进NS-1，SP2/0，FO，X63-Ag8-653等小鼠骨髓瘤细胞系。
最常使用的是SP2/0及NS-1[1]。
1.2人骨髓瘤细胞系为产生稳定的人免疫球蛋白的杂交瘤，需要人的缺某种酶的骨髓瘤细胞系。
国外已筛选了一些人骨髓瘤细胞，但融合率不高，还没有推广使用。
目前人一人杂交瘤技术仍存在着杂交瘤在不同培养基中的生长速度问题。
细胞生长缓慢，抗体分泌力弱及效价较低，且难于克隆化等困难[2]，限制了人骨髓瘤细胞的应用。
1.3淋巴细胞和骨髓瘤细胞的关系B淋巴细胞容易与浆细胞瘤融合，而T细胞则需要同胸腺淋巴肉瘤融合（Kohler，et al. 1977；Schwaber，1977）。
杂交瘤细胞抗体收集和纯化
C-myc杂交瘤细胞培养及抗体纯化（骆洁）细胞培养培养基：Iscove’s DMEMFBS 10%Gentamicin （终浓度0.05 mg/ml ）相当于10 mg/ml的抗生素加0.5% 细胞形态：圆形，半悬浮状态，贴壁部分细胞比较大，圆，透明。
传代：细胞复苏后让它在6 cm plate 中生长，两天左右后，细胞开始快速分裂生长，隔天1：4传代。
传代时不需要胰酶，用移液枪将贴壁部分细胞轻轻吹下来后，连同上清一起离心，1200 rpm，5min。
沉淀下来的细胞用10%FBS完培悬浮后1：4传代。
在传代过程中得到的上清培养液可以转移到另外一个容器中冻到-80度保存，最后一起进行抗体纯化。
抗体收集：当细胞扩增到足够的数量，用含5%FBS的培养基培养来分泌蛋白，通常养3-5天后收集上清用于纯化，此时的细胞已经很老，因此收集上清后就弃之。
收集到的上清用作进一步的抗体纯化。
冻存：含10%FBS培养基90%+DMSO10%抗体纯化柱子：内径0.5-1 cm自备柱子填充物：Protein A或protein G 0.6-1 ml 也有现成的protein A柱子买Wash buffer:：100 mM Tris-HCL( pH 8.0)Elution buffer：100 mM Glycine (pH 3.)TBS（pH7.6）：Tris 20 mMNaCl 137 mM1.装柱时先将流出口堵住，装满wash buffer后再打开，赶尽下部的气泡，柱子不能流干，装入填充物，使均匀沉降，用10个体积以上的wash buffer平衡柱子。
2.将上清（9000 rpm，10 min）离心后，上柱，反复通过柱子2-3次，使充分结合。
3.用wash buffer洗柱子30 ml以上,4.准备接收用离心管，每管中加入100 mM Tris 0.1 ml。
5.洗脱时，每加0.9 ml Elution buffer接收一管，相当于每个EP管中含10% wash buffer，90% Elution buffer.6.测一下每管中的蛋白浓度，将浓度高的合并起来。
杂交瘤技术基本程序与方法
杂交瘤技术基本程序与方法一、杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。
1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。
他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。
融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。
在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HA T培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。
实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。
用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。
生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。
这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理一、引言单克隆抗体（Monoclonal Antibody，mAb）是由单一B细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力。
其制备方法主要有杂交瘤技术、酶联免疫吸附试验法（ELISA）、荧光激发技术等。
其中，杂交瘤技术是制备单克隆抗体最重要的方法之一。
二、杂交瘤技术基本原理1. B细胞与肿瘤细胞的融合杂交瘤技术的基本原理是将体内产生的特异性抗体B细胞与无限增殖能力的肿瘤细胞进行融合，形成可分泌大量同种特异性抗体的杂交瘤细胞。
在此过程中，B细胞提供了高度特异性的抗体基因组，而肿瘤细胞提供了无限增殖能力。
2. 杂交瘤细胞筛选和分离将获得的杂交瘤细胞进行筛选和分离，以获取单一同种特异性抗体产生的杂交瘤细胞株。
这里需要注意的是，筛选和分离的条件需要严格控制，以确保所得到的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力。
3. 单克隆抗体的大规模制备通过对单克隆抗体杂交瘤细胞株进行培养和扩增，可以大规模制备单克隆抗体。
此过程中需要注意对培养条件、生长因子、营养物质等进行优化，以提高单克隆抗体的产量和质量。
三、杂交瘤技术的优点1. 高度特异性和亲和力通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，可以用于检测、诊断、治疗等领域。
2. 无限复制能力杂交瘤细胞具有无限复制能力，可以大规模制备同种特异性抗体。
3. 可重复性好由于单一B细胞产生的同种特异性抗体都是完全相同的，因此通过杂交瘤技术制备出来的单克隆抗体具有良好的可重复性。
四、杂交瘤技术存在的问题及解决方法1. 杂交瘤细胞的稳定性杂交瘤细胞的稳定性对于单克隆抗体的制备至关重要。
为了提高杂交瘤细胞的稳定性，可以采用多种方法，如对培养条件进行优化、添加生长因子等。
2. 克隆选择在杂交瘤技术中，克隆选择是一个非常重要的环节。
为了确保所得到的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，需要对杂交瘤细胞进行筛选和分离。
这里需要注意的是，筛选和分离的条件需要严格控制。
4.3 杂交瘤细胞的制备和筛选
后勤制度及岗位职责关键信息项：1、后勤工作范围及职责2、后勤工作流程与规范3、后勤人员工作时间与考勤制度4、后勤人员绩效考核标准与奖惩机制5、后勤物资管理规定6、后勤设备维护与保养制度7、后勤服务质量监督与反馈机制1、后勤工作范围及职责11 负责办公用品的采购、发放和管理，确保办公用品的充足供应和合理使用。
12 维护办公区域的环境卫生，包括定期清扫、垃圾处理等。
13 管理办公设备，如打印机、复印机等的日常维护和故障报修。
14 负责公司车辆的调配、保养、维修和保险等事项。
15 安排会议和活动的场地布置、设备准备和餐饮服务等工作。
16 管理员工宿舍，包括宿舍分配、设施维护和卫生检查等。
17 负责公司文件的收发、登记和归档工作。
2、后勤工作流程与规范21 办公用品采购流程211 各部门提出办公用品需求申请，填写采购申请表。
212 后勤部门审核申请，确定采购清单和预算。
213 按照公司采购规定，选择合适的供应商进行采购。
214 验收采购物品，确保质量和数量符合要求。
215 入库登记，发放给申请部门并做好记录。
22 办公区域卫生维护流程221 制定卫生清洁计划，明确清洁区域和时间安排。
222 清洁人员按照计划进行日常清扫和定期深度清洁。
223 后勤部门定期检查卫生情况，发现问题及时督促整改。
23 车辆管理流程231 员工提出用车申请，注明用车时间、事由和目的地。
232 后勤部门根据车辆使用情况进行调配，安排合适的车辆和司机。
233 车辆使用完毕后，司机填写行驶记录和费用清单。
234 定期对车辆进行保养和维修，确保车辆性能良好。
3、后勤人员工作时间与考勤制度31 后勤人员实行标准工时制，每周工作五天，每天工作八小时。
32 上班时间为上午 8:00 12:00，下午 14:00 18:00。
33 实行打卡考勤制度，不得迟到早退。
34 如有特殊情况需要请假，应提前填写请假申请表，按照审批流程报批。
35 加班应提前申请，经批准后按照相关规定给予调休或支付加班费。
单克隆抗体实验报告
一、实验目的1. 学习单克隆抗体的制备方法；2. 掌握单克隆抗体的鉴定技术；3. 了解单克隆抗体在免疫学研究和临床诊断中的应用。
二、实验原理单克隆抗体（Monoclonal Antibody，mAb）是由单个B细胞克隆产生的，具有高度特异性和亲和力。
单克隆抗体的制备通常采用杂交瘤技术，即将B细胞与肿瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既具有B细胞的抗体产生能力，又具有肿瘤细胞的无限增殖能力。
通过筛选和培养杂交瘤细胞，可以得到大量相同的单克隆抗体。
三、实验材料1. 实验动物：Balb/c小鼠；2. 抗原：目的蛋白；3. 细胞株：SP2/0（小鼠骨髓瘤细胞）；4. 培养基：IMDM培养基、DMEM培养基、RPMI-1640培养基；5. 试剂：FCS、HAT（Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine）、PEG（聚乙二醇）、兔抗小鼠IgG-HRP（辣根过氧化物酶标记）、羊抗兔IgG-FITC（荧光素异硫氰酸酯标记）；6. 仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、流式细胞仪等。
四、实验方法1. 抗原免疫小鼠：将抗原注入Balb/c小鼠体内，免疫小鼠，制备抗体。
2. 细胞融合：收集免疫小鼠脾细胞，与SP2/0细胞按一定比例混合，加入PEG，诱导细胞融合。
3. 融合细胞筛选：将融合细胞接种于96孔板，加入HAT培养基，培养7-10天，观察细胞生长情况，筛选出阳性克隆。
4. 阳性克隆扩大培养：将阳性克隆扩大培养，制备杂交瘤细胞。
5. 阳性克隆抗体检测：收集杂交瘤细胞培养上清，进行ELISA检测，鉴定阳性克隆。
6. 阳性克隆抗体纯化：将阳性克隆抗体进行亲和层析或蛋白A/G层析，纯化抗体。
7. 阳性克隆抗体鉴定：采用流式细胞术或免疫荧光技术，鉴定阳性克隆抗体。
五、实验结果1. 免疫小鼠制备抗体：免疫小鼠后，血清抗体水平明显升高。
2. 细胞融合：融合细胞生长良好，阳性克隆筛选成功。
3. 阳性克隆扩大培养：阳性克隆杂交瘤细胞生长旺盛。
杂交瘤技术的基本原理和单克隆抗体的主要制备步骤
杂交瘤技术的基本原理和单克隆抗体的主要
制备步骤
一、杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术也称免疫杂交或抗体杂交，是用生物学和化学原理创造出人造抗体，也可以称之为“免疫抗体杂交”。
它通过将特定基因段无细胞化学合成抗体与正常正常抗体不同种型的B细胞经免疫球蛋白结合物外溶胶连接起来，从而锁定它们在杂交抗体分子内部而形成杂交细胞，它们同时具有正常抗体结构的灵活性，并将合成的抗体的特异性的目的物结合到杂交抗体分子上，诱导杂交细胞生长，从而获得特异性的抗体。
二、单克隆抗体的主要制备步骤
(1)筛选实验：将目标蛋白质与抗原结合，合成抗原——抗体复合物，获得具有抗原识别能力的抗体解析表型细胞。
(2)定向克隆：在筛选步骤的B细胞中采用定向克隆技术，将抗原识别能力特异的B细胞从其他不特异的B细胞中挑选出来，使它们成为抗体库中的杂交瘤。
(3)表达克隆抗体：将各自的表达株根据特定蛋白质的表达量分类，并从抗体库中培养出单克隆表达株。
(4)纯化抗体：从单个杂交瘤表达抗体株中分离，纯化抗体，获得纯净的单克隆抗体。
动物体细胞融合与单克隆抗体
）
D．离心
骨髓 造血干 1.淋巴细胞是由动物体---------------------中的---------------------细胞分化发育而 来的。 主动运输 2.杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是---------------------
三.思考与探究 1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？
4.下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破 伤风杆菌的实验方案
A
制备单克隆抗体 (1).该实验方案的目的是：________________ (2).该方案能达到预期效果吗？为什么？ 不能，没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产 生单一抗体的B淋巴细胞。 (3).A是从小鼠的脾脏中取得__________ 该细胞能 B淋巴细胞 抗体 够产生______ 。 细胞融合 (4).图中B为________________过程，常用 灭活的病毒 _________________作为诱导剂，该细胞继承 ___________的遗传特性，既能__________,又能 双亲细胞 分泌抗体 无限增殖 ___________。
教学反馈
1.动物细胞融合技术最重要的用途是 （ B A.克服远源杂交不亲和 B.制备单克隆抗体 C.培育新物种 D.生产杂种细胞
2.单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的 （ A.B淋巴细胞 B.T淋巴细胞 C.骨髓瘤细胞 D.杂交瘤细胞 ）
）
D
3.（多选）1975年米尔斯坦和柯勒成功地获得了单克隆抗体。下列细胞中与单 克隆抗体的制备有关的是 （ A B C D） A.效应B细胞 C.骨髓瘤细胞 B．T淋巴细胞 D．杂交瘤细胞
免疫小鼠
培养骨髓瘤细胞
注射特定 抗原蛋白
单克隆抗体制备过程示意图
_细胞工程试题(卷)答案
2014---2015年第二学期细胞工程试卷答案一、填空题1、目前，体外受精成功的标志至少是看受精卵可以发育至囊胚期阶段。
2、动物细胞培养需要防止污染问题，显著污染的标志是PH显著改变，细胞外形模糊，甚至出现漂浮的集落。
3、超数排卵是向动物体注射某些促性腺激素，对卵巢产生作用促进排卵。
4、动物细胞培养时，细胞主要以聚集体形式存在。
5、细胞融合实验最常用的生物促融剂是仙台病毒（HVJ）。
6、胚胎工程中最关键的技术是体外受精和胚胎移植。
7、克隆动物制备主要是通过不同来源的细胞核移植实现的。
8、动物细胞体外培养的培养基包括：天然培养基、合成培养基和无血清培养基。
9、动物细胞培养一般经过：原代培养、传代培养和衰退期三个阶段。
消化法传代是实验室动物细胞培养的传代方法。
10、干细胞从来源上可分为胚胎干细胞和成体干细胞两种。
从功能上可分为单能干细胞、多能干细胞和全能干细胞。
11、HAT选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T）。
12、影响超数排卵效果的因素包括供体年龄、供体品种差异、激素剂量、卵巢状况等。
13、动物多倍体培育常用的物理方法包括：温度激变（温度休克法）、水静压法、机械损伤、辐射高盐碱法等。
14、女性细胞在间期出现的三角形或半月状的染色体，称为Barr's小体。
15、哺乳动物的Y染色体上有一个性别遗传控制因子，称为睾丸决定因子。
16、大量产生单克隆抗体的方法主要有杂交瘤细胞体接种法和体外培养法。
—17、卵母细胞成熟的一些标志包括发生泡破裂、染色体凝集、纺锤体形成、极体排出、透明带软化、卵丘细胞扩散。
18、灭菌方法有高压蒸汽灭菌、干热灭菌、燃烧灭菌、射线灭菌。
19、细胞超低温储贮存分快速冷冻法和逐步冷冻法。
20、组织培养细胞一代生长过程潜伏期、指数增长期、停止期三阶段。
二、名词解释1、细胞工程：应用细胞生物学和分子生物需的方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞的遗传物质以获得新型生物或特种细胞产品的综合性科学技术。
高中生物高频考点及答案36 细胞工程
考点规范练36细胞工程一、选择题1.为解决大面积烧伤患者的植皮难题,科学家研制出了人造皮肤,研制过程中需要将人的皮肤细胞置于培养瓶中进行培养。
配制培养基时除加入必需的已知成分外,还必须加入天然成分,细胞方可正常生长和增殖。
下列叙述正确的是()A.在动物细胞培养液中加入抗生素,就可以为细胞培养提供无菌条件B.细胞培养过程中只需不断通入O2,就能保证细胞正常生命活动C.加入的天然成分是血清,用来补充细胞生长和增殖所需的物质D.经培养可得到由多层细胞构成的人造皮肤,能直接用于移植2.下图表示四倍体兰花叶片植物组织培养的过程。
下列相关叙述错误的是()四倍体兰花叶片愈伤组织芽、根等兰花植株A.通过消毒和无菌操作避免①②过程发生杂菌污染B.此兰花的花药经离体培养所得的植株为二倍体C.细胞全能性表达的前提是①过程,体现在②③过程D.需生长调节物质调控①②过程细胞的分裂和分化3.(不定项选择题)下列关于动物细胞工程和胚胎工程的叙述,错误的是()A.乳腺细胞比乳腺癌细胞更容易进行离体培养B.细胞核移植在同种动物、同种组织的细胞之间进行C.采用胚胎分割技术产生同卵多胚的数量是有限的D.培养早期胚胎的培养液中含维生素、激素等多种能源物质4.(不定项选择题)下图表示改造哺乳动物遗传特性的3种途径。
下列相关叙述错误的是()A.获得动物1的受体细胞通常是受精卵B.动物2体内各体细胞的基因种类相同C.获得动物3的重构胚不具有全能性D.上述动物的获得均需运用胚胎移植技术二、非选择题5.我国菊花主要有杭菊、怀菊、贡菊等品种,是药食兼优的代表性植物。
研究发现,杭菊具有明显的抗炎作用,怀菊具有良好的抗病毒作用(但是抗炎作用很弱)。
回答下列问题。
(1)欲培育兼有明显抗炎、抗病毒疗效的菊花新品种,用杭菊和怀菊杂交的方法是做不到的,原因是。
(2)基因工程方法为培育上述新品种提供了可能性,在实施基因工程过程中,最关键的步骤是。
受体细胞的选择直接关系到实验的成功与否以及新生植株的品质,我们一般选取未开花的幼枝的芽尖,理由有、。
郑州外国语—闫鹤—高中生物《动物细胞融合与单克隆抗体》教案 新人教版选修3
2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体教学背景：学生学习了植物细胞工程的内容，同时也学习了动物细胞工程的动物细胞培养技术和核移植技术，在有这些技术的基础上继续学习动物细胞融合和单克隆抗体，能更好的理解细胞工程的技术手段，并可以将动植物细胞工程的技术和应用做一个对比。
而“单克隆抗体的制备”是人教版高中生物选修3的内容，属于现代生物高科技的范畴，其实验操作技术复杂，设备、仪器和药品等要求高，在高级中学现有条件下很难动手实践，因此传统的学习方式是以接受式学习为主，由于电子白板可以借助互联网已经应用在教学中，因此在教学中可以借助互联网直接从网上搜集关于单克隆抗体的制备以及关于单克隆抗体在实际生活中的应用。
使学生能借助互联网更好的理解抽象的生物高科技教材分析本节课位于新人教版选修三专题2，共分两大部分内容：动物细胞融合、单克隆抗体的制备。
由于动物细胞融合与前面的章节中植物的原生质体融合相同，所以在本节呈现的较简洁。
单克隆抗体是动物细胞工程的新技术，也是本专题的重点知识，对于学生来说，概念及制备过程都很抽象，也是本节教学中的重难点知识。
必修中细胞的结构、细胞的分裂、体液免疫以及学生刚学过的细胞培养等知识都是学习本节课的知识基础。
大纲规定教学课时1节教学重点（1）动物细胞培养的过程及条件（2）用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程（3）单克隆抗体的制备和应用教学难点（1）用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程（2）单克隆抗体的制备过程教学方法启发法、分析法、归纳法、视频及词条展示法教学工具多媒体教学课件、互联网课时安排1课时教学过程（一）问题设置，引入新课师：对于植物细胞工程的技术手段我们共同学习的有几种？生：植物组织培养和植物体细胞杂交技术师：那么对于动物细胞工程，其技术手段主要有哪些？生：动物细胞培养、动物细胞核移植技术、动物细胞融合和生产单克隆抗体。
师：很好，前面我们学习了动物细胞培养和核移植技术，这一节课我们共同学习动物细胞融合和单克隆抗体。
常用的单克隆抗体检测方法
通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成后，需要对抗体进行一个检测，本文介绍了几种常用的抗体检测的方法（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。
由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。
①器材和试剂a、包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取LNa2CO38ml，LNaHCO317ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至。
Tris-HCl缓冲液（，L）：取LTris100ml，LHCl混合，加蒸馏水至1000ml。
b、洗涤缓冲液（的PBS）：KH2PO4,KCl,Na2HPO4•12H2O,NaCl,Tween-20，加蒸馏水至1000ml。
c、稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）,加洗涤液至100ml;或用洗涤液将小牛血清配成5—10%使用。
d、酶反应终止液（2mol/LH2SO4）：取蒸馏水，滴加浓硫酸（98%）。
e、底物缓冲液（，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取LNa2HPO4,L柠檬酸，再加50ml蒸馏水。
柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。
f、底物使用液:OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD5mg,底物缓冲液10ml,3%H2O2。
TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）,底物缓冲液10ml,1%H2O225ul。
ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS,底物缓冲液1ml,3%H2O22ul。
8、抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。
h、抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。
病毒感染的传代细胞或全菌抗原。
淋巴细胞等悬液。
i、酶标抗鼠抗体或酶标SPA 或其他类似试剂。
j、细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4100mg，KH2PO4500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1；1）；或-20℃甲醇。
杂交瘤细胞生产抗体技术细胞筛选
杂交瘤细胞生产抗体技术细胞筛选杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。
抗体检测的方法很多，通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定。
但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便，便于一次处理大量样品等特点。
因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报告结果，以便决定杂交瘤细胞的取舍。
所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。
一般说来，在融合之前就必须建立好抗体检测方法，并克服可能存在的问题。
另一个重要问题是抗体检测方法所需要的“动力学范围”，即检出背景以上的最强与最弱信号之比，依所用的检测抗原是否纯净而定。
如杂交瘤抗体是针对纯化的蛋白质抗原的，100%的抗原参与反应，一个阳性/阴性判别系统就够了。
另一方面，如果杂交瘤抗体是针对细胞表面微量的蛋白抗原，检测系统可能需要能测出微弱信号，则动力学范围至少应为10：1，最好为100：1。
另外，检测方法的选择还受所需杂交瘤抗体的类型和预定的用途的影响。
结合补体的抗体可以用基于细胞毒性反应的检测方法来选出。
如需结合A蛋白的杂交瘤抗体，就要用结合蛋白A的检测方法。
杂交瘤细胞的冻存与复苏（1）杂交瘤细胞的冻存在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故，如停电、污染、培养箱的温度或CO2控制器失灵等给正在建立中的杂交瘤带来灾难，通常尽可能早地冻存一部分细胞作为种子，以免遭到不测。
在杂交瘤细胞建立以后，更需要冻存一大批，以备今后随时取用。
细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度（0℃—— -20℃，每分钟下降1℃；-20℃—— -40℃每分钟下降2℃），可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。
下面介绍我们实验室的细胞冻存方法，经几年来对多种细胞的使用，细胞复苏存活率均在80%以上。
单克隆抗体杂交瘤细胞筛选技术(Molecular Devices)
单克隆抗体杂交瘤细胞筛选技术1986年，美国FDA批准了第一个单克隆抗体药物上市，距今已快30年。
目前，全世界共有超过40个治疗用抗体药物被批准上市，每年实现超过600亿美元的销售额。
在国际及国内形成了抗体药物开发热潮。
巨大的市场前景和现存的技术问题及壁垒并存的现实不可避免地引发抗体药物新一轮技术革命。
而其结果又将毫无疑问地改变抗体药物的市场格局。
但是，抗体不管是作为检测试剂，还是作为具有巨大市场前景的治疗药物。
首先，我们都需要通过筛选找到单克隆抗体。
传统的单克隆抗体制备方法主要是杂交瘤技术。
这是目前比较成熟，技术难度比较低，大多数实验室仍然在使用的方法。
在单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是使用选择性培养基选出杂交瘤细胞；第二次就是进一步选出能产生我们需要的抗原特异性抗体的杂交瘤细胞。
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理是根据以下三个原则：1、一种淋巴细胞克隆只产生一种抗体；2、细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性；3、利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆化，然后大量培养增殖， 制备所需的单克隆抗体。
第一次筛选的原理和方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。
其依据是细胞中DNA的合成有两条途径：一条途径是生物合成途径(D途径)，即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗剂，可以阻断DNA合成的“D途径”。
另一条途径是应急途径或补救途径(S途径)，它是利用次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HAT培养液中，未融合的B细胞及两个B细胞的融合产物的D途径被氨基蝶呤阻断，虽S途径正常，但因缺乏在体外培养液中的增殖能力，一般在10天左右会死亡。
兔单克隆抗体构建流程
兔单克隆抗体构建流程一、免疫兔子。
要构建兔单克隆抗体，那得先从免疫兔子开始说起。
就好像给兔子安排一场特殊的训练课程。
我们要选择健康活泼的兔子哦，那些病恹恹的可不行。
然后呢，给兔子注射抗原，这个抗原就像是一个小信号，告诉兔子的身体，有外来的奇怪东西啦，你得做出反应。
这时候兔子的免疫系统就像一群小战士，开始动员起来啦。
不过呢，这个注射的量和时间都得把握好，就像做菜放盐一样，少了没味道，多了可就咸得没法吃啦。
二、淋巴细胞采集。
等兔子的免疫系统和抗原大战一段时间之后，就到了采集淋巴细胞的时候喽。
这就像是去收获我们之前种下的小种子结出的果实。
我们得小心翼翼地从兔子的身体里把那些被抗原激活的淋巴细胞取出来。
这可是个精细活呢，就像从一堆沙子里挑出珍珠一样，要很有耐心。
这些淋巴细胞可是构建兔单克隆抗体的关键材料，就像盖房子的砖头一样重要。
三、细胞融合。
接下来就是细胞融合啦。
把采集到的淋巴细胞和骨髓瘤细胞放在一起，让它们像好朋友一样手拉手融合在一起。
这过程就像是一场神奇的聚会，两种不同的细胞在特定的条件下相遇，然后紧紧抱在一起，形成一种新的细胞，叫做杂交瘤细胞。
这个过程有点像魔法一样，不同的东西组合在一起就有了新的力量。
四、筛选杂交瘤细胞。
融合之后呢，会有各种各样的细胞混在一起，有没融合成功的，也有融合错的。
这时候就需要进行筛选啦。
就像从一群小朋友里挑出穿红衣服的小朋友一样。
我们要找到那些真正成功融合的杂交瘤细胞。
这可不容易呢，得用一些特殊的方法，就像用一把特殊的钥匙去开特定的锁一样，把我们想要的杂交瘤细胞找出来。
五、克隆化培养。
找到杂交瘤细胞之后，就要对它们进行克隆化培养啦。
这就像是把一颗种子种成一大片花园一样。
让这些杂交瘤细胞不断地繁殖，这样就能得到很多很多相同的细胞。
这个过程要给它们提供合适的环境，就像照顾小婴儿一样，温度呀、营养呀都得刚刚好。
六、抗体检测。
在杂交瘤细胞大量繁殖之后，我们就得检测一下它们产生的抗体啦。
如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养
如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养
如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养经选择性培养基筛选后的杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞。
通常采用有限稀释克隆细胞的方法,将杂交瘤细胞多倍稀释,接种在多孔细胞培养板上培养，使每孔细胞不超过一个(理论上30％的孔中细胞数为0时,才能保证有些孔中是单个细胞)，再由这些单细胞克隆生长，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。
如图,
阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释,一般需进行3~4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。
该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养经选择性培养基筛选后的杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞。
通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养，使每孔细胞不超过一个（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。
如图，
阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。
该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。