FRET暨活细胞显微成像系统

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荧光共振能量转移(FRET)的定量检测及其应用

荧光共振能量转移(FRET)的定量检测及其应用张建伟;陈同生【摘要】荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)技术被广泛应用于活细胞中生物大分子构象变化和分子间动态相互作用的实时研究.针对光谱串扰和供体受体间的浓度比等困扰FRET效率定量检测的两大难题,已经发展了多种定量检测FRET效率的方法.作者结合自己的研究结果介绍了多种FRET 效率定量检测技术在细胞信号转导机制研究中的应用.%Fluorescence resonance energy transfer (FRET) is the most widely used technology to study the protein - protein real - time dynamic interactions and the change of macromolecular conformation in living cells. Spectral cross - talks and acceptor - to - donor concentration ratio are the tissues harassing the quantitative measurement of FRET efficiency. Many different methods to quantitate FRET efficiency, such as FLIM - FRET, spectral FRET, acceptor photobleaching FRET and sensitized emission FRET methods, have been proposed. In this report, we introduce some quantitative FRET methods to study the mechanism of cell signal translation.【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(044)003【总页数】6页(P12-17)【关键词】荧光共振能量转移(FRET);FRET效率;定量检测;荧光蛋白【作者】张建伟;陈同生【作者单位】华南师范大学生物光子学研究院生命科学教育部重点实验室,广东广州510631;华南师范大学生物光子学研究院生命科学教育部重点实验室,广东广州510631【正文语种】中文【中图分类】Q631荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)是依赖于供体和受体分子间距离的光物理进程，处于激发态的荧光团通过偶极子间的相互作用将能量以非辐射的方式转移给邻近的受体分子[1-2], 从而导致供体荧光淬灭和受体荧光发射的增加. 供体和受体之间的FRET效率(E)与分子间的空间距离(r)满足6次方的关系[3]：FRET效率是依赖于供体与受体间的距离r和Forster距离R0的. R0由下式给出[3-4]：已知主要有2个因素影响FRET效率的定量检测：一个是光谱串扰, 包括供体荧光串扰到受体通道(发射光谱串扰)和激发供体时直接激发受体(激发光谱串扰)[7-8]. 由于有机荧光团的光物理特性, 绝大数现有的FRET供体受体对都存在光谱串扰. 在定量检测FRET效率时必须消除这些串扰, 选择2个发射光谱分离较大的供体受体对, 能够减小串扰, 但同时J()会减小. 影响FRET定量检测的另一个因素是参与FRET作用的供体与受体对所占整个荧光基团的比例[9-10]. 自由的供体与受体相互作用时, 往往不是所有的供体或受体分子都参与相互作用. 参与相互作用分子的百分数难以知晓, 因此, 各种FRET效率的定量检测方法对有自由的供受体存在时都不能完全地反映FRET效率, 只能测量表观FRET效率. 另外, 活细胞中荧光蛋白表达水平和背景噪音等其它因素也可能影响FRET效率的定量检测.绿色荧光蛋白(green fluorescent proteins, GFP)是从维多利亚水母中分离出来的,受紫外或蓝光激发而发出绿色荧光[11]. 与GFP融合的蛋白在细胞中仍然能够行使正常的功能, 因此GFP成为了检测蛋白质分子间相互作用的报告分子. 近年来又发现了GFP的多种变体, 与迅速发展的荧光显微镜技术结合极大地改善了活细胞成像和FRET技术在活细胞中的应用,使得FRET技术在细胞生物学和化学方面的应用得到了质的飞跃. 基于荧光蛋白的FRET(FPs-FRET)技术已被广泛应用于活细胞实验研究中,极大促进了生物学的发展[12]. 利用基因转导技术和共聚焦荧光显微成像可以在活细胞中研究蛋白质定位、信号的传递、蛋白质分子间的相互作用和蛋白质分子的构象变化. 将荧光蛋白(FPs)接到感兴趣的蛋白质分子上, 可以对细胞进行实时动态检测, 也可视化监测细胞内蛋白质与蛋白相互作用的生理过程[13]. FPs-FRET 传感器主要可以分为3类: 分子内的FRET传感器、双分子FRET传感器和基于双分子荧光互补传感器(BiFC)[13]. FPs-FRET传感器已经成为在活细胞中实时检测钙离子浓度、pH值、各种激酶活化、蛋白质磷酸化以及蛋白质分子间相互作用等动态过程的重要技术[13-14].FRET定量检测的常用方法有寿命成像(FLIM-FRET), 光谱成像(spectral FRET), 受体光漂白(acceptor photobleaching FRET)和敏化发射测量(sensitized emission FRET)等方法, 下面介绍FRET技术在细胞信号转导机制研究中的应用.FLIM方法主要是通过测量受体存在和不存在时的供体分子的荧光寿命 D和 DA来确定FRET效率E[5],FLIM方法检测的结果一般作为其他FRET定量检测方法的对照标准. 要求供体通道选择性探测供体荧光, 而且FLIM系统价格昂贵, 同时也需要熟练的操作人员进行操作, 这些都限制了FLIM方法的推广应用. 事实上用时间相关单光子计数(TCSPC)进行精确地拟合时可能带来了其他的方法没有的复杂问题[10], 尤其是复杂的光物理性质增加了寿命法分析的困难[15, 17]. 为了精确地对分子的荧光寿命进行多指数拟合, 在每个像素点上需有大量的光子[18], 这将大大延长成像时间, 使得FLIM方法不适合于活细胞中的实时动态检测[19-20].每一个荧光团都有各自的激发和发射光谱, 不同于采用荧光通道获得数据的强度测量方法和寿命测量方法的是光谱法获得的分别是供体、受体和供体与受体样本的发射光谱. 通过供体和受体的光谱对供体-受体样本的光谱进行拟合得到FRET效率. THALER等人[21]提出了一种利用光谱成像的FRET效率定量测量方法. 存在FRET 时混合光谱Fcomplex包括3个部分：供体的荧光、受体的荧光和从供体转移到受体的那部分荧光：Fcomplex=d×(1-E)×Fd+a×Fa+d×E×(Φa/Φd)×k()×Fa,本研究小组最近也提出了一种基于荧光光谱拟合的FRET定量分析方法[22]. 该方法通过测量细胞内供体-受体对的荧光发射谱, 然后按照供体和受体的荧光发射谱进行拟合得到FRET效率. 该方法有效地解决光谱串扰问题, 可用于检测蛋白质之间的相互作用. 最近, LEVY等[23]提出了基于2种不同激发光条件的发射光谱测量FRET效率的方法, 该方法能够测量很小的FRET效率和参与作用的供体与受体摩尔比, 而且能够通过仔细的校准来消除自发荧光和背景光的影响.sFRET方法是测量FRET效率最为灵敏的方法, 在目前已知的方法中只有光谱法能够探测出小于5%FRET信号. sFRET方法能够有效地解决光谱串扰问题, 也能够很好地消除背景光和自发荧光的影响, 因此sFRET方法可以用于测量蛋白质分子间弱的FRET信号. 但是sFRET方法对于数据采集要求很高, 因为较小的干扰就可能对结果造成较大影响, 所以须对数据要进行严格的校正, 特别是须对背景光和自发荧光进行严格校正.光漂白方法(Pb-FRET)通过检测光漂白受体前后供体的荧光强度来获得FRET效率, 光漂白受体会导致供体的荧光强度上升. 光漂白方法分为完全光漂白方法和部分光漂白方法.供体和受体发生FRET时, 供体的荧光减少, 即供体荧光会产生淬灭, 而受体的荧光增加. 一般采用最大的受体激发光完全漂白掉受体后, 供体就不再把能量传递给受体, 导致供体的荧光增加. 通过测量完全光漂白受体前后供体的荧光强度和就可以得出FRET效率[24]：ELDER等[20]提出了一种通过检测部分受体光漂白前后供体的荧光强度和受体光漂白程度来测量FRET效率的部分受体光漂白方法,受体光漂白方法(Pb-FRET)操作简单, 在共聚焦显微镜上也很容易实现. Pb-FRET方法测量FRET效率既不依赖于系统参数，也不依赖于供体与受体的量子产率和消光系数, 只依赖于受体光漂白前后供体的荧光强度变化. 但是, 受体光漂白会对生物体造成的损伤, 不利于在单细胞中进行多次测量, 也不能在细胞中进行实时动态检测[20, 27]. 必须注意的是：受体光漂白过程中用最大的光强的受体激发光也可能漂白掉供体分子,最近发现在光漂白过程中YFP分子可以光转换成CFP分子[28].敏化发射测量(SE-FRET)方法被广泛应用于活细胞中FRET效率的动态检测[20, 27]. SE-FRET既可以在共聚焦显微镜上实现, 也可以在宽场显微镜上实现. 传统的SE-FRET方法是利用3个滤光块组的方法, 每个滤光块组都是采用一个激发带宽滤光块来选择性激发供体或受体, 并用发射滤光块来收集供体或受体发射的荧光. 可是, 受体敏化发射荧光包括直接激发受体的荧光和供体串扰到受体通道的荧光, 其串扰路径如图1.在实际的实验中, 除了测量待测FRET样本实验外, 还需增加对3个参考样本来对系统进行串扰校正：只有供体荧光团的供体对照样本, 只有受体荧光团的受体对照样本和已知FRET效率的校正样本. 增加的供体对照样本测量供体发射串扰(图1中path2), 受体对照样本测定直接激发受体发射串扰(图1中path1), 已知FRET效率的校正样本获得给定条件下成像系统的校正因子G[27]. 也有文献报道用2个化学计量比为1∶1且FRET效率差别较大的参考样本来获得校正因子G[29].SE-FRET方法具有无损伤的特性, 成为在活细胞中最为适合于动态监测的方法[20, 26], 而且能够较好对光谱串扰和系统参数进行校正. 但是, SE-FRET方法也有其自身的限制，需要利用对照样本(至少3个)对光学检测系统以及荧光基团的光学性质进行事先校正，一旦校正完成,后续实验不能再改变任何系统参数, 且每次实验都要重新校正, 极大地增加了SE-FRET实验的工作量和难度, 也限制了该方法的推广应用. SE-FRET实验必须同时转染4个样本, 其中的任何一个样本没有转染成功, 都会导致实验的失败.FRET技术已经成为在活细胞中研究蛋白质之间相互作用和蛋白质分子构象变化的广泛应的工具. 本研究小组近几年利用FRET技术在活细胞中研究了细胞增殖和细胞凋亡过程中的分析调控机制[30-34]. 通过构建基于GFPs的FRET质粒，利用共聚焦荧光显微镜在单个活细胞中研究各种诱导刺激条件下细胞凋亡的分子调控机理[32-36].FRET技术在生物上的重要应用是通过实时检测荧光蛋白之间FRET的效率变化来研究荧光蛋白标记蛋白质分子间的相互作用. 利用FRET技术并结合共聚焦显微成像技术，本研究小组证明了在碱性条件下诱导细胞凋亡过程中Bid被切割成tBid 并转位到线粒体上，并且证明凋亡过程中Caspase-3活化[31]. 为了在活细胞中实时研究Caspase-3的动态活化过程，筛选了稳定表达SCAT3的细胞系，在此基础上通过检测细胞凋亡期间SCAT3 FRET效率的动态变化，实现了在单个活细胞中实时检测caspase-3的动态活化过程[32].利用ECFP标记Bax蛋白和EYFP标记PUMA蛋白，本实验室利用FRET技术在活细胞中首次证明了在紫外诱导的细胞凋亡过程中PUMA可以直接促进Bax的活化和转位，并抑制Bcl-XL蛋白活化[37]. 本研究小组还证明了低功率激光辐照能够通过GSK-3β未活化的机制来抑制Bax转位的上游过程[38]，以及P53不依赖于PUMA转录因子而是通过Akt/FOXO3a介导的Bax活化和细胞凋亡[39].FRET技术已被广泛应用于活细胞中蛋白质之间相互作用和蛋白质分子构象变化的动态研究. 影响FRET定量检测的因素主要有光谱串扰和供体与受体的浓度比. GFP 及其变种的发现以及显微荧光技术的发展使得FRET技术在活细胞中的应用更加广泛. 本文介绍了寿命测量法、光谱法、部分受光漂白方法和敏化发射等几种常用的FRET定量检测方法，并对上述各种方法在定量检测FRET效率上进行了简单的评述.【相关文献】[1] LAKOWICZ J R. Energy Transfer: In Principles of Fluorescence Spectroscopy[M]. New York: Plenum Press, 1983.[2] CLEGG R. 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活细胞成像技术的使用教程

活细胞成像技术的使用教程活细胞成像技术是一种能够观察和记录活细胞在活体条件下的实时动态的图像技术。

这种技术在生物医学研究、药物发现、细胞生物学和生物工程领域得到了广泛应用。

本文将介绍活细胞成像技术的基本原理、常用的成像方法和实验步骤，以及一些常见的应用案例。

一、基本原理活细胞成像技术基于显微镜成像原理，通过将活细胞标记或转染成荧光染料、标签蛋白或荧光蛋白，利用显微镜观察和记录这些标记物的荧光信号。

荧光信号可以直接显微镜观察或使用专门的成像设备进行采集和记录。

活细胞成像技术依赖于荧光标记物的特异性和稳定性。

常用的荧光染料或标签包括荧光染料，如荧光素、达菲红和荧光素酮；标签蛋白，如绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）和黄色荧光蛋白（YFP）等。

这些荧光标记物会与特定的生物分子结合，如细胞器、蛋白质、DNA或RNA等。

荧光标记物与目标结合后，通过激发荧光染料吸收光，产生特定波长的荧光信号。

这些信号可以通过荧光显微镜进行实时观察和记录。

二、常用成像方法1. 荧光显微镜荧光显微镜是观察荧光信号的主要工具。

它包括激发光源、滤光片、物镜、荧光探测器和成像系统。

激发光源选择合适波长的激光或白炽灯，滤光片选择对目标荧光信号具有高透射率的滤光片，以减少背景干扰。

荧光探测器可以选择光电倍增管或CCD相机等，用于接收和记录荧光信号。

成像系统可以是显微镜附件或独立的荧光成像仪。

2. 皮肤窗准备法皮肤窗准备法是一种常用的动物模型实验方法，可以观察和记录活细胞在活体动物皮肤上的实时图像。

在这种方法中，通过手术将活体动物的皮肤上形成一个窗口，并标记活细胞，然后使用荧光显微镜观察和记录细胞的活动和变化。

这种方法可用于研究细胞迁移、细胞分裂、血管生成等生物过程。

三、实验步骤1. 准备样品根据实验需要选择合适的细胞系，培养到合适的生长状态。

根据实验目的选择适当的荧光标记物或标签蛋白，将其转染到细胞中。

确保标记物与目标分子结合后的效果和细胞生理状态正常。

MetaMorph显微成像分析

■ 从定性到定量采用的独特的反卷积功能，能够准确恢复得到真实的定量信息
■ 从宏观到细节
同时获得相同细胞的微观和宏观图像
■ 从平面到立体 4D浏览，获知细胞的所有结构随时间发生的位移变化和转移过程，获得前所未有的深层细胞信息
活细胞成像工作站
细胞离子成像
细胞离子成像/FRET简介
钙离子是生命活动最重要的离子之一，通过测定细胞内游离钙离子浓度，科研工作者可以得知肌肉收缩、神经信号传导、细胞间通讯、激素反应等生命活动的重要信息。
另外，许多非金属阴离子，如H+，NO等及细胞膜电位的检测和线粒体膜电位的快速检测对于观察细胞的生物学特性有着重要的价值。
长寿命光源系统多种类型的CCD
系统与膜片钳联用
实时获得离子图像和离子绝对浓度值
应用实例
同时展示多波长图像和自定义的测量曲线。当对之前的图像进行二次分析时，通过鼠标点击曲线任意位置能够快速展示出与之相对应的图像。
CHO细胞标记Fura-2 图像来源： the Biomedical Sciences short course , Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA. Courtesy of Lynda Pierini, PhD, Cornell Medical Center, Ken Dunn, PhD, Indiana University-Purdue University,and Professor ColinIzzard, SUNY University of Albany.
MetaMorph生物学显微成像和分析

FRET探测活细胞中蛋白质相互作用的进展

第八届全国发光分析暨动力学分析会议（2005年7月15日－19日）PL-029FRET探测活细胞中蛋白质相互作用的进展*刘德龙1,2郭慧芳2白娟2孙大业2河北师范大学, 化学学院1, 生命科学学院2, 石家庄, 050016,E-mail: delongliu9012@1.FRET原理1948年，FÖrster首先提出了FRET理论，一对合适的荧光分子之间由于偶极-偶极相互作用，激发供体分子的光子能量hν可能被传递至受体分子，而受体分子通过发出光子而松弛。

其直观表现是供体和受体之间达到合适的距离时（1-10nm），以供体的激发光激发，供体产生的荧光强度比它单独存在时要低得多，而受体发射的荧光强度却大大增强，同时伴随着donor荧光寿命的相应缩短。

FRET 效率与供体发射光谱和受体吸收光谱的重叠程度，供体与受体的跃迁偶极的相对取向，供体与受体之间的距离有关。

2.FRET的测定方法由于FRET的发生将改变供体的去偏振程度，荧光寿命，荧光强度，而能量受体也有相应参数的变化，测定这些参数值就可以得出FRET效率。

目前常用的测量方法主要有双通道比值法,三组滤光片法, 供体荧光淬灭法，FRET-FLIM,荧光偏振等。

3.FRET数据处理FRET发生的一个重要条件是：供体（Donor）的发射波长和受体（Acceptor）的激发波长存在部分交迭。

而这种光谱交迭的结果之一便是，FRET信号始终受到下列两种信号的污染，1）供体受激后发射的荧光渗漏到受体通道，DSBT；2）受体分子被供体激发光激发后发出荧光被受体通道接收，ASBT。

这两种干扰信号统称光谱渗透（spectral bleed-through，SBT），它们都是进入受体通道的。

通过软件的手段去除捕获的FRET图像中的SBT信号，得到精确FRET图像，PFRET。

4.GFP及突变体绿色荧光蛋白(GFP)是来源于Aequorea victoria体内的一种天然发光蛋白。

活细胞成像技术在临床中的应用

活细胞成像技术在临床中的应用随着科学技术的不断发展，人们对于外界的了解也随之更多。

其中有一项技术便是活细胞成像技术，也叫做活细胞显微镜技术。

该技术是一种可以对细胞进行实时监测、观测和记录的方法。

目前，该技术在临床上也得到了广泛的应用，今天将来探讨一下活细胞成像技术在临床中的应用。

一、活细胞成像技术的优势活细胞成像技术的优势在于其能够提供实时、原位、动态的细胞成像数据，使得生物学家们可以深入地研究各种生命现象的发生发展过程。

与其他细胞观察技术相比，活细胞成像技术具有更高的解析度和更具细胞特异性。

这意味着，活细胞显微镜技术可以非常清晰的观测到细胞内发生的变化，且产生的数据不会被中间环节的影响而失真。

同时，也可以实时记录生物样本的响应和反应，还可以观察药物和激素的处理作用。

二、活细胞成像技术在癌症治疗中的应用活细胞成像技术在癌症研究中得到了广泛的应用。

由于癌细胞与正常细胞不同，癌细胞可以在更小规模的培养体系中继续生长，因此研究癌细胞通常会采用活体成像。

此外，活细胞成像技术还可以应用于研究药物在癌细胞中的作用过程，进而为制药业提供更好的药物研发思路。

三、活细胞显微镜技术在遗传和免疫研究中的应用除了癌症研究，活细胞成像技术还可以应用于遗传和免疫研究。

比如，它可以通过记录单个细胞的分裂过程，了解基因突变、分裂失调等生物学过程。

同时，也可以观察免疫反应的较深层次，从而帮助科学家们更清晰地了解免疫系统如何识别入侵病原体和抗击它们。

四、拓展活细胞成像技术的应用随着科学技术的发展，活细胞成像技术的应用也在不断扩大。

例如，通过整个细胞膜内化、内质网的张力测量、位点定位和单细胞基因表达的可视化等高级技术的发展，能够提供更精细的分子水平细节，使研究人员能够用于测试各种疾病和生物学信号传递。

总之，活细胞成像技术是一项非常优秀、发展前景良好的技术。

在临床中，它可以帮助科学家们更加深入地了解生命现象的发生发展过程，从而为药物研发和治疗提供更精确的指导和把握。

FRET暨活细胞显微成像系统

荧光共振能量转移(FRET)影像系统Olympus（北京）销售服务有限公司上海分公司PDF created with pdfFactory Pro trial version 荧光共振能量转移(FRET)影像系统一、研究目的随着生命科学研究的不断深入, 光学显微镜使我们理解了细胞结构和有关功能。

但是分子生物学研究已经显示了分子事件，例如信号传导和基因翻译，需要蛋白质的装配成特殊的大分子复合体等。

对各种生命现象发生的机制,特别是对细胞内蛋白质间相互作用的研究变得尤为重要。

传统的生物物理或生物化学方法例如亲和色谱法或免疫沉淀反应法和近来的酵母双杂交、磷酸化抗体、免疫荧光、放射性标记等方法等，都需要破碎细胞或对细胞造成损伤，无法做到在活细胞生理条件下实时地对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进行动态研究。

而基于强度的影像技术FRET方法，使得研究活细胞内的这些相互作用变得容易了，荧光共振能量转移( FRET)是用于对生物大分子之间相互作用定性、定量检测的一种有效方法。

根据所基于的荧光显微镜配置不同而有不同的应用侧重，可在多细胞，单细胞，细胞膜，细胞器等不同层次对生物大分子间的相互作用距离，动力学特性等进行研究。

二、FRET的原理和实现方法FRET的原理和发生的基本条件：1. 2. 3. 4. 发色团之间的距离在10A到100A 。

供体D的荧光光谱和受体A的吸收光谱足够多的重叠。

供体D的量子产率和受体A的吸收系数足够大。

D和A的跃迁偶极矩有最佳的相对取向，或者两者之一有一定的快速旋转的自由度。

FRET的实现方法：1) 稳态方法（基于供体、受体的三通道计算校准）供体荧光的减弱－主要的方法受体荧光的增强激发光谱和吸收光谱的比较 2) 3) 光漂白方法（Pb-FRET）时间分辨方法（TR-FRET）供体荧光的衰减受体荧光的增长PDF created with pdfFactory Pro trial version FRET 特点：1) 动态实验，采集速度快 / 高速Shutter、高速CCD 2) 3) 4) 维持活细胞活性－CO2培养箱、恒温培养箱、恒温板尽量减少光毒性，减少光照时间保证长时间观察奥林巴斯 FRET 系统组成：1、显微镜 2、光源、高速荧光激发光切换控制和电动光闸 3、电动 XY 载物台 4、环境控制 5、高灵敏度冷 CCD 6、多种部件同时工作的控制软件 7、图像分屏器——DualView三、Olympus FRET系统详细技术参数一）显微镜：Optics 光学性能Ø 光学系统（Optical System）: 奥林巴斯 2005 年最新推出的 UIS2 无限远光学系统（UIS2 Infinity optical system）（UIS2 光学系统具有的高光透过率和全光谱范围的色差校正，及高信噪比的特点，非常适合荧光方面的研究，可以说是目前最先进的光学系统之一）光路设计: V型光路把反射时的光线损失减少到最小程度，保证最大光通过量System Flexibility系统适应性Ø Ø Ø 光口: 双层多光口设计（奥林巴斯首创）保证了输入/输出灵活性，提供 6 条射入/射出光路，最多可同时接 4 路采集原像的图像获取系统。

显微成像技术与光谱分析技术在生物医学领域中的应用研究

显微成像技术与光谱分析技术在生物医学领域中的应用研究在近几年来，显微成像技术和光谱分析技术在生物医学领域中的应用研究已经取得了重大进展。

这些技术的发展使得我们可以深入探究生物系统的微观结构和分子机制，从而更深刻地理解生物学中的一些重要问题，例如致病微生物的传播和生物医药中药物分析等。

一、显微成像技术的应用显微成像技术是指对样品进行高分辨率的成像，从而可以观察到细胞和组织的微观结构。

目前应用最广泛的显微成像技术是荧光显微镜，该技术通过荧光标记的生物分子将微观结构的成像可视化。

荧光显微技术具有很高的灵敏度和分辨率，可以用于观察生物分子的分布、动力学过程和相互作用，例如通过荧光共振能量转移（FRET）技术监测分子间距离，观察细胞器的运动，以及实现活细胞内的蛋白定位等。

除了荧光显微技术外，还有一些其他的显微成像技术，例如电子显微镜和原子力显微镜。

电子显微镜是一种高分辨率成像技术，可以用于观察组织和细胞的超微结构，例如细胞内器官的形态和分布，以及细胞壁和细胞膜的结构。

原子力显微镜则可以用于研究质子泵和离子通道等生物分子的空间结构和功能。

二、光谱分析技术的应用光谱分析技术是一种用于研究物质结构和组成的方法。

常见的光谱分析技术包括拉曼光谱、红外光谱和紫外-可见光谱。

这些技术都可以用于检测和鉴定化合物，例如药物、环境污染物和生物分子。

拉曼光谱是一种基于样品的振动频率的成分分析方法。

通过扫描样品的拉曼光谱，可以获取样品分子的信息，例如分子的成分、结构和动力学特性。

红外光谱分析则可以通过样品吸收红外光谱的能量来检测样品的成分和组成。

这种技术非常适用于生物医学行业，能够说是生物医学领域中最常用的技术之一。

例如应用红外光谱分析技术可以对癌细胞进行分析，从而确定真正的肿瘤细胞口径和类型。

最后，紫外-可见光谱是一种用于检测有机物的常规方法，同样可以应用于药物的质量分析和生物分子的检测。

三、显微成像技术和光谱分析技术的结合应用这两种技术的结合应用可以有效地提高样品的分析效率。

细胞生物学的新发现和应用

细胞生物学的新发现和应用细胞生物学是生物学的重要分支之一，研究细胞的结构、功能及其在生物体中的作用。

随着科学技术的不断发展，细胞生物学也在不断地进行着新的探索和研究。

本文将介绍一些细胞生物学领域的新发现和应用。

一、活细胞成像技术的发展传统的细胞生物学研究中，科学家通常需要将细胞固定或染色后进行观察，这样会对细胞的真实状态产生一定的影响。

而近年来，基于成像技术的发展，科学家已经能够进行活细胞成像实验了。

活细胞成像技术是指利用特殊的显微镜和荧光探针，可以实时观察活细胞内的生化过程和分子运动。

例如利用双光子激光扫描显微镜，可以观察单个分子的扩散行为。

而显微荧光共振能量转移技术（FRET）则可以观察分子间的相互作用及其生化活性。

这些技术的出现，使得科学家们对于生命机制的理解更加深入和全面，同时也为治疗疾病、开发新药物等研究提供了更好的实验手段。

二、基因编辑技术的突破基因编辑技术是指利用人工的DNA酶，对于基因组进行定向的修改。

其中最为常见的技术就是CRISPR-Cas9系统，可以进行高效、准确地切割基因组。

这项技术的突破，意味着我们可以设计和制造出特定修改的基因类型，甚至可以实现对于人类基因组的编辑。

基因编辑技术的应用广泛，可以用于治疗一些遗传病、改良农作物、再生医学等领域。

例如在肿瘤治疗方面，科学家可以设计特定的CRISPR序列，切除癌细胞中的异常基因序列，达到治疗效果。

三、干细胞技术的广泛应用干细胞是指一种可以分化为多种类型细胞的细胞类型。

在医学领域中，干细胞技术已经得到了广泛的应用。

例如胚胎干细胞可以分化为身体的各个器官的细胞类型，开创了组织工程、再生医学等领域的新局面。

而诱导多能干细胞（iPS）技术可以通过重新编程体细胞，使其获得干细胞的特征，从而在医学治疗上得到广泛应用。

例如，科学家可以通过将患者的体细胞重编程为诱导多能干细胞，再将其定向分化为心脏细胞，从而实现心脏移植。

总之，细胞生物学的发现和应用正在改变着我们对生命的理解和整个医学生物领域的治疗方式。

细胞生物学研究的新进展与发展方向

细胞生物学研究的新进展与发展方向细胞生物学作为生物学的重要分支，研究细胞的结构、功能和生命活动规律，对于我们理解生命的奥秘具有重要意义。

随着科学技术的不断进步和生物学领域的不断拓展，细胞生物学研究也在不断取得新的进展。

本文将从细胞结构、功能、调控机制和技术创新等方面，介绍细胞生物学研究的新进展和发展方向。

一、细胞结构与功能的研究细胞结构与功能的研究一直是细胞生物学的核心内容。

传统细胞学仅依靠显微技术观察细胞的结构，而现在，高分辨率显微技术的发展让我们能够更深入地观察细胞的微观结构。

例如，融合了光学显微和电子显微的荧光共振能量转移(FRET)技术，可以实时监测蛋白质相互作用、信号转导和亚细胞定位等过程，为细胞功能的研究提供了重要的工具。

同时，细胞功能的研究也在不断深入。

根据细胞内蛋白质的表达和活性对细胞功能的影响，利用高通量测序等技术，我们能够更准确地了解蛋白质相互作用网络、细胞信号传导通路和基因调控网络等。

此外，细胞功能研究还包括细胞的分化、增殖和死亡等过程，同时也在研究细胞与环境之间相互作用的机制。

二、细胞调控机制的研究细胞调控机制是细胞生物学研究的重要方向之一。

过去，我们主要依靠观察表型变化、利用基因敲除技术等手段来研究细胞调控网络。

但现在，代谢组学、转录组学和蛋白质组学等高通量技术的应用，为我们揭示细胞调控机制提供了更全面的信息。

在细胞调控机制的研究中，发现并研究新的调控因子是一个重要的课题。

近年来，许多新的非编码RNA分子，如微小RNA和长链非编码RNA，被发现在细胞的调控中具有重要作用。

与此同时，不断涌现的基因编辑技术，如CRISPR-Cas9系统，使得我们能够精确地编辑细胞基因组，进一步揭示细胞调控的奥秘。

三、细胞活体观察技术的发展细胞生物学的研究经常涉及到对活体细胞的观察。

传统的显微技术中，活细胞观察受到显微镜分辨率、活细胞显微镜底物以及细胞样品的限制。

然而，新的技术发展正在改变着这一现状。

显微镜成像技术的最新研究进展

显微镜成像技术的最新研究进展随着科学技术的不断发展，显微镜成像技术也在不断地更新迭代。

显微镜成像技术一直是生命科学与物质科学研究中不可或缺的手段，尤其是对于细胞结构及其功能的研究和材料表征等领域的研究。

本文将介绍显微镜成像技术的最新研究进展。

一、超分辨显微镜超分辨显微镜技术是指用一系列技术手段将普通显微镜的分辨率提高几倍甚至10倍以上的技术，能够显示出物体的更细微的结构和形貌。

超分辨显微镜包括激光荧光显微术、三维结构光显微术、双分子荧光共振能量转移(FRET)显微术等。

这些技术的出现，使得研究者们可以更加直观地看到活细胞中许多关键生物分子的空间分布、相对位置、运动轨迹以及动态变化等。

二、多光子显微术多光子显微术是近年来发展迅速的新型二光子荧光成像技术。

相比于传统的单光子荧光显微术，多光子显微术不需要过滤去背景信号，因而可以成像活细胞发出的极小的荧光信号。

更重要的是，多光子显微术具有更深的成像深度，能够进行未经过表面染色的活组织成像，这一点对于生物科学研究具有重要的意义。

此外，多光子显微成像还可以进行荧光共振能量转移、声发射等多种新型成像技术。

三、球面屏显微镜近年来，有学者提出了一种新型的成像方案——球面屏显微镜，每次可以拍摄出2000多张图像，扫描速度和单张ImageJ软件的分析速度分别为秒级和分级，成像质量和量子效率均属于同类型产品的领先水平。

该技术适用范围广泛，能够应用于细胞生物学，医学成像，物理化学表征等领域，是未来显微成像技术的一个重要发展方向。

四、电子显微镜成像技术传统的光学显微镜的成像分辨率十分有限，一般最高不超过200纳米，在观察大分子及其组装过程时，精确度比较低。

而电子显微镜成像技术可以克服这一困难，它分为穿透电子显微镜和扫描电子显微镜两类。

其中穿透电子显微镜利用超薄样品，以自由空间中的电子束（传统显微镜中的光微粒子）为照射光源，将电子透过样品后观察到的影像转化为信号处理成图像；扫描电镜则是在样品表面按照对应的顺序扫描成像，从而获得比传统光学显微镜更高的地震辨析度。

活细胞成像技术在生命科学中的应用

活细胞成像技术在生命科学中的应用近年来，随着科学技术的进步，生命科学领域中的活细胞成像技术得到了广泛的应用。

活细胞成像技术是通过图像记录和分析的方式，实现对活体细胞的观察和研究。

具有非侵入性、高分辨率、高时间分辨率等特点，为生命科学研究提供了全新的视角。

一、活细胞成像技术的原理活细胞成像技术主要基于荧光显微镜，通过荧光染料或者特殊的荧光蛋白将细胞内的目标标记出来，荧光显微镜将荧光信号转化为数字化的图像信号，从而实现对细胞结构、动态过程等的高时间分辨率观察。

常见的活细胞成像技术有荧光共振能量转移（FRET）、荧光蛋白成像、荧光染料成像等。

荧光共振能量转移技术是通过两个融合了特殊荧光基团的蛋白质之间的能量转移实现信号传递的观察。

荧光蛋白成像技术则是通过人工合成、转染等方式，将荧光蛋白标记到感兴趣的细胞结构上，从而实现对其在时间和空间上的动态变化的观察。

而荧光染料成像技术则是通过不同类型的荧光染料对细胞内部进行标记，从而实现对其形态和功能的观察。

二、应用领域1. 生物学活细胞成像技术在生物学中有着广泛的应用，可以用于研究细胞分裂、细胞运动、胚胎发育以及基因表达等方面。

荧光染料成像技术可以被用于观察细胞内蛋白质、细胞器、细胞骨架以及细胞膜等结构的动态变化。

同时荧光共振能量转移技术可以被用于研究蛋白质间的相互作用和信号传递。

2. 医学活细胞成像技术在医学研究领域中也有着较大的应用。

它可以用于观察药物在细胞内渗透和传递的过程，进一步探究其作用机制。

同时，活细胞成像技术也可以被用于疾病的诊断和治疗。

比如在癌症研究中，荧光染料成像技术可以被用于追踪癌细胞的转移过程，了解癌症的发生机理。

3. 药学在药学领域中，活细胞成像技术也被广泛运用。

它可以用于药物筛选和研发过程中的药效评估。

荧光染料成像技术可以被用于观察细胞的药物处理后的形态和功能变化，从而评价药效和药物毒性。

三、存在问题虽然活细胞成像技术已经得到广泛的应用，但它仍存在一些难题。

flimfret的原理及其生物学应用

Flimfret的原理及其生物学应用1. 引言Flimfret（Fluorescence lifetime imaging fret）是一种基于荧光寿命成像荧光共振能量转移（FRET）技术的新型生物成像方法。

本文将介绍Flimfret的原理和其在生物学研究中的应用。

2. Flimfret的原理Flimfret基于荧光共振能量转移（FRET）技术，其原理基于两个荧光蛋白质间的相互作用。

FRET是一种非辐射性能量转移现象，当接受体（acceptor）和给体（donor）之间距离较近时，给体的激发态能量可以通过非辐射性能量传递到接受体，从而导致接受体荧光增强。

Flimfret通过测量激发态荧光的寿命来确定荧光共振能量转移的发生率。

当FRET发生时，给体的激发态荧光寿命会缩短，而接受体的荧光寿命会延长。

因此，通过测量给体和接受体的激发态荧光寿命可以确定FRET发生的程度。

Flimfret主要利用荧光寿命成像技术来实现，可以高分辨率地观察细胞、组织和生物体内FRET的发生。

同时，在配合适当的荧光探针和显微镜系统时，可以提供更加详细的信息。

3. Flimfret在生物学研究中的应用Flimfret在生物学研究中有广泛的应用，下面将介绍几个典型的应用案例：3.1 蛋白质相互作用研究蛋白质相互作用在生物学中起着重要的作用，可以影响信号传导、基因调控等生物过程。

Flimfret可以利用FRET原理来研究蛋白质的相互作用，通过选择合适的荧光蛋白质做为给体和接受体，可以测量蛋白质相互作用的程度和速率。

3.2 离子和分子浓度检测Flimfret可以通过测量荧光寿命的变化来监测离子和分子的浓度变化。

通过选择适当的荧光探针和显微镜系统，可以实现对特定离子和分子的高灵敏度检测。

3.3 疾病诊断与治疗Flimfret在疾病诊断和治疗中也有潜在的应用。

例如，在癌症研究中，利用Flimfret可以观察肿瘤细胞中的蛋白质相互作用，从而了解癌症的发展机制，为癌症的早期诊断和治疗提供依据。

细胞信号传导通路的研究方法

细胞信号传导通路的研究方法细胞信号传导通路是生命活动中至关重要的一环，其异常调控可能导致许多疾病的发生。

因此，深入研究细胞信号传导通路的调控机制和分子机理，对于疾病诊断，治疗和新药开发具有重要的意义。

然而，介入细胞信号传导通路的研究具有一定的难度，挑战包括确定受体，激活效应物以及检测信号转导通路等。

因此，细胞信号传导通路的研究方法十分重要，以下将介绍常见的细胞信号传导通路研究方法。

一、细胞培养和生化实验细胞培养是细胞信号传导通路研究的基础，通过细胞培养可以培养大量的同种细胞用于实验，比如人类癌细胞系，小鼠胚胎纤维母细胞等。

在细胞培养基中添加适当的营养物质、生长因子和生长调节剂，可以让细胞不断地生长和分裂，成为实验的重要样本来源。

生化实验是细胞信号传导通路研究的主要方法之一，通过对细胞的组分和反应进行分析和识别，确定其信号传导通路的特性和分子机理。

常见的生化实验方法包括免疫沉淀、Western blot、凝胶迁移实验、荧光共振能量转移（FRET）等。

二、基因表达分析方法基因表达分析是研究细胞信号传导调控机制的重要方法之一，通过确定众多通路相关的基因表达水平，可以揭示信号转导通路的特征和分子机制。

常见的基因表达分析方法包括实时荧光定量PCR、芯片技术、下一代测序和CRISPR/Cas9。

实时荧光定量PCR是一种快速、准确且高灵敏度的基因表达水平检测方法，它可以测定RNA，DNA和蛋白质的含量。

该技术可以被用来检测信号传导通路中的基因表达水平，这些基因涉及到信号转导的初始化，扩散和终止阶段。

芯片技术是一种高通量的基因表达分析方法，通过在芯片上固定众多的DNA探针，可以同时检测上千种基因的表达水平。

该技术可以用于检测包括转录因子、细胞凋亡相关基因和同源基因的表达水平。

下一代测序技术是一种高通量的测序技术，它可以在较短时间内同时测出数百万个DNA和RNA序列，该技术可以用来比较大规模的基因表达分析，确定疾病相关基因和影响信号传导的突变。

荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像(FRET-FLIM)技术在生命科学研究中的应用进展

Vol 41, No. 4, pp 1023-1031April !2021第41卷，第4期2021 年 4 月光谱学与光谱分析SpectroscopyandSpectralAnalysis荧光共振能量转移■荧光寿命显微成像(FRET-FLIM )技术在生命科学研究中的应用进展罗淋淋123!牛敬敬3!莫蓓莘林丹樱3!刘琳1 ' 2*1深圳大学生命与海洋科学学院，广东省植物表观遗传学重点实验室,广东深圳5180602.深圳大学龙华生物产业创新研究院,广东深圳5180603 深圳大学物理与光电工程学院!广东深圳 518060摘要细胞是动植物结构和生命活动的基本单位$细胞过程的一个重要特点就是其生化组分在时空调控上的相互作用关系$然而,利用传统的生化方法(如酵母双杂交系统、pull-down 系统等)很难在空间上评估活细胞内分子间的相互作用$光学技术的快速发展，为研究活细胞中生物分子的时空动态提供了新的遗传研究工具,其中荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像(FRET-FLIM )技术在实时探测分析活细胞中生物大分子构象变化和分子间动态相互作用过程具有独特的优势，如：实现对活细胞的实时“可视化”研究，同时具有高时空分辨率&检测更加灵敏、结果可信度高&且基于简易的数学运算完成简单快捷的分析程序$介绍 FRET-FLIM 技术的理论背景知识,对比了该技术与传统蛋白相互作用技术研究的利弊,同时归纳了其在蛋白相互作用、细胞生物学和疾病诊断等方面的最新应用研究进展,最后总结和讨论了 FRET-FLIM 技术的未来发展趋势，以期能够为揭示活细胞的结构和细胞过程相关研究提供新的见解$关键词荧光共振能量转移&荧光寿命显微成像&蛋白相互作用&疾病诊断中图分类号：O433.4文献标识码：RDOI ： 10. 3964/j. issn. 1000-0593(2021)04-1023-09引言随着人类对生命现象本质的探究，科学家对生命科学问题的研究日益深入，这推动了非生物学科(如数学、化学、物理学、信息科学等)与生命科学相互交叉和相互融合的热潮$20世纪90年代，商用共聚焦显微镜的问世为研究活细胞中不同蛋白的共表达提供了便利的工具(1)$与传统宽场成像方法相比，共聚焦显微镜的光学分辨率和视觉对比度都大幅提高，能够呈现高质量的彩色图像，但是其空间分辨率仍无法突破衍射极限(大约200 nm ),因而无法用于研究生物分子间的相互作用$ 2006年以后，许多超分辨率成像技术应运而生,如受激发射损耗显微术(stimulated emission depletion,STED )、结构光照明显微术 (structure i l uminationmicroscopy , SIM )、光激活定位显微术(photoactivatable localization microscopy , PALM )和随机光学重构显微术(stochasticopticalreconstruction microscopy !STORM ) 等!收稿日期：2020-03-30,修订日期：2020-07-12基金项目：国家重点研发计划项目(2016YFD0101803),广东省创新创业团队项目(2014ZT05S078),广东省基础与应用研究基金项目(2019A1515011222),深圳市基础研究面上项目(JCYJ20190808112207542)资助作者简介：罗淋淋，1988年生，深圳大学生命与海洋科学学院光生物学博士研究生e-mail : 1in S luo@163. com通讯作者e-mail %linliu @它们的分辨率都能突破衍射极限，最高空间分辨率可达到10nm ,使光学显微镜步入纳米时代[24) $超分辨成像技术由于其高成像分辨率的优势对科学家在活细胞分子水平上的研究起到了显著的促进作用，如活细胞内生物大分子结构的观察，遗传信息的编码及表达的研究，都对生命过程和疾病发生机理的理解具有重要的意义(5-7] $然而，这些成像技术仅能较好地获取其结构特征，对体内蛋白质-蛋白质的相互作用所体现的生物功能信息分析特异性不强$荧光寿命显微成像(fluorescence lifetime imaging micros copy , FLIM )技术是研究细胞内生命活动状态的一种非常可靠的方法$荧光寿命是荧光团在返回基态之前处于激发态的平均时间，是荧光团的固有性质，与样品浓度、样品吸收、光漂白和激光激发强度等因素无关(切，相反地，荧光寿命对荧光团所处的微环境非常敏感，如细胞中温度、pH 值分布、离子浓度、氧浓度、分子结合或溶液疏水性等，因而它能十分灵敏地反映激发态分子与周围微环境的相互作用及能量转移(10)$ FLIM 技术就是对荧光探针分子的荧光寿命进行1024光谱学与光谱分析第41卷成像，能实现对细胞内诸多生化参数的定量测量，尤其是结合了荧光共振能量转移（forster resonance energy transfer, FRET）的FRET-FLIM技术$FRET本身不是一种成像技术，而是一个物理过程，指两个携带不同荧光基团的大分子之间或同一分子的不同荧光团之间通过电偶极相互作用所发生的非辐射能量转移（1「12）。

荧光共振能量转移(FRET)体系的构建及其验证

荧光共振能量转移(FRET)体系的构建及其验证钱月娇;冯钰斌;钱学文;朱传君;李鸽;卢多;陈飞虎【摘要】目的构建携带FRET体系( YFP-CFP对)的一组原核表达工程质粒,在大肠杆菌( E. coli)中高效表达后,验证该体系FRET信号作为细胞内监测蛋白相互作用指标的可行性.方法分别构建 N端、C端以及两端分别编码 YFP和(或) CFP 的 6 个原核表达工程质粒: pNYFP、 pCYFP、pNCFP、 pCCFP、 pYFP-CFP、 pCFP-YFP.设计 YFP-CFP 和CFP-YFP作为阳性对照,而等量的YFP与CFP混合的体系(YFP + CFP)作为阴性对照.将过表达的工程蛋白通过镍柱、分子筛层析柱进行初步纯化后使用酶标仪检测相同摩尔浓度纯化蛋白的FRET信号.在此基础上,进一步用酶标仪检测表达工程蛋白的菌液中的FRET信号.结果通过测序验证,成功构建了6个原核表达的工程质粒.酶标仪检测的结果显示在体外纯化蛋白条件和菌液条件下均可产生明确的FRET信号.结论成功构建了FRET体系的原核表达工程质粒,不仅验证了蛋白条件下的可行性,而且验证了菌液条件下的可行性,为在活细胞条件下对蛋白-蛋白相互作用进行实时的动态研究,提供一个非常便利的实验方法.【期刊名称】《安徽医科大学学报》【年(卷),期】2018(053)012【总页数】7页(P1821-1827)【关键词】荧光共振能量转移;蛋白-蛋白相互作用;活细胞;原核表达;工程质粒;蛋白纯化【作者】钱月娇;冯钰斌;钱学文;朱传君;李鸽;卢多;陈飞虎【作者单位】安徽医科大学药学院,合肥 230032;安徽医科大学药学院,合肥230032;安徽医科大学药学院,合肥 230032;安徽医科大学药学院,合肥 230032;安徽医科大学药学院,合肥 230032;中国医学科学院药物研究所,北京协和医学院,北京100032;安徽医科大学药学院,合肥 230032【正文语种】中文【中图分类】R966荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)，是较早发展起来的一门技术[1]。