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引物合成
主要内容
• 引物概念 • 应用领域 • 引物合成原理及方法 • 引物纯化方式 • 常见问题
引物
• 一小段单链DNA。
– Hd3a(cds): – 扩增长度：117bp，扩增范围：391-507；建议退火温度：59.1℃。 – sense:GGGCGTCAGACAGTGTACG – antisense:CTCGCGCTGGCAGTTGAAG – antisense probe:FAM-TTCAACACCAAGGACTTCGCCGAGC –TAMARA
全基因合成 根据实验要求定
反义核酸 根据实验要求定
修饰引物 根据实验要求定
纯度级别要求
OPC PAGE OPC, PAGE OPC OPC,PAGE,HPLC OPC,PAGE,HPLC PAGE PAGE PAGE, HPLC
常见问题
• 引物合成OD数 • 引物定量 • 引物溶解及浓度 • 引物Tm值
修饰及标记引物
• 30多种引物修饰及标记类型：
–稀有碱基修饰：硫代修饰、甲基化 –引物5′端的修饰及标记 –引物3′端的修饰及标记 –双标记探针 –分子信标
• 发货时间：3-5个工作日。
引物纯化方式
• C18柱脱盐 • OPC 纯化 • PAGE纯化 • HPLC纯化
• C18柱脱盐：（简易反相柱）。
• 引物合成技术在生命科学领域应用极为广泛，如PCR扩增、 DNA杂交、基因合成及DNA测序等。
引物合成方法及原理
• 合成方法：固相亚磷酰胺三酯法。
• 特点:
–高效 –快速的偶联 –起始反应物比较稳定
引物合成原理
将DNA固定在固相载体上由3‘→5’完成DNA 链的合成，相邻的核苷酸通过3‘→5’磷酸 二酯键连接。通过碱性高温处理，将连接 在载体上的引物切下来，通过OPC, PAGE 等纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐， 沉淀,沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定 量，根据定单要求分装。
引物合成OD数
• 1.客户需要合成多少OD数为宜？
–一般根据实验目的确定，一般PCR，2OD引物可以做 200-500次50ul标准。如果是做基因拼接或退火后的 拼接，1OD足够.
• 2.公司提供的OD数。
–按照客户要求的量合成，写在引物合成报告单上。 –如不注明，则默认提供2OD。 –一般公司会留有3个月以内客户引物的备份
引物合成流程
DNA合成仪
• DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生 产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同， 主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不 同和单个循环用时的多少。
• Doctor Oligo-192 6台,美国Biolytic公司
• 世界上最好的高通量DNA/RNA合成仪!
• HPLC纯化：用高效液相色谱的原理，纯度可 以大于99%。主要用于长链和修饰引物的纯 化.成本较高，批量生产效率不高。
应用
引物长度要求
一般PCR扩增
< 45base
一般PCR扩增
>45 base
诊断PCR扩增
< 40base
DNA测序
20base左右
亚克隆，点突变 根据实验要求定
基因构建 根据实验要求定
• 成品引物以干粉形式，呈白色或无色絮状 (-20℃，1年) 。
• 保存浓度：100umol/L(-20℃，数周)。
–溶解方法：
• 按照报告单Note加水（或TE ph8.0） • 按以下公式计算：
V（ul）=OD数*33*10000/引物分子量
• 使用浓度：10-25pmol/ul
引物Tm值
• Tm值（解链温度:使50%的DNA发生变性时的温度） • =4（G+C）＋2（A+T） • 退火温度：取上下游引物的TM中间值+/-5℃做温度
• 可用于补发或检测
引物定量
• 准确性：酶标仪定量。 • 不准的原因:分装问题、系统误差(小于10%是允许的) • 引物丢失：
–先瞬离再开盖，防止引物干粉飞扬。
• 验证：2OD引物加1ml水，溶解混匀后取100ul,加900ul水，用 紫外线分光光度计（260nm）读数为0.2 。
引物溶解及浓度
梯度确定。
• 报告单上两个Tm：
–Tm（0.05M Na+）:用于PCR –Tm（1M Na+）：杂交
–有效地去除盐分
–不能有效去除比目的片段短源自文库小片段
–一般不会对普通PCR反应产生影响
–不能用于测序、克隆
• OPC纯化:根据DNA保护基和Cartridge柱中树 脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA 片段。纯度大于95%。适用于40mer以下引物 的纯化。
• PAGE纯化：用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对 DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的 DNA的方法。纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。
主要内容
• 引物概念 • 应用领域 • 引物合成原理及方法 • 引物纯化方式 • 常见问题
引物
• 一小段单链DNA。
– Hd3a(cds): – 扩增长度：117bp，扩增范围：391-507；建议退火温度：59.1℃。 – sense:GGGCGTCAGACAGTGTACG – antisense:CTCGCGCTGGCAGTTGAAG – antisense probe:FAM-TTCAACACCAAGGACTTCGCCGAGC –TAMARA
全基因合成 根据实验要求定
反义核酸 根据实验要求定
修饰引物 根据实验要求定
纯度级别要求
OPC PAGE OPC, PAGE OPC OPC,PAGE,HPLC OPC,PAGE,HPLC PAGE PAGE PAGE, HPLC
常见问题
• 引物合成OD数 • 引物定量 • 引物溶解及浓度 • 引物Tm值
修饰及标记引物
• 30多种引物修饰及标记类型：
–稀有碱基修饰：硫代修饰、甲基化 –引物5′端的修饰及标记 –引物3′端的修饰及标记 –双标记探针 –分子信标
• 发货时间：3-5个工作日。
引物纯化方式
• C18柱脱盐 • OPC 纯化 • PAGE纯化 • HPLC纯化
• C18柱脱盐：（简易反相柱）。
• 引物合成技术在生命科学领域应用极为广泛，如PCR扩增、 DNA杂交、基因合成及DNA测序等。
引物合成方法及原理
• 合成方法：固相亚磷酰胺三酯法。
• 特点:
–高效 –快速的偶联 –起始反应物比较稳定
引物合成原理
将DNA固定在固相载体上由3‘→5’完成DNA 链的合成，相邻的核苷酸通过3‘→5’磷酸 二酯键连接。通过碱性高温处理，将连接 在载体上的引物切下来，通过OPC, PAGE 等纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐， 沉淀,沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定 量，根据定单要求分装。
引物合成OD数
• 1.客户需要合成多少OD数为宜？
–一般根据实验目的确定，一般PCR，2OD引物可以做 200-500次50ul标准。如果是做基因拼接或退火后的 拼接，1OD足够.
• 2.公司提供的OD数。
–按照客户要求的量合成，写在引物合成报告单上。 –如不注明，则默认提供2OD。 –一般公司会留有3个月以内客户引物的备份
引物合成流程
DNA合成仪
• DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生 产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同， 主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不 同和单个循环用时的多少。
• Doctor Oligo-192 6台,美国Biolytic公司
• 世界上最好的高通量DNA/RNA合成仪!
• HPLC纯化：用高效液相色谱的原理，纯度可 以大于99%。主要用于长链和修饰引物的纯 化.成本较高，批量生产效率不高。
应用
引物长度要求
一般PCR扩增
< 45base
一般PCR扩增
>45 base
诊断PCR扩增
< 40base
DNA测序
20base左右
亚克隆，点突变 根据实验要求定
基因构建 根据实验要求定
• 成品引物以干粉形式，呈白色或无色絮状 (-20℃，1年) 。
• 保存浓度：100umol/L(-20℃，数周)。
–溶解方法：
• 按照报告单Note加水（或TE ph8.0） • 按以下公式计算：
V（ul）=OD数*33*10000/引物分子量
• 使用浓度：10-25pmol/ul
引物Tm值
• Tm值（解链温度:使50%的DNA发生变性时的温度） • =4（G+C）＋2（A+T） • 退火温度：取上下游引物的TM中间值+/-5℃做温度
• 可用于补发或检测
引物定量
• 准确性：酶标仪定量。 • 不准的原因:分装问题、系统误差(小于10%是允许的) • 引物丢失：
–先瞬离再开盖，防止引物干粉飞扬。
• 验证：2OD引物加1ml水，溶解混匀后取100ul,加900ul水，用 紫外线分光光度计（260nm）读数为0.2 。
引物溶解及浓度
梯度确定。
• 报告单上两个Tm：
–Tm（0.05M Na+）:用于PCR –Tm（1M Na+）：杂交
–有效地去除盐分
–不能有效去除比目的片段短源自文库小片段
–一般不会对普通PCR反应产生影响
–不能用于测序、克隆
• OPC纯化:根据DNA保护基和Cartridge柱中树 脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA 片段。纯度大于95%。适用于40mer以下引物 的纯化。
• PAGE纯化：用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对 DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的 DNA的方法。纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。