端粒和端粒酶是如何保护染色体的——2009年诺贝尔生理学或医学奖工作介绍及相关研究进展

·诺贝尔奖工作回顾·
端粒和端粒酶是如何保护染色体的
——－２００９年诺贝尔生理学或医学奖工作介绍及相关研究进展
宋伟＋ 宋德懋△ （北京大学医学部生理学与病理生理学系，北京１００１９１）
２００９年１０月５日瑞典卡罗林斯卡医学院诺贝 尔生理学或医学奖评审委员会宣布将本年度诺贝尔 生理学或医学奖授予三位美国科学家伊丽莎白·布 莱克本（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｈ．Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ）、卡罗尔·格雷德 （Ｃａｒｏｌ Ｗ．Ｇｒｅｉｄｅｒ）和杰克·绍斯塔克（Ｊａｃｋ Ｗ． Ｓｚｏｓｔａｋ）（图１），以表彰他们在上世纪８０年代发现 了“端粒和端粒酶是如何保护染色体的”。
’北京大学医学部八年制临床医学专业２００４级学生 △通讯作者
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其中，前导链（１ｅａｄｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ）连续合成，随从链（１ａｇ－ ｓｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ）先分段沿５ ７＿＋３’方向合成冈崎片段 （Ｏｋａｚａｋｉ ｆｒａｇｍｅｎｔ），然后切去各段引物，再由ＤＮＡ 连接酶将冈崎片段连接成完整的ＤＮＡ链。分析上 述过程时不难发现，由于ＤＮＡ聚合酶不能催化
１９８４年Ｇｒｅｉｄｅｒ来到加州大学，在Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ的 指导下共同研究端粒的复制问题。上文已述及由于
真核生物ＤＮＡ聚合酶不能催化３ ７硝７方向的合成
反应，导致了子代ＤＮＡ链５ ７端的引物被切去后留下 的空隙无法补充，这段空隙的模板链是Ｇ链。她们 设想存在一种特殊类型的转移酶（ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）能沿
上述两个有关端粒的问题引起了一些科学家的 兴趣，其中就有Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ教授和Ｓｚｏｓｔａｋ教授。
二、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ与Ｓｚｏｓｔａｋ合作发现端粒能保护 染色体末端
１９７５年，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ在耶鲁大学Ｊｏｓｅｐｈ Ｇａｌｌ的 实验室里检测了嗜热四膜虫（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒ－ ｍｏｐｈｉｌａ）编码核糖体ＲＮＡ的线性ｒＤＮＡ分子的端粒 序列，结果表明是由核苷酸六聚体（ＣＣＣＣＡＡ／ ＧＧＧＧＴＩ＇）连续重复构成，重复的次数在２０—７０之 间；进一步研究还发现端粒重复序列具有方向性，即 在端粒的３ ７端由（ＴＹＧＧＧＧ）重复序列构成（称为Ｇ 链），５ ７端由（ＣＣＣＣＡＡ）重复序列构成（称为Ｃ链）。 除此之外，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ还揭示了四膜虫端粒的重复序 列具有不连续性，这种不连续性的存在有助于对不 同的端粒进行标记，但是其意义还不完全清楚［３】。
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田１ ２００９年诺贝尔生理学或医学奖获奖看
Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ教授１９４８年出生在澳大利 亚塔斯马尼亚州霍巴特市，毕业于墨尔本大学，１９７５ 年在剑桥大学获博士学位，而后在耶鲁大学做博士 后，１９９０年至今在加州大学任教。Ｊａｃｋ Ｓｚｏｓｔａｋ教授 １９５２年出生在英国伦敦，毕业于加拿大麦吉尔大 学，１９７７年在美国康奈尔大学获博士学位，现供职 于哈佛医学院、麻省总医院和霍华休斯医学研究所。 这两位科学家合作证实了真核生物的端粒具有保护 染色体末端的作用。Ｃａｒｏｌ Ｇｒｅｉｄｅｒ教授１９６１年出生 在美国加州的圣地亚哥，１９８７年在加州大学Ｂｌａｃｋ— ｂｕｒｎ教授的指导下获博士学位，而后在冷泉港实验 室做博士后，１９９７年至今任教于约翰·霍普金斯大 学医学院。Ｇｒｅｉｄｅｒ教授与Ｂｌａｃｋｂｕｍ教授合作发现 了催化延伸端粒结构的端粒酶。本文将重点介绍三 位科学家具有开创性的基础研究成果及其进展在当 前医学领域的非凡意义。
四、端粒维持染色体末端的稳定性 Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ和Ｊａｃｋ Ｓｚｏｓｔａｋ两位科学家 在上世纪８０年代初发现了端粒能够保护染色体末 端，并且这种保护作用具有进化保守性，但具体机制 当时并不清楚。经过２０多年的研究，科学家已经对 端粒的结构和功能有了更为深刻的理解。以下仅以 哺乳动物的端粒为例加以介绍。 哺乳动物端粒的重复序列为（ＴＦＡＧＧＧ／ＡＡＴＣ． ＣＣ），其中Ｇ链３ ７端是一段单链的悬突（ｏｖｅｒｈａｎｇ） （图６），Ｃ链５ ７端以序列（ＡＴＣ）结束。电镜观察发 现，端粒结构是一个双环结构，称为Ｔ环（Ｔ—ｌｏｏｐ），３’ 端的悬突替代Ｇ链的一段序列与Ｃ链配对，形成Ｄ 环（Ｄ－ｌｏｏｐ）（图６），Ｔ环的形成使得染色体的末端 被包裹保护起来而免遭破坏ｕ ０｜。哺乳动物的端粒 与一个６种蛋白构成的复合物ｓｈｅｈｅｒｉｎ结合，这６ 种蛋白分别为ＴＲＦｌ、ＴＲＦ２、ＰＯＴｌ、ＴＩＮ２、Ｒａｐｌ和 ＴＰＰｌ。ＴＲＦｌ和ＴＲＦ２（ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｒｅｐｅａｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ １ ａｎｄ ２）能够特异性识别并结合双链重复序列上的 ５ ７一ＹＴＡＧＧＧ，丌Ｒ－３ ７序列，ＰＯＴｌ（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｌｏ— ｍｅｌ七￥１）则能识别并结合３ ７端悬突和Ｄ环上单链重 复序列上的５ ７一（Ｔ）ＴＡＧＧＧＴＹＡＧ－３’序列，上述三种
上世纪５０年代以后，随着ＤＮＡ双螺旋结构的 发现以及ＤＮＡ聚合酶（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）催化ＤＮＡ 复制机制的阐明，染色体末端的复制问题随之出现。 １９７２年，Ｊａｍｅｓ Ｗａｔｓｏｎ（１９６２年诺贝尔生理学或医 学奖获得者）在探讨噬菌体ｒ１７的ＤＮＡ复制时【２ ｏ指 出，真核生物线性ＤＮＡ的复制始于内部起始点，以 短链ＲＮＡ分子作引物，沿５０３方向延伸互补链。
的ＲＮＡ片段为模板来合成端粒的‘９１。至此，嗜热四 膜虫端粒合成的机制已经非常清楚了（图５）。
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图５端粒酶催化端粒延伸模型 嗜热四膜虫端粒Ｇ链上带有一个１３个碱基的悬突（０ｖｅｌｌｌｎｇ） （１）端粒酶识别端粒底物末端的１ＴＧＧＧＧ重复序列，并与端粒 酶ＲＮＡ上的５＂－ＣＡＡＣＣＣＣＡＡ－３ ７模板序列配对；（２）合成ＴｒＧ序 列；（３）端粒酶移位使末端的ＴｒＧＧＧＧＴＩＶ，重新与模板序列配 对；（４）继续延伸端粒，复制模板序列完成ＴＴＧＧＧＧＴｒＧ序列的 合成。（引自参考文献Ｉｓ Ｊ）
与此同时，上世纪７０年代Ｓｚｏｓｔａｋ在哈佛大学 建立了自己的实验ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，试图在酵母中构建一种人工 线性ＤＮＡ分子，来研究酵母（Ｙｅａｓｔ）染色体同源重 组机制（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）。但当他用限制 性内切酶酶切酵母的环形质粒时，由于存在“黏”性 末端，酶切后形成的线性ＤＮＡ分子很快与酵母的染
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色体ＤＮＡ发生同源重组，或很快被降解而不能长时 间稳定存在。因此，如何使线性质粒分子在酵母细 胞核内稳定存在并进行复制，便成为Ｓｚｏｓｔａｋ实验室 亟待解决的一个难题。
１９８０年，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ在戈登会议（Ｇｏｒｄｏｎ Ｃｏｎｆｅｒ－ ｅｎｃｅ）上关于嗜热四膜虫染色体端粒结构的报告引 起了Ｓｚｏｓｔａｋ的极大兴趣，他们决定合作设计一个方 案来提高酵母线性ＤＮＡ分子的稳定性。他们将嗜 热四膜虫ｒＤＮＡ一个长１．５ｋｂ、含有端粒的末端片 段，连接到酵母环状质粒酶切后形成的线性分子两 端，构成了一个全新的线性ＤＮＡ分子。令人惊讶的 是这种分子转入酵母后，它们可以稳定存在并且进 行复制，子代ＤＮＡ保持了嗜热四膜虫端粒的结构特 点（图３）。如果将这种分子一端换成酵母自身染色 体的末端片段，这种稳定性同样存在一Ｊ。Ｂｌａｃｋｂｕｍ 和Ｓｚｏｓｔａｋ的这一研究成果的重要性在于发现了嗜 热四膜虫ｒＤＮＡ的端粒能在亲缘关系较远的酵母中 发挥功能这一现象，说明端粒在进化上具有很强的 保守性。在后续的研究中，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ和Ｓｚｏｓｔａｋ测 定了酵母的端粒是由序列Ｃ１—３Ａ不规则重复构 成，并且发现酵母中特有的端粒重复序列同样可以 添加到嗜热四膜虫线性质粒分子的末端发挥同样的 功能㈨。
图３带有端粒的人工微染色体可以在酵母菌中稳定存在 嗜热四膜虫ｒＤＮＡ的一个长１．５ｋｂ、含有端粒的末端片段连接到 酵母线性质粒分子的两端，构成了一个全新的线性质粒分子。 将其转入酵母细胞后，可以稳定存在（ｈｔｔｐ：／／ｎｏｂｅｌｐｒｉｚｅ．ｏｒｇ／ｎｏ－ ｂｅｌ＿ｐｒｉｚｅｓ／ｍｅｄｉｃｉｎｅ／ｌａｕｒｅａｔｅｓ／２００９／）
圈４端粒合成模式图 在Ｇ链上端粒酶催化端粒沿３ ７—巧７延长，再以此
为模板合成互补ｃ链
随后，她们发现这种特殊的转移酶是一种由 ＲＮＡ和蛋白质构成的核蛋白（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ， ＲＮＰ）复合体，两种成分均是其发挥功能所必需的， 她们将这种酶命名为端粒酶（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）¨Ｊ。接着， 两人又克隆了嗜热四膜虫端粒酶上一段１５９ｂｐ长的 ＲＮＡ片段（１５９ ＲＮＡ），该片段上含有（ＣＡＡＣ— ＣＣＣＡＡ）序列，如果设法干扰这一段序列，那么端粒 酶将无法正常工作，这说明端粒酶可能以此为模板 来延长端粒¨１。１９９０年，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ实验室的Ｇｏｕ— Ｌｉａｎｇ Ｙｕ将这段序列突变，结果合成的端粒序列随 之变化，且与之互补，这充分说明了端粒酶是以其上
三、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ与Ｇｒｅｉｄｅｒ共同发现催化端粒延 伸的端粒酶
虽然Ｂｌａｃｋｂｕｍ和Ｓｚｏｓｔａｋ的实验证实了端粒在 物种进化中的保守性以及其保护染色体稳定性的重 要功能，但是端粒的复制问题始终未能解决。科学 家们试图用多种模型来解释这个问题，包括同源重 组或转座作用、回文结构或发卡结构等，也有科学家 设想存在一种全新的酶催化合成端粒。
３’硝’方向先将Ｇ链延长，再以此为模板合成互补
的ｃ链，这样就保证了子代ＤＮＡ链５ ７端的完整性 （图４）。她们用一段合成的端粒作为底物，加入嗜 热四膜虫的无细胞浸出物（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｅｘｔｒａｃｔ）中，并混 合了Ｏｔ一３２Ｐ—ｄＧＴＰ与ｄＡＴＰ、ｄｒｒＩ＇Ｐ、ｄＣＴＰ，孵育一段时 间后将产物进行凝胶电泳分析。结果发现，ＤＮＡ寡 聚体的延长是以６碱基序列重复相加来完成的，上 述结果说明了确实存在一种此前未知的酶来催化端 粒特有的重复序列延伸。为了排除这种延伸是由已 知的ＤＮＡ聚合酶以四膜虫自身染色体上的 （ＣＣＣＣＡＡ）序列为模板完成的，她们用微球菌核酸 酶（ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ）破坏无细胞浸出物中四膜 虫自身染色体上的（ＣＣＣＣＡＡ）ｎ序列，但上述过程 依然存在，证实了上述结论。另外，嗜热四膜虫中的 这种转移酶还能催化（ｒｌＴＧＧＧＧ）叠加到酵母端粒重 复序列构成的引物上，这说明此种转移酶同样具有 进化上的保守性。但其对随机序列的ＤＮＡ底物不 延伸；并且该活性不依赖于ＤＮＡ聚合酶旧Ｊ。
ＤＮＡ链３ ７—７方向的延伸，子代ＤＮＡ链５ ７端的引
物被切去后会留下一段空隙，导致子代ＤＮＡ分子上 有一段不完整的５７末端，ＤＮＡ链也会随着不断的复 制而逐渐缩短（图２）。但实际上真核生物线性 ＤＮＡ末端的复制是可以完整的，这个机制是什么？ 这是有关端粒的第二个问题。
围２其核生物线状ＤＮＡ在复制过程中导致末端部分缺失
一、端粒问题研究的由来 “端粒”（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）的概念最早由果蝇遗传学家 Ｈｅｒｍａｎｎ Ｊ．Ｍｕｌｌｅｒ（１９４６年诺贝尔生理学或医学奖
获得者）提出。Ｍｕｌｌｅｒ于上世纪２０年代用ｘ射线对 果蝇进行了人工诱变，在对突变基因的分析中，他发 现很多突变与染色体片段的重排——倒转、易位或 缺失有关。重排是通过片段的重新连接（ｒｅａｔｔａｃｈ— ｍｅｎｔ）来实现的，但是这种连接不会发生在染色体游 离端（ｆｒｅｅ ｅｎｄ）与游离端、或者游离端与断端之间。 １９３８年，Ｍｕｌｌｅｒ在当时的科学杂志Ｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ Ｎｅｔ上发表了一篇题为“Ｔｈｅ ｒｅｍａｒｋｉｎｇ ｏｆ Ｃｈｒｏｍｏ一 ￥ｏｍｅｓ”的演讲稿，文中他将染色体的游离端命名为 端粒。端粒的字面意思是末端部分（ｅｎｄ ｐａｒｔ），由两 个希腊词根“ｔｅｌｏｓ”（末端）和“ｍｅｌ＇ｏ￥“（部分）合成。 Ｍｕｌｌｅｒ设想端粒是一种末端基因，指出“这种末端基 因具有某种特殊的功能，即可以对染色体的末端起 到封闭（ｓｅａｌｉｎｇ）的作用，从某种意义上讲，如果染色 体的末端不被封闭，染色体就不会持续存在”。 Ｍｕｌｌｅｒ的结论由Ｂａｒｂａｒａ ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ（１９８３年诺贝尔 生理学或医学奖获得者）在玉米中得到证实。１９４１ 年ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ在分析Ｘ射线诱导玉米发生基因突 变时，同样发现了染色体存在易位、缺失等现象，这 些都是ＤＮＡ断端融合（ｆｕｓｉｏｎ）的结果，但是“染色 体的末端不会与任何染色体片段发生融合”，也就 是说，ＤＮＡ断端具有“黏”性，易于与其他断端融合， 而正常的染色体末端则非常稳定¨Ｊ。产生这一现 象的原因是什么？合理的推测是，染色体末端不同 于ＤＮＡ断端，它应该有一个特殊的结构来避免它们 之间发生融合。这是有关端粒的第一个问题。