实验十二 噬菌体效价的测定
噬菌体的效价测定
裂解 成熟
增殖
侵入 吸附
⑤
★烈性噬菌体与温和噬菌体旳生活史比较：
裂解性循环 屡次循环
溶原性循环
自发或诱导
同步复制 整合
⑥★溶源性菌株旳检验：
措施：在合适旳培养基中培养待测菌样→→在对 数期进行紫外线照射，诱导原噬菌体复制→→进 一步培养→→过滤培养物，去处活菌体→→滤液 与指示菌混合、倒平板（或将滤液加到敏感性指 示菌旳液体培养物中）→→观察是否有噬菌斑出 现（或使菌液变清）.
★一步生长（One-step growth)
成 熟 的 噬 菌 体 粒 子 ， 除 M13 等 少 数 噬 菌 体 外 ，均 借宿主细胞裂解而释放。细菌的裂解导致一种肉眼可 见 的培养物溶解。 噬菌体的这种生长 (繁 殖 )方 式 称 为 一步生长。
如果只观察一个被感染的细胞，噬菌体数目的增 殖过程将是一条垂直于时间的直线：
A mob of bacteriophage attacking E. coli
The oval object that stretches diagonally across the micrograph top-to-bottom is a single bacterium. The much smaller and far more numerous round guys, practically paving the surface of the bacterium, are the bacteriophage heads.
●敏感性指示菌——遇溶源菌裂解后所释放旳温和噬菌体 会裂解性生活周期旳非溶源性菌株，这些菌株能够从自然 界或菌种库中取得。
⑦★溶源菌有下列特征：
☆可稳定遗传，即溶源菌旳子细胞一般也是溶原性 旳。 ☆自发裂解和诱发裂解（具有产生噬菌体旳潜在能 力） ☆具有抗同原噬菌体感染旳“免疫性” ☆溶源性细菌旳复愈 ☆取得新旳生理特征（溶源性转变） ☆不足转导
噬菌体效价的测定
（4）为什么选用双层琼脂平板法测定噬菌体效价？
七.实验关键问题，注意事项及实验要求
1.关键问题：稀释，温度，倒板
2.注意事项：移液器使用及登记，
3.实验要求
4.预习报告（写清具体实验步骤），试管清洗，Tip回收，实验室卫生，保持安静，结果观察请于实验后第二日观察。
5.实验报告要求（清晰简洁，记录关键内容）
6.实验过程，实验报告及实验考核综合评定此次实验成绩。
八.物品准备
1.ER2738菌液：每组～10ml（注意保持无噬菌体污染）
2.M13KE：每组一只（1ml）
3.稀释用培养基：无菌水替代（TBS）
4.实验操作无需在超净台进行（原因，另外是否所有测定滴度的实验都可以）
5.EP管，Tip头用量
噬菌体效价的测定
一.目的要求
1.学习噬菌体效价测定的基本方法。
2.掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价的基本方法。
二、基本原理:
噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑，因此，能进行噬菌体的计数。但因噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100%(一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染)，所以为了准确地表达病毒悬液的浓度(效价或滴度)一般不用病毒粒子的绝对数量而是用噬菌斑形成单位(Plaque-forming units,简写成pfu)表示。
(2)凝固后，倒置37℃培养。记录培养时间
5．观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度的噬菌斑数目记录于实验报告表格内，并选取 30～300个噬菌斑的平板计算每毫升未稀释的原液的噬菌体数（效价）。
噬菌体效价的测定
下周实验内容
微生物（细菌）的常见生理生化反应
要点： 1、掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 2、了解糖发酵的原理和在细菌鉴定中的重要作用。 3、掌握通过糖发酵（葡萄糖、蔗糖、乳糖）鉴别不同微
生物的方法。 4、了解IMViC（吲哚、甲基红、伏-普、柠檬酸）与硫化
氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。
噬菌体效价测定的方法
二、双层平板法
单层与双层平板法所形成的噬菌斑的比较
双层平板法的优点：
①加了底层培养基后，可使原来底面不平 的玻璃皿的缺陷得到了弥补；
②所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平 面上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近、 边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑的 重叠现象；
③因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬 菌斑较大，更有利于计数。
实验内容三 噬菌体效价的测定
一、噬菌体效价测定的方法 （梯度稀释）
▪ 斑点试验法 ▪ 液体稀释试管法——以不长菌判断（澄清） ▪ 双层平板法——最常用，优点较多 ▪ 单层平板法 ▪ 载玻片法——快速 ▪ 其它病毒的效价（计数）测定——空斑计数、
电子显微镜直接计数、免疫学间接测定（凝 集、ELISA——酶标仪）
3、牛肉膏蛋白胨固体培养基（2%的琼脂）——底层用， 150ml/组，装于250ml三角瓶， （用于制备9个无菌平板，倒薄一点）
4、上层用5ml牛肉膏蛋白胨半固体培养基（0.8 %的琼脂 ），融化后分装于15×150mm试管中加塞包扎灭菌，10 支/组；（上周已准备好）。
5、1ml无菌吸管 4支/组。
毫升未稀释的原液的噬菌体效价。 噬菌体效价（pfu/ml）=
噬菌斑数×10× 稀释倍数
实验步骤框图（教师进行演示操作）
用牛肉膏蛋白胨固 体培养基倒平板9
噬菌体效价实验
中国典型培养物保存中心China Center for Type Culture Collection (CCTCC)噬菌体效价实验实验材料：菌株：CCTCC AB 2013329（λ噬菌体溶原株）Escherichia coli K12 WK 6 λCCTCC AB 2013330（λ噬菌体敏感株）Escherichia coli C600 CR34培养基：肉汤培养基；软琼脂：肉汤培养基中加入0.5%琼脂10ml/管培养条件：NA培养基或LB培养基，37℃实验步骤：7.5ml 新鲜E.coliλ菌液（CCTCC AB 2013329）离心菌沉淀用1ml无菌水悬浮菌悬液加在无菌平皿中央，开皿盖，在安全柜的紫外灯下照射15秒（0.15mJ/cm2）加入NA培养液5ml37℃暗培养3小时吸取以上菌液-培养液混合物，加1 - 0.5ml氯仿震荡后离心12000rpm2分钟上清十倍稀释至10-7选择10-5、10-6、10-7上清稀释液100ul 与100ul受体菌（CCTCC AB 2013330）混合37℃温浴20分钟混合菌液加入到NA软琼脂（不烫手）中震荡混匀倒NA平板实验结果：稀释度为10-4的平板：布满噬斑不可数稀释度为10-5的平板：噬斑346个稀释度为10-6的平板：噬斑37个稀释度为10-7的平板：噬斑4个图1. 上一排为平板背面照片，下一排为平板正面照片。
教学建议：噬菌体液体放置在室温下两周会导致数量下降一个数量级。
宿主菌必须是噬菌体敏感菌株CCTCC AB 2013330，教学用普通大肠菌和噬菌体溶原菌株不能产生噬菌斑。
琼脂的浓度（1.5%-2.0%），过高或过低的琼脂含量均不能达到好的效果。
噬菌体与细胞的比例，测定噬菌体效价应采用低感染复数。
指示菌密度是在平板上获得清晰噬菌斑效果的重要因素之一，其细胞密度不宜过高。
一般控制在1ⅹ107个细胞/ml为宜。
实验教材：沈萍，陈向东《微生物学实验》4版. 高等教育出版社.2007, 35-39.王建波，方呈祥《遗传学实验教程》武汉大学出版社. 2004, 111-114.。
噬菌体裂解液的制备、噬菌体效价测定及转导
4、转导频率的测定
向一支空试管中加入 0.5mL E. coli K12S，在 37℃恒温培养箱中培养 10min。用牛肉膏 蛋白胨液体培养基将原液稀释至 10-3、10-4，每个稀释度用 0.2mL 裂解液涂两个平板，在 37℃恒温箱中培养 48h，观察结果并计算转导频率： 转导子/mL = 每皿平均转导子数 ∗ 稀释度 ∗ 2 0.2mL
2、噬菌体效价的测定 将噬菌体裂解液活化后，取 0.5mL，用 4.5mL/管的牛肉膏蛋白胨液体培养基进行 10 倍 系列稀释至稀释到原液的 10-4。 将素琼脂培养基融化后向每个试管中加入 4mL50℃的素琼脂 液体，并向每支试管中加入 0.5mL E. coli K12S，振荡使之混合均匀，再分别取 10-2、10-3、 10-4 三个稀释度的噬菌体菌悬液 0.5mL 介入素琼脂试管中。前后揉搓，使之混匀，立即倒在 含有牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板上。 倒置与 37℃恒温培养箱中培养 24h。 噬菌体效价计
噬菌体裂解液经紫外线照射诱导后，使得原噬菌体从细菌染色体上脱离而进入裂解周期， 在宿主细菌细胞内进行复制和组装，形成大量完整的噬菌体粒子。细菌被裂解，释放出游离 的噬菌体粒子，通过离心获得噬菌体裂解液。噬菌体的效价是指 1ml 噬菌体裂解液中所含 噬菌体的数目。在含有敏感宿主菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，根据噬菌 斑形成单位，进行噬菌体效价测定。 转导分为两种类型，即为普遍性转导和局限性转导。本实验为局限性转导，以双重溶源 性细菌 E.coli K12F(λ )gal+为供体，经紫外线（UV）诱导，在噬菌体裂解液中，将含有两种 类型的噬菌体， （λ 和λ dg） ，λ dg 是缺陷噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的 基因（gal） ，当缺陷性噬菌体λ dg 再次侵染敏感菌大肠杆菌 K12S 时，会将发酵半乳糖的基 因转移到 S 菌，使 S 菌获得 gal 基因，从而使得 S 菌获得发酵半乳糖的能力，利用转导子在 EMB 培养基上发酵半乳糖的特征进行转导频率的计算和分析。
噬菌体效价的测定
实验器材
• 菌种
大肠杆菌，大肠杆菌噬菌体裂解液原液
• 培养基
LB培养基，素琼脂
• 试剂仪器
Eppendorf管，移液器，水浴锅 振荡器，煤气灯等
实验步骤
• 稀释噬菌体原液 取0.1ml噬菌体原 液于0.9mlLB液体 培养基，得到10-1噬 菌体稀释液。依此类 推，稀释到10-7。
• 噬菌体与菌液混合: 取0.5ml大肠杆菌液 至50℃保温素琼脂培 养基中， 另取0.5ml 噬菌体稀释液混合。 做10-5，10-6，10-7 梯度。 。
• 手搓快速混合。
• 将已接种的上层培养基倒入底层培养基上 • 静置凝固后37℃培养24小时 • 观察噬菌斑并计数
实验结果
• 记录平板中每稀释浓度的PFU数于下表中： • 计算噬菌体效价
噬菌体稀释度 PFU数 10-2 10-3 10-4 10-5 对照
思考题
• 什么因素决定噬菌斑的大小？ • 测定噬菌体的效价，操作时要注意什么才能测定 准确？ • 计算噬菌体效价时，选择30～300个PFU的平板 计数较好，为什么？ • 在测定平板上出现其它细菌的菌落是否影响你的 效价测定？
实验 7 噬菌体效价的测定
实验目的
• 学习噬菌体效价测定的基本方法
实验原理
• 噬菌体的效价就是1ml培养液中所含活噬菌体的数量。 • 效价的测定方法一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特 异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑， 因此能进行噬菌体的计数。 • 噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100％（一般偏低， 因为有少数菌体可能未引起感染），所以为了准确地表达 病毒悬液的浓度（效价或滴度）一般不用病毒粒子的绝对 数量而是用噬菌斑形成单位（Plague-Formin
噬菌体效价
噬菌体的分离纯化及效价的测定
1 目的
1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理
噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规 微生物计数法无法测得其数量。当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出 大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变 清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。了解噬菌体的特性，快速 检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌 水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体 数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需 12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。 通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。根据正常发酵（培养） 液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养） 液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在 光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准 确。但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往 不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼 脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可 根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌 斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
双层平板法测定噬菌体效价的原理
双层平板法测定噬菌体效价的原理一、引言噬菌体是一种专门寄生于细菌体内的病毒，可以通过感染和杀死宿主细菌来控制细菌数量。
测定噬菌体效价是评估噬菌体活性和浓度的重要方法之一。
双层平板法是常用的测定噬菌体效价的方法之一，本文将详细介绍双层平板法测定噬菌体效价的原理。
二、仪器与试剂1. 噬菌体悬液：含有足够数量的噬菌体，用于感染宿主细胞。
2. 宿主细胞：适合噬菌体生长和复制的细胞。
3. 导管或微量移液器：用于移液。
4. 烧杯或容量瓶：用于配制琼脂。
5. 琼脂：用于制备双层平板。
6. 加热设备：用于消毒琼脂和灭活宿主细胞。
三、实验步骤1. 制备下层琼脂：将适量琼脂加入烧杯或容量瓶中，加入适量培养基，加热至完全溶解，然后冷却至约50℃。
2. 制备上层琼脂：将适量琼脂加入烧杯或容量瓶中，加入适量培养基和宿主细胞悬液，加热至完全溶解，然后冷却至约50℃。
3. 取下层琼脂约1-2mL放入试管中，倒置试管使琼脂均匀附着于试管壁。
4. 等待下层琼脂凝固。
5. 将上层琼脂与宿主细胞悬液混合均匀后取出适量液体（通常为0.1-0.2mL），加入噬菌体悬液中并混合均匀。
6. 取出一定数量的上述混合液滴到已经凝固的下层琼脂表面上，并轻轻晃动试管使混合液均匀分布于下层琼脂表面上。
7. 等待双层平板凝固并在恰当的条件下培养宿主细胞和噬菌体。
通常在37℃、5%CO2、湿度100%的条件下培养16-20小时。
8. 观察双层平板上的细胞和噬菌体生长情况，记录噬菌体效价。
四、原理1. 下层琼脂：下层琼脂是一种固态培养基，用于支撑和定位上层琼脂。
下层琼脂通常不含任何添加物，以便于观察宿主细胞和噬菌体的生长情况。
2. 上层琼脂：上层琼脂是一种含有宿主细胞悬液的固态培养基，用于感染噬菌体并观察其效应。
在上层琼脂中加入宿主细胞悬液可以提供足够数量的宿主细胞，并为噬菌体复制提供必要的条件。
3. 噬菌体悬液：噬菌体悬液中含有足够数量的噬菌体，可以感染并杀死宿主细胞。
实验十二 噬菌体效价的测定
4、将E. coli过夜菌摇匀，用吸管取菌液0.9ml分别加 入上面的10-4,10-5,10-6,10-7和对照试管中，摇匀；
5、将5管上层培养基溶化，分别标上10-4,10-5,106,10-7和对照，分别将4管混合液和对照管加入对应 的上层培养基试管中，每加入一管就要立即摇匀；
6、将摇匀的上层培养基迅速倒入相应的底层平板上， 放在台面上摇匀，使上层培养基布满平板，待平 板凝固后，置37℃培养过夜。
10-2
10-1
噬菌体原液
0.5ml 10-3 0.1ml
0.5ml 10-4
0.5ml 10-5 0.1ml 10-6
A
稀释噬菌体 试管中装4.5ml水
0.1ml
0.1ml
灭菌后待用
B 空EP管中加入： 大肠杆菌0.9ml
10-4
10-5
10-6
10-7
对照
噬菌体0.1ml 对照中换成0.1ml水 C 将全部混合液 （1ml）加入上层 培养基内
10-4
10-5
10-6
7
对照
D
倒板，37℃培养
E 观察并记数噬菌斑
噬菌体效价测定流程图
五 实验结果
1、观测平板中的噬菌斑,将每一个噬菌斑形成单位 (pfu),记录实验数据,并选取30-300个pfu数的平板 记数每ml未稀释的原液的噬菌体的效价. 噬菌体效价=pfu数×稀释倍数
2、实验数据
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌噬菌体原液，大肠杆菌；
2、培养基：上层培养基（5管/组），LB平板（5个/ 组）；
3、4.5mL无菌水（7管/组）；
4、EP管（5管/组）。
四、实验步骤
1、过夜培养物出现澄清，用无菌滤头过滤纯化获得噬 菌体滤液；
噬菌体效价的测定方法
噬菌体效价的测定方法噬菌体效价的测定方法1. 引言噬菌体效价的测定方法是研究噬菌体杀菌能力的重要手段。
本文将详细介绍几种常用的噬菌体效价测定方法。
2. 噬菌体效价测定方法斑点法斑点法是最常用的测定噬菌体效价的方法之一。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.在琼脂平板上均匀涂敷被测细菌悬浮液。
3.取一定体积的已知浓度的噬菌体溶液滴在已涂敷的平板上，静置一段时间。
4.观察液滴周围是否出现菌落溶解区，根据出现溶解区的数量和大小，推断噬菌体的效价。
流式细胞术法流式细胞术法是一种快速测定噬菌体效价的方法，适合大规模实验。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.将被测细菌悬浮液加入流式细胞仪中，通过光散射和荧光信号检测细菌的状态。
3.依据细菌的状态判断噬菌体的效价。
确定感染能力的法确定感染能力的法是一种精确测定噬菌体效价的方法，可以测定细菌在固定时间内被噬菌体感染的能力。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.将细菌与噬菌体溶液接触一定时间后，离心沉淀细菌。
3.通过对沉淀细菌进行计数或直接培养识别，确定细菌被感染的数量。
4.根据感染数量和噬菌体浓度计算噬菌体的效价。
3. 结论本文介绍了斑点法、流式细胞术法和确定感染能力的法三种常用的噬菌体效价测定方法。
这些方法各有优缺点，研究者可以根据实际需求选择合适的方法进行噬菌体效价的测定。
4. 斑点法的优点和缺点优点•斑点法操作简单，易于掌握。
•可以同时测定多个噬菌体效价，提高效率。
•结果直观，通过观察菌落溶解区可以准确判断噬菌体效价。
缺点•斑点法需要较长的时间来观察菌落溶解区的形成，耗时较长。
•结果的定量分析相对不准确，只能通过观察溶解区数量和大小来推测效价。
•受到环境因素的影响较大，如温度、湿度等。
5. 流式细胞术法的优点和缺点优点•流式细胞术法速度快，可对大量样本进行高通量分析。
•结果定量准确，可以精确地获得细菌的状态信息。
噬菌体裂解液的制备和菌种的保藏、噬菌体效价的测定、细菌转导测定、凝聚反应、沉淀反应
2.取0.5mL裂解液,37C预热10分钟
3.把上述S菌和裂解液混合均匀，37C预热10分钟
4.用牛液把混合液稀释至10-3及10-4
5.取10-3及10-4稀释度0.2mL涂布EMB平板,于37C培养至少48hr,观察结果
3、凝集反应
按图加抗原和抗体及对照，静置5~10min，先用肉眼观察，后用显微镜在低倍镜下观察。
2.按右图所示在皿底用记号笔画好标记。
3.接种无菌操作，取矢量培养活化的K12 S gal-菌一环，涂于S标记处；取适量活化的K12 F gal+菌液，划线接种于F标记处；取适量噬菌体裂解液，涂于λ标记处。
4.将接好的平板静置，所有菌液被培养皿吸收后再倒置，放37℃培养48~72h，观察结果。
（2）转导频率的测定
在光下观察，4个培养皿中均未发现深紫色带有金属光泽的菌落存在。
三、凝聚反应
右侧为对照组，滴加磷酸盐缓冲液（代替生理盐水）与E. coli，无明显反应。
左侧为实验组，滴加抗血清与E. coli，在室温下静置数分钟后形成肉眼可见的凝集块。
四、沉淀反应
两个载玻片菌没有观察到明显现象，没有白色沉淀线生成。
注：理想条件下，应出现如下图所示现象。
5）培养
待平板凝固后于37 ℃，培养12~16h；
根据噬菌斑数量计算噬菌体效价。
（因所测噬菌体裂解液中λdg不能形成噬菌斑，且其数量与λ数相等，故计算时乘2.）
2、细菌转导的测定
（1）点滴法
1.倒EMB平板取已灭菌的EMB培养基熔化并冷却至不烫手（约50℃），然后倒平板，冷却后翻转平板，温箱放置使表面干燥。
4、沉淀反应
将琼脂糖凝胶融化后滴加到干净的载玻片上，凝固后按下图位置打孔并在孔中滴加相应的抗原和抗体。
噬菌体效价的测定在菌苔上逐步形成的噬菌体群体由于其
（二）植物病毒
1、大多为 ssRNA 病毒。
2、基本形态为杆状、丝状、球状。
3、对宿主的专一性较差，如 TMV 等。 4、引起植物病害症状：破坏植物的叶绿体或叶绿素， 是植 物叶片发生黄化、红化或发生花叶；使植物 发生矮化、丛枝或畸形；形成枯斑或坏死。
5、增值中的侵入是被动方式。
6、已知植物病毒有 700 多种（ 1989 ）。
（三）人类和脊椎动物病毒
1、核酸类型很多， dsDNA ，ssDNA ，dsRNA ，
ssRNA 。
2、一般呈球状。 3、种类： 300+900 4、常见的人病毒 引起的疾病：感冒、肝炎、疱疹、 流行性乙型脑炎、狂犬病以及艾滋病等。动物疾病：
非溶源化，复愈后的细胞其免疫性也随之丧失；
还有其他特征，以后的章节将有陆续介绍。在自然界中各 种细菌、放线菌等都有溶源菌存在。
检验溶源菌的方法是将少量溶源菌与大量的敏感性指示菌（遇溶源 菌裂解后所释放的温和噬菌体会发生裂解性生活周期者）相混合，
然后与琼脂培养基混匀后倒一平板。过一段时间后溶源菌就长成菌 落。由于在溶源菌分裂过程中有极少数个体会发生自发裂解，其释 放的噬菌体可不断侵染溶源菌菌落周围的指示菌菌苔，所以会产生
复制，并平均分布到两个子代细胞中去，如此代代相传。
由此可见，温和噬菌体的存在形式有三种： ①游离态 ：指已成熟释放并有侵染性的游离噬菌体粒子； ②整合态 ：指整合在宿主核染色体上处于前噬菌体的状态 （一种潜伏的形式） ③营养态 ：指前噬菌体经外界理化因子诱导后，脱离宿主核 基因组而处于积极复制和装配的状态。
2.噬菌体效价的测定
在菌苔上逐步形成的噬菌体群体，由于其侵蚀宿主细胞的
噬菌体效价及转导实验
噬菌体效价测定及转导姓名学号：系别：生命科学学院生物科学专业班号：实验日期：4月26日、5月3日同组同学：实验目的1.学习噬菌体效价测定的方法2.了解转导原理、学习转导实验方法实验材料菌种：E. coli K12 F、E. coli K12S、噬菌体裂解液培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基、 EMB培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基实验原理1.噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。
效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。
由于含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑2.噬菌体的悬浮液是由双重溶源菌（内含一个λ及一个λdg两种噬菌体）裂解而来的，因此λ及λdg两种噬菌体是等量的。
3. λ噬菌体能够侵染大肠杆菌并能使其裂解，因此能够形成噬菌斑；λdg噬菌体能够侵染大肠杆菌但不能使其裂解，因此不能够形成噬菌斑4.噬菌体效价/噬菌体数/ml=每皿平均噬菌斑数*稀释倍数/0.5ml*2 （λdg不能够形成噬菌斑且其数量与λ相等，因此计算时乘以2）5. λdg是缺陷型噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因。
当λdg侵染S菌的时候，就能够使得S菌具有发酵半乳糖的能力，因此菌落也会显现出发酵半乳糖的特征（菌落有金属光泽）。
6.转导子数/ml=每皿平均转导子数*稀释倍数/0.1ml*2 （因为裂解液为0.5ml，所以要乘以2）；转导频率=转导子/ml./噬菌体效价*100%实验步骤一、噬菌体效价的测定1）熔化100mlEMB固体培养基、100ml牛肉膏蛋白胨固体培养基2将熔化的EMB培养基中加入6.5ml的0.1%的美蓝和2ml的2%的伊红3）用100ml熔化的EMB培养基倒六个平板。
编号EMB1-EMB64）用100ml熔化的牛肉膏蛋白胨固体培养基倒4个平板。
编号牛固1-牛固5）水浴加热5管素琼脂，溶解后置于50摄氏度下保温。
6）稀释裂解液：取0.5ml裂解液，加入到4.5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，稀释成了10^-1的稀释液，以此方法，再稀释到10^-2、10^-3、10^-4.并做好标记。
实验十二 噬菌体效价的测定
实验十二噬菌体效价的测定一、实验目的1、学习并掌握噬菌体效价的测定原理。
2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。
二、实验原理噬菌体属于细菌病毒，它不具备完整的细胞结构，只能通过寄主细胞完成自我复制。
因此人类只有通过电子显微镜才可观察到它们的形态结构。
但由于噬菌体侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞裂解死亡，并在琼脂培养基表面形成是菌斑，所以人们可以此来判断噬菌体的存在。
当烈性噬菌体侵染敏感细菌后,会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，结果就会在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的肉眼可见噬菌斑(plague)。
噬菌体的效价：１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
其测定常用双层琼脂平板法。
由此得到的噬菌斑形态、大小较一致且清晰度高，计算准确。
根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。
双层琼脂平板的配制：底层平板（1.5~2％琼脂的LB培养基10ml)，将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附，加入45°左右的半固体琼脂糖，迅速混匀铺平板作为上层。
计算公式：噬菌体效价(pfu/ml)=噬菌斑数×稀释倍数×10；（这里的10为换算单位，即实验中用到100μl噬菌体原液，换算成1000μl，即1ml时，要乘以10）三、操作步骤流程图流程步骤目的1、制备9套LB 固体培养基底层平板将融化并冷却至45℃左右的LB培养基倒入无菌培养皿，每皿约10~12ml.水平放置，凝固后做好稀释度标记。
1、提供细菌生长营养物质2、提供更加平整的平面2、制备噬菌体稀释液取0.5mL噬菌体原液于4.5mL无菌水中得到10-1稀释液。
再取0.5ml10-1稀释液于4.5ml缓冲液中得到10-2稀释液。
同理再制备10-3稀释液，并在试管上标记备用。
（稀释过程应充分混匀）通过连续稀释使单个噬菌体吸附一个大肠杆菌细胞。
3、制备受体菌细胞将感受态大肠杆菌接种于50ml LB培养液，经过夜培养，离心收集菌体细胞，悬浮于20ml10mM MgSO4中备用。
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实验十二噬菌体效价的测定
一、实验目的
1、学习并掌握噬菌体效价的测定原理。
2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。
二、实验原理
噬菌体属于细菌病毒，它不具备完整的细胞结构，只能通过寄主细胞完成自我复制。
因此人类只有通过电子显微镜才可观察到它们的形态结构。
但由于噬菌体侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞裂解死亡，并在琼脂培养基表面形成是菌斑，所以人们可以此来判断噬菌体的存在。
当烈性噬菌体侵染敏感细菌后,会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，结果就会在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的肉眼可见噬菌斑(plague)。
噬菌体的效价：１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
其测定常用双层琼脂平板法。
由此得到的噬菌斑形态、大小较一致且清晰度高，计算准确。
根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。
双层琼脂平板的配制：底层平板（1.5~2％琼脂的LB培养基10ml)，将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附，加入45°左右的半固体琼脂糖，迅速混匀铺平板作为上层。
计算公式：噬菌体效价(pfu/ml)=噬菌斑数×稀释倍数×10；（这里的10为换算单位，即实验中用到100μl噬菌体原液，换算成1000μl，即1ml时，要乘以10）
三、操作步骤
流程图
流程步骤目的
1、制备9套LB 固体培养基底层平板将融化并冷却至45℃左右的LB培养基倒入
无菌培养皿，每皿约10~12ml.水平放置，凝
固后做好稀释度标记。
1、提供细菌生长营养物质
2、提供更加平整的平面
2、制备噬菌体稀释液取0.5mL噬菌体原液于4.5mL无菌水中得到
10-1稀释液。
再取0.5ml10-1稀释液于4.5ml
缓冲液中得到10-2稀释液。
同理再制备10-3
稀释液，并在试管上标记备用。
（稀释过程应
充分混匀）
通过连续稀释使单个噬菌
体吸附一个大肠杆菌细
胞。
3、制备受体菌细胞将感受态大肠杆菌接种于50ml LB培养液，经
过夜培养，离心收集菌体细胞，悬浮于20ml
10mM MgSO4中备用。
由实验员制备。
4、吸附用取样器分别取100μl 10-1、10-2、10-3噬菌
体稀释液和100μl受体菌细胞液，充分混合
后置于37℃恒温箱保温25min.并在离心管上
做好标记。
——
5、制备上层平板用枪分别取350μL受体菌菌悬液和噬菌体稀
释液，加入到冷却至45℃左右的0.7%琼脂糖
中，迅速混匀，倒在有相应标记的底层平板，
边倒边摇匀。
防止琼脂糖凝固结块儿。
6、培养37℃倒置培养15~18h，检查结果。
——
四、结果讨论
噬菌体稀释度10-210-3
1 2 3 1 2 3
噬菌斑数（个）/皿176 149 177 16 20 17
平均数67 18
噬菌体效价（10-2）=67×10-2×10=6.7
噬菌体效价（10-3）=18×10-3×10=0.18
五、思考题
2、测定噬菌体效价的准确性应注意哪些操作？
答：噬菌体效价的准确性应注意以下几点：
1）实验操作为无菌操作，以免杂菌污染；
2）倒平板的时候要迅速，因为平板易凝，如果倒得太慢会使琼脂糖凝固不均匀；3）倒培养基时要稍冷却，以免水汽影响噬菌斑的计数。