实验十二 噬菌体效价的测定

实验十二噬菌体效价的测定

一、实验目的

1、学习并掌握噬菌体效价的测定原理。

2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。

二、实验原理

噬菌体属于细菌病毒，它不具备完整的细胞结构，只能通过寄主细胞完成自我复制。因此人类只有通过电子显微镜才可观察到它们的形态结构。但由于噬菌体侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞裂解死亡，并在琼脂培养基表面形成是菌斑，所以人们可以此来判断噬菌体的存在。

当烈性噬菌体侵染敏感细菌后,会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，结果就会在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的肉眼可见噬菌斑(plague)。

噬菌体的效价：１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。其测定常用双层琼脂平板法。由此得到的噬菌斑形态、大小较一致且清晰度高，计算准确。根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。

双层琼脂平板的配制：底层平板（1.5~2％琼脂的LB培养基10ml)，将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附，加入45°左右的半固体琼脂糖，迅速混匀铺平板作为上层。

计算公式：噬菌体效价(pfu/ml)=噬菌斑数×稀释倍数×10；（这里的10为换算单位，即实验中用到100μl噬菌体原液，换算成1000μl，即1ml时，要乘以10）

三、操作步骤

流程图

流程步骤目的

1、制备9套LB 固体培养基底层平板将融化并冷却至45℃左右的LB培养基倒入

无菌培养皿，每皿约10~12ml.水平放置，凝

固后做好稀释度标记。

1、提供细菌生长营养物质

2、提供更加平整的平面

2、制备噬菌体稀释液取0.5mL噬菌体原液于4.5mL无菌水中得到

10-1稀释液。再取0.5ml10-1稀释液于4.5ml

缓冲液中得到10-2稀释液。同理再制备10-3

稀释液，并在试管上标记备用。（稀释过程应

充分混匀）

通过连续稀释使单个噬菌

体吸附一个大肠杆菌细

胞。

3、制备受体菌细胞将感受态大肠杆菌接种于50ml LB培养液，经

过夜培养，离心收集菌体细胞，悬浮于20ml

10mM MgSO4中备用。

由实验员制备。

4、吸附用取样器分别取100μl 10-1、10-2、10-3噬菌

体稀释液和100μl受体菌细胞液，充分混合

后置于37℃恒温箱保温25min.并在离心管上

做好标记。

——

5、制备上层平板用枪分别取350μL受体菌菌悬液和噬菌体稀

释液，加入到冷却至45℃左右的0.7%琼脂糖

中，迅速混匀，倒在有相应标记的底层平板，

边倒边摇匀。

防止琼脂糖凝固结块儿。

6、培养37℃倒置培养15~18h，检查结果。——

四、结果讨论

噬菌体稀释度10-210-3

1 2 3 1 2 3

噬菌斑数（个）/皿176 149 177 16 20 17

平均数67 18

噬菌体效价（10-2）=67×10-2×10=6.7

噬菌体效价（10-3）=18×10-3×10=0.18

五、思考题

2、测定噬菌体效价的准确性应注意哪些操作？

答：噬菌体效价的准确性应注意以下几点：

1）实验操作为无菌操作，以免杂菌污染；

2）倒平板的时候要迅速，因为平板易凝，如果倒得太慢会使琼脂糖凝固不均匀；3）倒培养基时要稍冷却，以免水汽影响噬菌斑的计数。