免疫组织讲义化学染色sp技术
免疫组织化学染色SP技术课件
实验名称
链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法
(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)
检测胃癌组织CK／Vimentin的蛋白表达
武汉大学病理教研室
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
S-P法原理示意图
链酶亲和素 生物素化二抗
过氧化物酶 生物素
待测抗原
特异性一抗
武汉大学病理教研室
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免疫组织化学基本实验流程
组织、细胞标本
抗原修复
滴加二抗
滴加特异性一抗
阻断内源性过 氧化物酶
正常血清封闭
滴加三抗
显色
复染
封片 武汉大学病理教研室
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具体步骤如下： 1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 2．所有组织均采用微波修复抗原； 3．室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒 孵育 10min； 5．0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育 10min；
实验流程中的注意事项
内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间 检测及显色系统 复染
武汉大学病理教研室
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染色前处理 －取材、脱水、浸蜡
组织及时固定
固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛
常规下固定8-24小时 取材厚度：2mm
（迈新）；或60℃过夜
免疫组织化学染色技术PPT课件
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系 统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物 质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性 结合反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。
（ 2 ） 反 应 原 性 （ reactogenicity ） 指 抗 原 分 子 与 抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反 应的特性。
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2. 抗原的分类
免疫学分类
完全抗原、半抗原 胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物
等之间存在的共同抗原7
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞 合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白， 称为抗体。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特
异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠
制备的单克隆抗体。
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第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。
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尸检组织 由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同
免疫组化SP方法
免疫组化实验方法免疫组化步骤：1、取材：取实验组和对照组动物组织尽可能新鲜，PBS洗，取小于0.5cm×0.5cm×0.1cm组织块；2、固定和包埋：用4%多聚甲醛进行固定，经70%乙醇30分钟、80%乙醇30分钟、90%乙醇30分钟两次、95%乙醇30分钟两次、100%乙醇30分钟两次、二甲苯透明15分钟两次、55℃石蜡中1小时三次，用不锈钢模具包埋组织块；3、切片：将厚度5um的组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，60℃过夜；4、脱蜡、入水：将切片浸于二甲苯中5分钟两次、100%乙醇5分钟两次、95%乙醇5分钟两次、90%乙醇5分钟两次、85%乙醇5分钟次、70%乙醇5分钟两次，自来水冲洗，PBS洗两次；5、抗原修复:柠檬酸缓冲液，热修复20分钟， PBS洗3次×5分钟；6、3%双氧水,室温10分钟, PBS洗3次×5分钟；7、切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。
甩去多余液体，不洗；8、切片上滴加第一抗体，4℃过夜，PBS洗3次×5分钟；9、切片上滴加生物素化第二抗体（IgG），37℃20分钟，PBS洗3次×5分钟；10、切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃20分钟，PBS洗3次×5分钟；11、DAB显色：使用DAB显色试剂盒1ml蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴，混匀，加至标本上，显色6分钟，充分水洗；12、复染：苏木素1分钟，充分水洗，1%盐酸酒精分化，1%胺水反蓝，充分水洗；13、封片：经70%乙醇5分钟、80%乙醇5分钟、90%乙醇5分钟两次、95%乙醇5分钟两次、100%乙醇5分钟两次脱水、二甲苯透明5分钟两次、中性树脂封片；14、显微镜观察：选择实验组和对照组的阳性组织相、进行400×的显微照相。
15、图像分析：选择有意义的组织相，经登录、编号、采集、分析、读取数据、最后存盘。
免疫组化理论课 ppt课件
多抗和单抗的比较
均一性，单抗的均一性很强 稳定性，单抗的稳定性较差 特异性，单抗的特异性强 重复性，单抗的重复性好
医学资源
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主要有两大类： 1、多克隆抗体：为针对多个抗原决定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。 2、单克隆抗体：为一个B淋巴细胞分化增殖产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异
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加热处理后免疫组化的染色敏感度大幅 度地提高，其机理推测可能是加热打开 了组织抗原因福尔马林固定所引起的抗 原决定簇的交联，但机理目前仍然还不 是十分清楚。
医学资源
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医学资源
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医学资源
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4.抗原修复液的选择
加热抗原修复缓冲液有多种，如柠檬酸盐缓冲液 （pH6.0）, Tris (pH7-8) , EDTA(pH8.0)等, 目前 首选柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），优点是染色背 景清晰，适合于大多数抗体,Tris和 EDTA两种修 复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同 时加深，如使用不当易造成假阳性结果的判断。
医学资源
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1、微波修复
本实验室微波修复应用最多，特点是简单、有效， 主要根据微波发射高频能量，组织经微波幅射后， 会加速组织内部分子高速运动，抗原可完全被暴 露出来，用于浆或部分核抗原，膜抗原不用或短 时间应用。在 0.01M PH6.0 柠檬酸缓冲液 微波 修复时，温度控制在95-100℃之间维持10分钟， 不足或超过100℃达不到抗原修复最佳效果。
医学资源 20
胰蛋白酶，用于胞浆抗原，此酶较温和，浓
度 及 消 化 时 间 易 控 制 ， 常 用 0.05%~0.1%, PH7.8, 37℃消化20~30′ 或更长，微波37℃ 可短时消化。 胃蛋白酶，用于间质抗原，常用0.2% PH2.5 左右，消化 20~30′ 或更长，消化后切片应充 分洗涤，否则对组织中抗原会进行缓慢消化， 破坏组织结构
免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取岀来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发岀一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
免疫组织化学(SP)
免疫组织化学（SP）一、烤片：60℃，1h；二、脱蜡：二甲苯I、II、III各15min；三、水化：100%I、II酒精各10min，95%、90%、80%、70%梯度酒精各5min，再蒸馏水清洗1min；四、修复：将切片浸入0.01M 枸橼酸缓冲液，以微波炉最大火力（98-100℃）加热至沸腾，再将微波炉调至修复档加热约5min（塑料切片架），让后将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；五、灭活：SP试剂盒中的3%过氧化氢，在室温下灭活30min，PBS洗涤3次，每次5min；六、封闭：用山羊血清封闭（即A液），室温封闭30min，倾去多余血清，勿洗涤；七、一抗孵育：分别加入一抗（兔抗IL-6多克隆抗体，1:3000稀释）4℃过夜，第二天取出后室温孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min；八、二抗孵育：滴加SP试剂盒中的二抗（即B液），室温孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min；九、滴加SP试剂盒中的辣根标记工作液（即C液），室温孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min；十、DAB显色：配制DAB显色液（DAB浓缩液一滴+底物液1ml），滴加DAB后计时（约1min），保持染色时间一致，在显微镜下观察（即指标变色，背景不变），用蒸馏水终止反应；十一、核复染：苏木素染核5min，自来水漂洗4-5次，1%盐酸酒精分化数秒，自来水中反蓝20min，蒸馏水漂洗3次，每次5min；十二、脱水：梯度酒精70%、80%、90%、95%酒精各5min，100%I、100%II酒精各10min，37℃温箱烤干；十三、透明：二甲苯I、II、III各2min；注意：冰冻切片不需要烤片、脱蜡、水化；直接将切片固定：甲醇，3min，震荡；再清洗：蒸馏水，5min，3次，震荡；即可进行修复及之后的实验步骤。
免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来,以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体(第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合,形成抗原—一抗—二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的,因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）.通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分,在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物,从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量.组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术.它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光,从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物,生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原- 一抗- 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
免疫组织化学染色技术课件
组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。 注意 ：新鲜标本，尸检心肌不超过6小时。
二、光学显微镜下的组织学染色方法
• 常规HE染色（hematoxylin and eosin staining） • 组织学特殊染色
1. Mallory 三染色、Masson三染色 2. 神经纤维的镀银染色 3. 其他的特殊染色，包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素、 细胞DNA和RNA的染色等
取材标本的大小
尸检组织材料大小以1cm1cm 0.2cm 为宜。实验动物 常用大鼠或小鼠，其脏器体积小，有利于取材。一般标本体 积不宜过大，防止固定不透，影响抗原的保存，也浪费试剂。
2. 组织块的固定、水洗
（1）固定液：种类较多，常用的有以下2种：
4% 甲醛/PBS (pH 7. Nhomakorabea-7.4)
• 免疫组织化学染色的反应原理及显色原理
1. 免疫组织化学染色的反应原理 染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。
通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某 种发色剂或酶类，再通过激发发色剂或使用某种 显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部 位产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检测的抗 原是否存在。
目的：主要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥 样硬化大体标本的染色
试剂：苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ
结果：病变处脂肪组织呈橙黄色 早期心肌梗死染色法 目的：显示早期心肌梗死的区域 试剂：0.1% NBT(硝基四唑蓝) / 0.2 mol / L PBS
(pH 7.6) 方法：将2-3 mm 厚新鲜心肌大片放入试剂中，37 °C
IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。
（2）显色的基本程序 1抗孵育切片或细胞涂片 2抗（酶标抗体）
免疫组织化学染色 实验
一 目的
• 掌握免疫组织化学（S抗原与抗体特异性结合的原理，使用 试剂盒所提供的生物素化二抗与一抗特异 结合，然后加入辣根过氧化物酶标记的链 霉卵白素，底物被辣根过氧化物酶分解显 色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、 定性及定量的研究。
• DAB显色原理：过氧化物酶催化底物中的过氧化氢水解，释放出氧，使
DAB氧化为吩嗪多聚体，在光镜下为不溶于水的棕色颗粒。
• 10 蒸馏水终止反应，洗净DAB，晾干 • 11 脱水，透明，封片： • 80%，95%乙醇各1次，1分钟/次——100%乙醇2次，1分钟/次—— 二甲苯透明，2次，1分钟/次——中性树胶封片 • 注意设置阴性对照和阳性对照
三 器材与试剂
• 1 器材: 显微镜,染色缸, 镊子,吸水纸，湿盒. • 2 材料: 小鼠小肠冰冻切片 • 3 试剂: PBS，SP试剂盒，一抗，DAB试剂 盒， 乙醇，二甲苯，中性树胶
四 步骤
• • • 1 冰冻切片——冷丙酮4℃固定15分钟——干燥 2 PBS洗3次，3分钟/次 3 加1滴3%H2O2，室温10分钟（灭活内源性过氧化物酶）
五 结果
• β-actin，广泛分布于各种组织中，是肌肉细丝及 细胞骨架微丝的主要成分，具有收缩功能。定位 于细胞质内，为粗细一致的棕黄色颗粒，显色强 时为棕褐色。
•
• • •
4 PBS洗3次，3分钟/次
5 加1滴血清，室温10分钟（封闭组织中的电荷基团） 6 倾去血清，勿洗，加50ul一抗，37℃孵育40分钟-1小时（在湿盒中进行，避免组 织面干燥）
• 7 PBS洗3次，3分钟/次，加一滴二抗，37℃孵育10分钟 • 8 PBS洗3次，3分钟/次， 加1滴SP工作液，室温10分钟 • 9 PBS洗3次，3分钟/次，加DAB工作液，孵育1-2分钟（肉眼变色即可） • DAB工作液现配，为1ml蒸馏水加一滴A（缓冲液）, B（浓缩型DAB， 即二氨基联苯胺，是辣根过氧化物酶的显色底物）,C （浓缩的H2O2） 混匀，因DAB有潜在致癌作用，注意防护。
免疫组织化学染色 知识点
免疫组织化学染色知识点
【原创实用版】
目录
1.免疫组织化学染色的概念和原理
2.免疫组织化学染色的方法和步骤
3.免疫组织化学染色的应用和案例
4.免疫组织化学染色的发展趋势和前景
正文
一、免疫组织化学染色的概念和原理
免疫组织化学染色是一种通过抗原抗体反应的原理，检测组织切片中特定抗原的表达情况，并将其染色显示出来的技术。
这种技术广泛应用于疾病诊断、病情监测、疾病研究等领域。
二、免疫组织化学染色的方法和步骤
免疫组织化学染色的方法主要包括 LSAB 法和 SP 法。
这两种方法的步骤大致相似，主要包括切片处理、抗原修复、抗体孵育、复合物孵育、染色和核染色等。
1.切片处理：包括切片脱蜡至水、H2O2 甲醇处理切片、水洗等。
2.抗原修复：通过加热或化学方法，使组织切片中的抗原得到修复。
3.抗体孵育：将特异性抗体与组织切片孵育，使其与抗原结合。
4.复合物孵育：加入特异性的二抗，与一抗结合形成免疫复合物。
5.染色：加入染色剂，如 DAB-H2O2，使免疫复合物呈现颜色。
6.核染色：用苏木素等染料染色，使细胞核呈现颜色。
三、免疫组织化学染色的应用和案例
免疫组织化学染色在临床诊断、疾病研究、肿瘤生物学等领域有着广泛的应用。
例如，通过免疫组织化学染色可以检测肿瘤组织中的癌基因、肿瘤标志物等，帮助医生诊断病情、制定治疗方案。
四、免疫组织化学染色的发展趋势和前景
随着科学技术的发展，免疫组织化学染色技术也在不断发展和完善。
Ge免疫组织化学染色技术
Mallory三色染色法：染料试剂：苯胺蓝、橘黄G、酸性复红、重铬酸钾、磷钨酸、醋酸免疫组织化学的要紧染色方式第一篇概述免疫组织化学染色法：免疫组织化学染色法是指在抗体上结合萤光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反映，检测细胞或组织中是不是有目标抗原的存在，此方式不只能够用来测知抗原的表现量也可观看抗原所表现的位置。
只若是能够让抗体结合的物质，也确实是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测。
染色注意事项：一、直接法二、间接法三、未标记抗体法抗体和酶、荧光素结合后，或多或少的降低了抗体与抗原的结合能力。
有酶桥法和PAP法，但前者短处较多。
PAP法（Peroxidase Antiperoxidase. PAP)PAP复合物（二分子抗体，三分子酶），体积小，稳固，穿透性好特点：较间接法灵敏20~100倍，较前几种方式非特异性染色轻。
四、ABC 法（Avidin-Biotin-Complex Method）Avidin——卵白素，有四个亚单位，每一个亚单位有138个氨基酸，分子两68kD。
一个卵白素分子能与4个分子的生物素结合，大体上不可逆，比抗原抗体结合力大1000000倍，只有在的条件下才能将其分离。
Biotin——生物素，一分子的抗体可结合150个生物素分子，和多种酶结合后，不阻碍催化活性。
四、LAB法（ Labeled Avidin-Biotin）特点：1.灵敏性较PAP法提高20~40倍；2.非特异性染色几乎没有；3.可用于IHC，核酸杂交等五、免疫组织化学染色方式的选择原那么五个“S”原那么特异性间叶组织，上皮组织恶性肿瘤，多克隆抗角蛋白抗体，特异性广鳞状上皮或腺上皮，单克隆抗角蛋白抗体，特异性高；灵敏性灵敏性高，特异性下降，假阳性增加；灵敏性低，特异性高，假阴性增加；简便性选用方式愈简便愈好；平安性(time and money)第二篇：免疫组织化学要紧方式举例步骤取材：要紧来源于活检标本、手术切除标本及尸身解剖标本。
免疫组织化学染色技术SP三步法与PV二步法比较探讨
６ ０ ０ ０ ） 二 步法 检测 ｓ ０ｘ 蛋 白表 达 情 况 ， 染 色 程 序 严 格 按 试 剂 说 明 书进 行 ， 该法具有简便 、 敏 感 性 高 等 优 点 。具 体 步 骤 如下 ： ①石蜡切片脱蜡 至水 ， 顺 序如 下 ： 连续切 片 ４ ｍ厚 ， 贴 于涂 有 ０ ． ０ ５ 多 聚 赖 氨 酸 的 载玻 片上 ， 烘片 ２ ｈ备 用 ； 烤
１ ． １ 材料 ： 收集 山西 煤 炭 中 心 医 院 和太 原 市 人 民 医 院 ２ ０ ０ ８ 年 １月 至 ２ ０ １ ２年 １ ２ 月外科手术切 除乳腺癌组 织 ７ ８份 ， 片
厚 ４“ ｍ。
切 片加 １ ５ ０“ Ｌ链 霉 菌抗 生物 素 一 过 氧 化 酶 溶 液 （ 试 剂 Ｄ） ，
室温 下 孵 育 １ ０ ｍｉ ｎ ， Ｐ Ｂ Ｓ冲洗 ３ 次， 每次 ３ ａｉ ｒ ｎ ； ⑦ 除去 Ｐ Ｂ Ｓ
１ ． ２ 试剂 ： 兔 抗人 Ｓ Ｏ Ｘ 多 克 隆抗 体 、 （ Ｐ Ｖ － ６ ０ ０ ０ 一 Ｇ） 二 步 法
免疫组织化学检测试剂盒 、 三步法 Ｓ Ｐ超 敏 试 剂 盒 和 二 氨 基 联苯胺（ ＤＡ Ｂ ） 试 剂 盒 均 购 于 北 京 中杉 金 桥 生 物 技 术 有 限 公 司 。选 用 已知 阳性 的 正 常 乳 腺 组 织 为 阳 性 对 照 ， 磷 酸 盐 缓 冲液 （ Ｐ Ｂ Ｓ ） 代 替 一 抗 作 为 阴性 对 照 。 １ ． ３ 实验方法 ： （ １ ） 常 规 石 蜡 切 片 苏 木 素一 伊红（ ＨＥ） 染色 ， 核实病 理组 织 学 诊断 。（ ２ ） 应 用 免疫 组 织化 学 方 法 （ Ｐ ｖ＿
液， 每张切片加 ６ ０ ０ Ｌ 的新 鲜 配 制 的 ＤＡ Ｂ， 显 微 镜 下 观 察 ３ ～１ ０ ａｉ ｒ ｎ ； ③ 自来 水 冲 洗 ， 苏木 素复染 ， 自来 水 冲 洗 返 蓝 或
免疫组化sp法
免疫组化SP法引言免疫组化(SP)法是一种常用的免疫组织化学染色技术，用于检测细胞和组织中蛋白质的表达情况。
相较于传统的免疫组化方法，SP法的敏感性和特异性更高，能够提供更准确的结果。
本文将介绍免疫组化SP法的原理、步骤和应用，并提供一些实验技巧和注意事项。
原理免疫组化SP法结合了辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）的酶标系统。
HRP可以催化有机物质与底物间的氧化还原反应，生成可见光。
而AP则能够催化磷酸酯与底物间的酸碱中和反应，生成二级离子，进而酶促反应。
SP法利用这两个酶的双重酶标效应，使得染色结果更明显，背景噪音更低。
实验步骤免疫组化SP法通常包括以下步骤：1.取得标本：首先需要准备待检测的组织样本或细胞制片。
可以选择固定、冻存或石蜡包埋样本。
2.制备切片：将组织样本切割成适当的厚度，一般为4-5μm。
使用玻璃片或载玻片使切片固定在切片架上。
3.脱脂去蜡：将切片在温水中浸泡片刻，去除石蜡并暴露组织。
4.抗原修复：根据需要，在组织上施加适当的抗原修复方法，以恢复由于石蜡包埋而导致的抗原损失。
5.抗体孵育：将适当的一抗或多抗添加到切片上，使其与目标蛋白结合。
根据需要，可以在抗体孵育前进行非特异性蛋白质封闭，以防止非特异性结合。
6.一抗信号放大：使用HRP标记的二抗与前一步骤结合的抗体结合。
在此步骤中，HRP将抗原邻近的HRP底物转化为可见的颜色。
7.二抗信号放大：使用AP标记的二抗与前一步骤结合的一抗结合。
AP 酶可将AP底物转化为色素，产生二级离子，使染色结果更明显。
8.染色：在适当的时间和温度条件下，在样本上施加适当的染色试剂，使目标蛋白在显微镜下呈现出想要的颜色。
9.倒置显微镜：使用倒置显微镜观察染色结果，根据需要进行图像拍摄记录。
实验技巧在进行免疫组化SP法实验的过程中，有一些技巧可以帮助提高实验效果：1.样本处理：对样本进行适当的抗原修复和封闭，以免出现非特异反应。
2.抗体选择：选择与目标蛋白有高度亲和力的特异性抗体，以提高染色的准确性。
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实验操作中的应用
抗原修复 Байду номын сангаас验操作中的注意事项
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抗原修复
影响染色结果的最关键因素 抗原修复方法分类
1）酶消化法 2）加热法（高压法›水煮法›微波法）
抗原修复液的选择
1）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.2-7.4） 2）Tris（PH 7-8） 3） EDTA（PH 8.0）
免疫组织化学染色sp技术
免疫组织化学的应用
IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞 间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的 正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理， 广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的 检测，细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表 型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞 周期和信号转导的研究等。
复染
原则：注意两者之间对比，突出阳性信号
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实验对照设计
原则：所有检测指标均设阳性对照、阴性对照
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结果分析
1.特定的定位
胞膜型、胞浆型、全浆型或胞核型，局限性或弥 散性。
2.染色的不均一性
阳性切片的染色应分布不均，片状或点状散在分 布；染色强弱也不等，颜色深浅反映抗原量的多 少。
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一抗孵育时间及抗体选择
应选择信誉高、质量好的试剂公司 抗体切忌反复冻融 一抗为浓缩液时，需选择最佳稀释浓度 按说明书可采用 37℃ 1-2 小时或 4℃ 冰箱过夜
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检测及显色系统
一般采用以生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的
检测方法。如SP、LSABC、ABC等
染色前处理 －包埋与切片
包埋：选择低熔点石蜡，温度不超过62℃ 切片：厚度 3-4μm 烤片：温度60℃，时间1小时；或60℃2小时
（迈新）；或60℃过夜
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染色前处理 －切片保存
切片不宜长时间在常温下保存
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染色前处理 －脱腊
原则：免疫组化的脱蜡试剂应与常规HE 脱蜡分开
显色方法：经常采用辣根过氧化物酶系统检测
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显色系统
常用的酶 1.辣根过氧化物酶(HRP) A:显色底物DAB-----棕黄色 敏感度高、定位清晰、易于观察、保存 B:显色底物AEC-----砖红色 2.碱性磷酸酶(AP) 显色底物:BCIP/NBT----蓝紫色
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染色前处理 －取材、脱水、浸蜡
组织及时固定
固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛
常规下固定8-24小时 取材厚度：2mm
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染色前处理 －预防脱片
常选用多聚耐氨酸（poly-L-lysine） 注意：1）应严格控制使用次数 2）玻片洁净度
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感谢聆听！
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7．甩去多余血清，分别滴加２种抗体，4℃湿盒孵 育 过夜，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；
8．滴加生物素标记的二抗（试剂C），37℃湿盒 孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；
9．滴加链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂D）， 37℃湿盒孵育 15min，甩去多余液体；
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实验名称
链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法
(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)
检测胃癌组织CK／Vimentin的蛋白表达
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S-P法原理示意图
链酶亲和素 生物素化二抗
过氧化物酶 生物素
待测抗原
特异性一抗
10．每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（DAB）显 色液，光镜下控制反应时间（约为1-5min），自来 水充分冲洗，苏木素复染；
11．常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析；
12．阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采 用PBS取代第一抗体，其余步骤相同。
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实验流程中的注意事项
内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间 检测及显色系统 复染
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免疫组织化学基本实验流程
组织、细胞标本
抗原修复
滴加二抗
滴加特异性一抗
阻断内源性过 氧化物酶
正常血清封闭
滴加三抗
显色
复染
封片 武汉大学病理教研室
具体步骤如下： 1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 2．所有组织均采用微波修复抗原； 3．室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒 孵育 10min； 5．0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育 10min；
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内源性过氧化物酶的灭活
存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、 单核细胞、肝细胞及肾细胞
消除方法：3% H2O2 浸泡10分钟
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血清封闭
目的：减少非特异性着色 时间：一般在加载一抗之前使用
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冲洗
一般采用PBS（PH 7.4-7.6）充分冲洗 增加效果 可加入Tween20