免疫组织讲义化学染色sp技术
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武汉大学病理教研室
感谢聆听！
显色方法：经常采用辣根过氧化物酶系统检测
武汉大学病理教研室
显色系统
常用的酶 1.辣根过氧化物酶(HRP) A:显色底物DAB-----棕黄色 敏感度高、定位清晰、易于观察、保存 B:显色底物AEC-----砖红色 2.碱性磷酸酶(AP) 显色底物:BCIP/NBT----蓝紫色
武汉大学病理教研室
武汉大学病理教研室
7．甩去多余血清，分别滴加２种抗体，4℃湿盒孵 育 过夜，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；
8．滴加生物素标记的二抗（试剂C），37℃湿盒 孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；
9．滴加链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂D）， 37℃湿盒孵育 15min，甩去多余液体；
武汉大学病理教研室
染色前处理 －取材、脱水、浸蜡
组织及时固定
固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛
常规下固定8-24小时 取材厚度：2mm
武汉大学病理教研室
染色前处理 －预防脱片
常选用多聚耐氨酸（poly-L-lysine） 注意：1）应严格控制使用次数 2）玻片洁净度
武汉大学病理教研室
武汉大学病理教研室
一抗孵育时间及抗体选择
应选择信誉高、质量好的试剂公司 抗体切忌反复冻融 一抗为浓缩液时，需选择最佳稀释浓度 按说明书可采用 37℃ 1-2 小时或 4℃ 冰箱过夜
武汉大学病理教研室
检测及显色系统
一般采用以生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的
检测方法。如SP、LSABC、ABC等
武汉大学病理教研室
实验名称
链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法
(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)
检测胃癌组织CK／Vimentin的蛋白表达
武汉大学病理教研室
S-P法原理示意图
链酶亲和素 生物素化二抗
过氧化物酶 生物素
待测抗原
特异性一抗
染色前处理 －包埋与切片
包埋：选择低熔点石蜡，温度不超过62℃ 切片：厚度 3-4μm 烤片：温度60℃，时间1小时；或60℃2小时
（迈新）；或60℃过夜
武汉大学病理教研室
染色前处理 －切片保存
切片不宜长时间在常温下保存
武汉大学病理教研室
染色前处理 －脱腊
原则：免疫组化的脱蜡试剂应与常规HE 脱蜡分开
免疫组织化学染色sp技术
免疫组织化学的应用
IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞 间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的 正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理， 广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的 检测，细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表 型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞 周期和信号转导的研究等。
复染
原则：注意两者之间对比，突出阳性信号
武汉大学病理教研室
实验对照设计
原则：所有检测指标均设阳性对照、阴性对照
武汉大学病理教研室
结果分析
1.特定的定位
胞膜型、胞浆型、全浆型或胞核型，局限性或弥 散性。
2.染色的不均一性
阳性切片的染色应分布不均，片状或点状散在分 布；染色强弱也不等，颜色深浅反映抗原量的多 少。
武汉大学病理教研室
实验操作中的应用
抗原修复 实验操作中的注意事项
武汉大学病理教研室
抗原修复
Fra Baidu bibliotek响染色结果的最关键因素 抗原修复方法分类
1）酶消化法 2）加热法（高压法›水煮法›微波法）
抗原修复液的选择
1）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.2-7.4） 2）Tris（PH 7-8） 3） EDTA（PH 8.0）
武汉大学病理教研室
免疫组织化学基本实验流程
组织、细胞标本
抗原修复
滴加二抗
滴加特异性一抗
阻断内源性过 氧化物酶
正常血清封闭
滴加三抗
显色
复染
封片 武汉大学病理教研室
具体步骤如下： 1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 2．所有组织均采用微波修复抗原； 3．室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒 孵育 10min； 5．0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育 10min；
10．每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（DAB）显 色液，光镜下控制反应时间（约为1-5min），自来 水充分冲洗，苏木素复染；
11．常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析；
12．阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采 用PBS取代第一抗体，其余步骤相同。
武汉大学病理教研室
实验流程中的注意事项
内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间 检测及显色系统 复染
武汉大学病理教研室
内源性过氧化物酶的灭活
存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、 单核细胞、肝细胞及肾细胞
消除方法：3% H2O2 浸泡10分钟
武汉大学病理教研室
血清封闭
目的：减少非特异性着色 时间：一般在加载一抗之前使用
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冲洗
一般采用PBS（PH 7.4-7.6）充分冲洗 增加效果 可加入Tween20
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显色方法：经常采用辣根过氧化物酶系统检测
武汉大学病理教研室
显色系统
常用的酶 1.辣根过氧化物酶(HRP) A:显色底物DAB-----棕黄色 敏感度高、定位清晰、易于观察、保存 B:显色底物AEC-----砖红色 2.碱性磷酸酶(AP) 显色底物:BCIP/NBT----蓝紫色
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武汉大学病理教研室
7．甩去多余血清，分别滴加２种抗体，4℃湿盒孵 育 过夜，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；
8．滴加生物素标记的二抗（试剂C），37℃湿盒 孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；
9．滴加链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂D）， 37℃湿盒孵育 15min，甩去多余液体；
武汉大学病理教研室
染色前处理 －取材、脱水、浸蜡
组织及时固定
固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛
常规下固定8-24小时 取材厚度：2mm
武汉大学病理教研室
染色前处理 －预防脱片
常选用多聚耐氨酸（poly-L-lysine） 注意：1）应严格控制使用次数 2）玻片洁净度
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武汉大学病理教研室
一抗孵育时间及抗体选择
应选择信誉高、质量好的试剂公司 抗体切忌反复冻融 一抗为浓缩液时，需选择最佳稀释浓度 按说明书可采用 37℃ 1-2 小时或 4℃ 冰箱过夜
武汉大学病理教研室
检测及显色系统
一般采用以生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的
检测方法。如SP、LSABC、ABC等
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实验名称
链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法
(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)
检测胃癌组织CK／Vimentin的蛋白表达
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S-P法原理示意图
链酶亲和素 生物素化二抗
过氧化物酶 生物素
待测抗原
特异性一抗
染色前处理 －包埋与切片
包埋：选择低熔点石蜡，温度不超过62℃ 切片：厚度 3-4μm 烤片：温度60℃，时间1小时；或60℃2小时
（迈新）；或60℃过夜
武汉大学病理教研室
染色前处理 －切片保存
切片不宜长时间在常温下保存
武汉大学病理教研室
染色前处理 －脱腊
原则：免疫组化的脱蜡试剂应与常规HE 脱蜡分开
免疫组织化学染色sp技术
免疫组织化学的应用
IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞 间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的 正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理， 广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的 检测，细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表 型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞 周期和信号转导的研究等。
复染
原则：注意两者之间对比，突出阳性信号
武汉大学病理教研室
实验对照设计
原则：所有检测指标均设阳性对照、阴性对照
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结果分析
1.特定的定位
胞膜型、胞浆型、全浆型或胞核型，局限性或弥 散性。
2.染色的不均一性
阳性切片的染色应分布不均，片状或点状散在分 布；染色强弱也不等，颜色深浅反映抗原量的多 少。
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实验操作中的应用
抗原修复 实验操作中的注意事项
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抗原修复
Fra Baidu bibliotek响染色结果的最关键因素 抗原修复方法分类
1）酶消化法 2）加热法（高压法›水煮法›微波法）
抗原修复液的选择
1）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.2-7.4） 2）Tris（PH 7-8） 3） EDTA（PH 8.0）
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免疫组织化学基本实验流程
组织、细胞标本
抗原修复
滴加二抗
滴加特异性一抗
阻断内源性过 氧化物酶
正常血清封闭
滴加三抗
显色
复染
封片 武汉大学病理教研室
具体步骤如下： 1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 2．所有组织均采用微波修复抗原； 3．室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒 孵育 10min； 5．0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育 10min；
10．每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（DAB）显 色液，光镜下控制反应时间（约为1-5min），自来 水充分冲洗，苏木素复染；
11．常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析；
12．阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采 用PBS取代第一抗体，其余步骤相同。
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实验流程中的注意事项
内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间 检测及显色系统 复染
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内源性过氧化物酶的灭活
存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、 单核细胞、肝细胞及肾细胞
消除方法：3% H2O2 浸泡10分钟
武汉大学病理教研室
血清封闭
目的：减少非特异性着色 时间：一般在加载一抗之前使用
武汉大学病理教研室
冲洗
一般采用PBS（PH 7.4-7.6）充分冲洗 增加效果 可加入Tween20