马流感病毒血凝素基因甲病毒复制子重组表达质粒的构建及其免疫效力评价
流感病毒受体结合表位真核载体的构建及表达 (1)
论著流感病毒受体结合表位真核载体的构建及表达罗俊1,王欢1,戴军1,左斌1,裴德翠1,丰峰1,李婉宜1,邝玉1,王保宁1,蒋忠华1,李虹2,李明远1*(1.四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室,四川成都610041;2.四川大学华西第二医院港大联合研究中心) 摘要 目的 构建甲型流感病毒血凝素(H A )信号肽(SP)与HA 唾液酸受体结合部位(RB)所含T 、B 表位的基因片段(RBT 、R BB)真核表达质粒,研究其在真核细胞中的表达与免疫特性。
方法 通过重叠延伸PCR 法(o ver lap PCR)将HA 的SP 分别与R B 、RBT 、RBB 通过一段多肽接头Gly4Ser 融合为SP RB 、SP RBT 和SP R BT ,将其分别插入pcD N A 3.1(+)载体,构建质粒,鉴定正确后转染M DCK 细胞,RT PCR 、免疫荧光、M T T 检测该质粒的表达和分泌。
结果 融合基因真核表达质粒构建成功,在M DCK 细胞中成功表达,转染细胞培养上清能刺激淋巴细胞增殖。
结论 SP RB 、SP RBT 、SP RBB 真核表达载体成功构建,表达产物能刺激淋巴细胞增值,为流感病毒唾液酸受体结合部位的T 、B 细胞表位免苗研究提供初步依据,也为流感核酸疫苗的研制奠定了基础。
关键词 流感病毒;T 细胞表位;B 细胞表位;免疫荧光技术;淋巴细胞增殖试验中图分类号 R373.13 文献标识码 A 文章编号 1673 5234(2011)01 0008 4[J our nal of Pathogen B iology .2011Jan;6(1):8-11.]C onstruction of eukaryotic expression plasmid for receptor binding of influenza virus and their expression LU O Jun 1,WANG H uan 1,DAI Jun 1,ZU O Bin 1,PEI Dei cui 1,FENG Feng 1,LI Wan yi,KU ANG Yu 1,WANG Bao ning 1,JIANG Zhong hua 1,LI H ong 2,LI M ing yuan 1 (1.D ep ar tment of M icrobiology ,West China School of Pr eclinical and For ens ic M edicine,Sichuan Univ er sity ,Chengdu 610041,China;2.T he J oint R esearch Center of W es t China Seco nd Univ er s ity H os p ital of S ichuan Univ er sity and the Faculty of M edicine,Univer sity of H ong K ong )Abstract Objective T o const ruct eukary otic ex pression vector s fo r the signal pept ide (SP )of hemagg lutinin (HA )o f influenza A vir us and its acylneuraminate recepto r binding (RB)sites incor po rating gene segments o f T and B epitopes (RBT and RBB,respectively)and to observe the expressio n o f t arg et pr otein by and immunolog ical characterist ics o f eu kar yot ic cells. M ethods A polypept ide linker Gly4Ser w as used to splice SP w ith RB,RBT ,and RBB by ov erlap P CR to r espectively construct SP RB,SP RBT ,and SP RBT fusio n g enes.T hese g enes w ere inserted into eukar yo tic expres sio n plasmids pcD NA 3.1(+).A fter identification,pcDN A3.1(+)/SP R B,pcDN A3.1(+)/SP RBT ,and pcDN A 3.1(+)/SP R BB wer e tr ansfected into M D CK cells.T he ex pr essio n o f these g enes was analy zed w ith RT P CR,immunoflu o rescence assay ,and lym phocyt e pr oliferation test with M T T . Results pcDN A 3.1(+)ex pr essio n vector s incor po ra ting SP RB,SP RBT ,and SP RBT fusion genes wer e successfully constr ucted.T he fusion pro tein w as detect ed in M DCK transfected with pcDN A 3.1(+)/SP RB,pcDN A 3.1(+)/SP RBT ,or pcD NA 3.1(+)/SP RBB and st imulated lym phocyte pro liferatio n. C onclusion Eukar yo tic ex pr essio n plasmids fo r SP RB,SP RBT and SP RBT fusion genes wer e successfully constructed and t he ex pression pro ducts stimulated lympho cyte pro liferatio n,establishing a solid foundation for fur ther study of receptor binding,immuno lo gical study o f T and B cell epitopes o f influenza v ir us,and study of DN A vaccines.Key words Influenza virus;T cell epito pe;B cell epitope;immunofluo rescence assay ;lymphocyte pro liferatio n test流感病毒的高度变异性常导致流感的流行,因此如何获得高效及安全的流感疫苗是科学工作者关注的课题。
甲乙流感病毒实验室风险评估
甲型/乙型流感病毒实验室活动风险评估报告一、生物学特征（一）种类和分型流行性感冒病毒（influenza virus），是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的代表种，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒（流感）的病原体。
其中甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。
例如1918～1919年的大流行中，全世界至少有2000万～4000万人死于流感；乙型流感病毒对人类致病性也比较强，但是人们还没有发现乙型流感病毒引起过世界性大流行；丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。
甲型流感病毒于1933年分离成功，乙型流感病毒于1940年获得，丙型流感病毒直到1949年才成功分离。
流感分类根据流感病毒感染的对象，可以将病毒分为人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒以及禽流感病毒等类群，其中人类流感病毒根据其核蛋白的抗原性可以分为三类:甲型流感病毒（Influenza A virus），又称A型流感病毒乙型流感病毒（Influenza B virus），又称B型流感病毒丙型流感病毒（Influenza C virus），又称C型流感病毒感染鸟类、猪等其他动物的流感病毒，其核蛋白的抗原性与人甲型流感病毒相同，但是由于甲型、乙型和丙型流感病毒的分类只是针对人流感病毒的，因此通常不将禽流感病毒等非人类宿主的流感病毒称作甲型流感病毒。
在核蛋白抗原性的基础上，流感病毒还根据血凝素HA和神经氨酸酶NA的抗原性分为不同的亚型。
（二）形态结构流感病毒呈球形，新分离的毒株则多呈丝状，其直径在80至120纳米之间，丝状流感病毒的长度可达4000纳米。
流感病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。
病毒的核心包含了存贮病毒信息的遗传物质以及复制这些信息必须的酶。
流感病毒的遗传物质是单股负链RNA，简写为ss-RNA，ss-RNA与核蛋白 (NP)相结合，缠绕成核糖核蛋白体 (RNP)，以密度极高的形式存在。
甲型流感病毒 M1、M2和 M42蛋白研究进展
甲型流感病毒 M1、M2和 M42蛋白研究进展谭伟;谢芝勋【摘要】Influenza virus genome consists of eight segmented genes .From the beginning ,researchers gen‐erally accepted that each gene of influenza virus only encodes one viral protein .Later on ,scientists found that influenza virus M gene encoded M 1 matrix protein and M 2 ion‐channel protein ,w hereas NS gene en‐coded nonstructural proteins NS1 andNS2 ,respectively .It was recently discovered that PB1 gene encoded proteins PB1 ,PB1‐F2 and PB1‐N40 , w hereas PA gene encoded pr oteins PA ,PA‐X ,PA‐N155 and PA‐N182 .To date ,four influenza virus genes has been shown to be able to encode two or more viral proteins , demonstrating that influenza virus can employ in cells mRNA alternative splicing and various protein trans‐lation mec hanisms to expand its genome coding capacity .In 2012 ,Wise et al .found that influenza virus M gene could encode a novel viral protein ,M42 .This article will provide a brief overview of research on pro‐teins M1 ,M2 and M42 encoded by influenza virus M gene .%甲型流感病毒基因组由8个分节段的基因组成，最初认为流感病毒的每个基因只能编码一个病毒蛋白，但随后发现M基因编码两种蛋白，即M 1基质蛋白和M 2离子通道蛋白。
流感病毒基础的知识
流感的危害流行性感冒简称流感，是由流行性感冒病毒引起的呼吸道疾病，具有传染性强、流行面广、潜伏期短、发病率高等特点，在儿童、老人及高危人群中的死亡率很高。
有数据表明，每年冬季流感爆发期会使全球人口近10％感染致病。
流感病毒简介流行性感冒病毒（influenza virus）简称流感病毒，是引起流行性感冒（流感）的病原体，属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）。
(是与粘液蛋白有特殊亲和性病毒中的1科)粘病毒是指对人或某些动物红细胞表面的黏蛋白有亲和力的病毒。
正、副粘病毒的区分以其核酸是否分节段为标准，分节段者为正粘病毒，不分节段者为副粘病毒，正粘病毒科只有流感病毒一个种。
（一）形态与结构流感病毒具有多形态，一般为球形，也有的呈丝状或杆状，病毒直径为80-120nm。
流感病毒的结构主要包括内部的核心、衣壳（核衣壳）和外面的包膜（附图）。
Fig. (1) Schematic representation of the influenza A virus (Reference [22])1、核心（core）流感病毒的核酸为分节段、负链单股RNA，称为分节段基因组（segmented genome）。
其中甲型和乙型流感病毒的核酸分为8个节段，而丙型流感病毒的分为7个节段。
每一基因节段分别编码不同的蛋白，决定流感病毒的遗传特性。
第1~6基因节段分别编码RNA多聚酶（RNA polymerase）PB2、PB1、PA、血凝素（hemagglutinin，HA）、核蛋白（nucleoprotein, NP）、神经氨酸酶（neuraminidase, NA）；第7基因节段编码包膜蛋白，包括内膜基质蛋白（M1）和膜蛋白（M2）；第8节段编码非结构蛋白（nonstructural protein, NS）NS1和NS2。
流感病毒各基因节段复制后，组装入子代病毒体中，但在组装过程中极易发生基因重组而导致新病毒株的出现，这是流感病毒容易发生变异而出现大流行的主要原因。
流行性感冒病毒感染
2．流感肺炎型
➢患者高热持续不退，迅速出现呼吸困难、发 绀、剧咳、有少量泡沫痰或泡沫黏液痰、或 痰中带血。 胸片见肺部双侧呈散在性絮状阴影， 由肺门向四周扩散。
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3．胃肠型
患者多为儿童，以恶心、呕吐、腹泻、 腹痛为主要症状，一般2～3d即可恢复。
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4．脑膜脑炎型
极少见。病毒侵入神经系统，引起病毒 性脑炎的表现，如高热、昏迷，谵妄，抽 搐等，并出现脑膜刺激征，脑脊液细胞数 可轻度增加。
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甲型流感病毒
甲型流感病毒大多呈球形，直径80～120nm，有囊 膜。基因组为单股负链RNA，在丙烯酰胺-琼脂糖-
尿素凝胶上电泳可得到8个基因片断。
依其外膜血凝素（H）和神 经氨酸酶（N）蛋白的抗原 性，目前可分为16个H亚型 （ H1 ～ H16 ） 和 9 个 N 亚 型 （N1～N9）。
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HA及NA的各自变异不断组合成新的变异株，足 够大的变异使人群中对原有流行株所建立的免疫 屏障不再能发挥有效的保护作用。 当人群充分易感时，变异株的攻击就引起疫情暴 发，这是导致流感大流行反复发生的重要原因。 显著的变异主要发生于甲型流感病毒，乙型流感 病毒则少见得多，而丙型流感病毒一般不发生。
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流感病毒感染后可以激发机体的免疫 保护反应。 感染2周内即可产生针对 HA的IgM、IgA、IgG抗体。
它们可以阻断流感病毒对宿主细 胞的吸附和穿入，故有中和病毒、阻 止感染的作用。
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一、流行性感冒（influenza）
简称流感，是一种由流感病毒所致的急性 发热性呼吸道传染病；通过飞沫传播，具 有高度传染性，几乎每年都会在世界某个 地区暴发流行。
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一种假病毒颗粒及其制备方法和应用[发明专利]
![一种假病毒颗粒及其制备方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/40adfb4a178884868762caaedd3383c4bb4cb4b9.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510712786.4(22)申请日 2015.10.27C12N 7/04(2006.01)C12N 15/63(2006.01)C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)(71)申请人广东和信健康科技有限公司地址510530 广东省广州市萝岗区瑞发路1号1栋4楼申请人广州呼研所生物技术有限公司(72)发明人李小锋 李晨阳 崔红 商兴芳(74)专利代理机构广州华进联合专利商标代理有限公司 44224代理人万志香 胡杰(54)发明名称一种假病毒颗粒及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种假病毒颗粒，其是由MS2噬菌体的衣壳蛋白包裹了依次由甲型流感病毒、乙型流感病毒和β-actin 三种碱基片段串联而成的检测序列的DNA-蛋白复合体。
本发明还公开了上述假病毒颗粒的制备方法和其作为甲型流感病毒、乙型流感病毒检测的质控品的应用。
本发明的假病毒颗粒制备方法简单、操作容易、获得的假病毒纯度高，可作为甲型流感病毒及乙型流感病毒核酸检测试剂盒中的质控品，无传染性且稳定性好，具有耐核糖核酸酶等特点。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书16页序列表4页 附图3页CN 105200018 A 2015.12.30C N 105200018A1.一种假病毒颗粒，其特征在于，其是由MS2噬菌体的衣壳蛋白包裹了依次由甲型流感病毒、乙型流感病毒和β-actin三种碱基片段串联而成的检测序列的DNA-蛋白复合体。
2.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述甲型流感病毒的碱基片段为SEQ ID NO:3或对SEQ ID NO:3进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述乙型流感病毒的碱基片段为SEQ ID NO:4或对SEQ ID NO:4进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
甲型流感的病复制与细胞宿主因素
甲型流感的病复制与细胞宿主因素甲型流感病毒的复制与细胞宿主因素甲型流感，又称为H1N1流感或甲流，是一种由甲型流感病毒引起的急性呼吸道传染病。
病毒的复制与细胞宿主因素密切相关，本文将从这两个方面进行探讨。
一、甲型流感病毒的复制甲型流感病毒是一种负链单股RNA病毒，其复制过程通常包括以下几个关键步骤：1. 侵入细胞甲型流感病毒通过病毒表面的血凝素（H）蛋白与细胞表面的糖基化受体结合，从而侵入宿主细胞。
一旦病毒进入呼吸道上皮细胞，它将开始复制和传播。
2. 病毒基因组释放一旦病毒进入细胞，其外膜上的血凝素蛋白的活性使病毒能够与细胞内的囊泡融合，使得病毒基因组进入细胞质。
此后，病毒基因组将被释放出来，准备进行下一步的复制。
3. 病毒基因组复制与转录病毒基因组的复制和转录主要依赖于病毒内的RNA聚合酶。
该酶负责合成病毒基因组的互补链，同时也合成了病毒mRNA。
这一步骤为后续的病毒基因组复制和蛋白质合成提供了必要的模板。
4. 病毒蛋白质合成通过病毒内的核糖体结合位点，在宿主细胞内进行翻译，合成病毒所需的蛋白质。
这些蛋白质包括病毒膜蛋白、核蛋白以及血凝素等。
这些蛋白质的合成是病毒复制的基础，也为病毒的组装和释放提供了必要的支持。
5. 病毒组装和释放合成的病毒蛋白质会逐渐聚集在细胞内形成新的病毒颗粒。
最终，新病毒颗粒将通过细胞膜的融合、凋亡或细胞溶解等方式释放到细胞外，继续传播感染。
二、细胞宿主因素对甲型流感的影响除了病毒本身的复制过程外，细胞宿主因素也对甲型流感的发病和传播起着重要作用。
1. 受体特异性甲型流感病毒的侵入与细胞表面的受体结合密切相关。
不同的受体表达模式和特异性可影响病毒对不同类型细胞的感染能力和传播。
例如，H1N1病毒主要结合α-2,6型糖基化受体，其广泛分布于人类上皮细胞和淋巴细胞中，从而导致甲型流感在人群中蔓延。
2. 免疫反应宿主细胞的免疫反应是对抗甲型流感病毒感染的重要防线。
宿主细胞通过产生干扰素和其他炎症因子来启动免疫反应，并激活天然免疫细胞，如巨噬细胞和自然杀伤细胞等。
动物微生物学中常见的病毒和细菌病诊断
陈双钊一常见的致动物疾病性病毒狂犬病病毒狂犬病病毒（Rabies virus）属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus），是引起人和动物狂犬病的病原，该病在世界各地均有发生。
一、生物学特性病毒子长140～180nm，宽75～80nm，一端钝圆，另端平凹，呈子弹头形或试管形。
在螺旋对称的衣壳中，含有负股单股RNA。
具有脂蛋白的囊膜，在膜上有血凝素的穗状突起。
该病毒只有一个血清型。
二、抵抗力病毒在pH为7～9的范围内比较稳定，在56℃经30min可使病毒灭括。
五、致病性狂犬病病毒几乎可以感染所有的温血脊椎动物，同样也能感染人。
本病主要由患病动物咬伤后而感染。
当健康动物皮肤粘膜有损伤时，接触病畜的唾液亦可以感染。
病犬的唾液于症状出现前1～2周便可能会有病毒。
存在于病畜唾液中的病毒，通过咬伤而进入易感动物的皮下组织，然后沿着神经纤维由外周进入神经中枢。
也有人认为病毒是由外周经血液侵入脑组织。
病毒在脊髓和脑组织中增殖，并可按离心方向由中枢神经向外扩散，而脑脊髓液在病毒扩散中，亦起着重要作用，使所有器官都能查出病毒。
抵达唾液腺的病毒，在其上皮细胞内又大量增殖，并进入到唾液中。
病毒在中枢神经系统中的继续繁殖，损害神经细胞和血管壁，引起血管周围的细胞浸润。
神经细胞受刺激后，首先引起兴奋症状，如神经紊乱和反射性增高，后期神经细胞变性，逐渐引起麻痹，当呼吸中枢麻痹后即可造成死亡。
六、微生物学诊断常用的特异性检查方法有包涵体检查，动物试验，荧光抗体检查等三种。
（一）包涵体检查取大脑、小脑，特别是海马角部分，用刀片切开印片，趁印片未完全干燥时，以塞勒（Seller）氏液染1～5s，水洗、干燥、镜检。
内基氏小体呈鲜红色、间质呈粉红色、红细胞则为桔红色。
内基氏小体为圆形、卵形、核形、阿米巴形。
大小为24～27μm，位于细胞浆内。
用姬姆萨氏（Giemsa）染色，小体为红色（图10-1）。
由于有些犬、猪和草食兽的病例及病初死亡或早期剖杀动物中可能不见包涵体，所以并不是所有的病例都能检查出包涵体来。
第18章正粘病毒科（Orthomyxoviridae）讲解
第18章正粘病毒科（Orthomyxoviridae）讲解第⼗⼋章正粘病毒科(Orthomyxoviridae)⼀、概述主要参考⽂献⼀、概述流⾏性感冒病毒(以下简称流感病毒)的⾎凝素和神经氨酸酶对粘(糖)蛋⽩有亲和⼒，因此，原称为粘病毒，后统称为正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，以与另⼀科病毒--副粘病毒相区别。
甲型流感病毒的感染范围很⼴，常以流⾏的形式出现，发病急剧，蔓延迅速，危害很⼤。
在1918年第⼀次世界⼤战结束时，流感⼤流⾏，席卷全世界，死于流感的⼈⽐战争本⾝死亡的还多。
1933年，Smith等⾃⼈体分离出了甲型流感病毒。
家畜和家禽的流感都是流感病毒引起的。
Shope于1931年研究猪的流感，从猪体分离出⼀株病毒，将此种病毒接种易感猪后，使其发⽣了典型的猪流感。
Sovinova和Waddell等先后从马体中分离出马甲1型和马甲2型两株马流感病毒。
1955年证明鸡流感病毒含有甲型流感病毒核蛋⽩。
⼄型流感病毒发现于1940年，能引起⼈的呼吸道感染，但流⾏规模⽐甲型流感病毒⼩得多。
丙型流感病毒也是感染⼈的病毒，但极少引起流⾏。
1982年郭元吉等发现了猪的丙型流感病毒。
1.分类现状与命名正粘病毒科中原来只有⼀个属，即流感病毒属。
根据国际病毒分类委员会(ICTV) 第6次分类报告(1995)将正粘病毒科由原来的⼀个流感病毒属分为三个病毒属：甲、⼄型流感病毒属(Influenza virus A, B)；丙型流感病毒属(Influenza Virus C)；“类托⾼⼟病毒属”(“Thogoto －like viruses”)。
三个属的代表种分别为甲型流感病毒、丙型流感病毒、托⾼⼟病毒(Thogoto virus)。
现将正粘病毒科的分类现状列表18-1。
表18-1. 正粘病毒科分类现状科属代表种成员正粘病毒科（orthomyxoviridae）甲、⼄型流感病毒属(Influenza virus A, B)甲型流感病毒(Influenza virus A)丙型流感病毒属(Influenza Virus C)丙型流感病毒(Influenza Virus C)“类托⾼⼟病毒属”(“Thogoto-like virus”)托⾼⼟病毒(Thogoto virus)有关流感病毒的分类与命名，世界卫⽣组织1971年推荐⾸先以病毒蛋⽩为依据，将其分为甲、⼄、丙三型，再按表⾯抗原区分为⾎凝素(H)和神经氨酸酶(N)的不同亚型。
禽流感病毒血凝素基因及基因工程疫苗的研究进展
维普资讯
国外医药抗 生素 分册２ ０ 年第２ 卷第５ ０７ ８ 期
禽流感病 毒血凝素基 因及基 因工程疫苗 的研究进展
查 聪 ， 舒 张
（ 中国医药集 团四川抗 菌素工业研究所药理部 ，成都 ６ ０ ５ ） １０ １
摘 要 ：通过近年 来对禽流感病毒血凝素基 因及该基 因编码 的血 凝素蛋 白的结构和功能 的研 究 ，进一步明确了禽流感 病毒血凝素基 因的特 点以及血凝素 蛋白的裂解效力与禽流感病 毒致病性的关 系。本 文着重就血凝素 蛋白及其 裂解位点 与 禽流感病毒致病力 的关 系进 行综 述 ，并对禽流感病毒血凝素基 因工程疫 苗的研 究与开发近况作一介绍 。 关键词 ：禽流感 ；血凝素 基因 ；疫 苗 中图分类号 ：Ｒ ７ ． ９ ８７ 文献标识码 ：Ａ 文章编 号 ：１０ —７ １２ ０ ）５０ ０ —５ ０ １８ ５ （０ ７０ —２ ５０
１ ｏ ￣Ａ秋以来， ｆ ｏｓ ２ 我国的内蒙、 安徽、 湖南先后发生多
起 疫 情。由于 我 国养禽 量位 居 世界 第一 ， 之 其他 客 观 加 条件的限制 ， 给ＡＩ 控工作带来许多不 确定 因素 。 防 因此 ， 我国防控禽 流感工作形 势严峻 。
ｗｅｌ ｓｔｅｒ ｌ ｉ ｎ ｈｐ ｂ ｔ ｅ ｈ ｌａ ａ ｅｏ ｐ ｏｅｎ ａ ｄ ｐ ｔ ｏ ｅ ｉｉ ｆ Ｖ ｒ ｕ ｌ ａ ａ ｏ ｓ ｉ ｅｗｅ ｎ ｔ ｅｃｅ ｖ ｇ ｆ ｈ ｅ ｔ ＨＡ ｒ ｔｉ ｎ ａｈ ｇ ｎｃｔ ｏ ｙ ＡＩ ｗｅｅ ｓ ｍｍａ ｚ ｄ Ｔ ｅｐ ｏ ｒｓ ｉ ｒ ｅ ． ｈ ｒ ｇ ｅ ｓｉ ｎ
【国家自然科学基金】_马流感病毒_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140801
2011年 科研热词 逆转录环介导等温扩增 豚鼠 胸腺 禽流感病毒 番鸭呼肠孤病毒 甲流 甲强龙 甲型h1n1流感病毒 清开灵口服液 模型 抗病毒作用 双黄连口服液 共感染 免疫抑制 免疫功能 sybr green ⅰ h9流感病毒 推荐指数 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2008年 序号 1 2 3 4
科研热词 真核表达 密码子优化 ha h5n1推荐指数 1 1 1 1
2009年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
科研热词 禽流感 神经氨酸酶 流感病毒 重组腺病毒 跨种传播 自然宿主 腺病毒 细胞免疫 猪流感 流感病毒的分布及流行 流感 晶体结构 免疫 人流感 人 主动 rna聚合酶复合体 pb1 pa h5n1 a型
2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
科研热词 番鸭呼肠孤病毒 免疫抑制 h9流感病毒 鞭毛蛋白 血凝素 脾脏 细胞凋亡 疫苗 流感病毒 法氏囊 基因芯片技术 原核表达 共感染 p53
推荐指数 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2013年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
2014年 科研热词 解表清里方 疏风宣肺方 流感病毒性肺炎 小鼠 基因芯片 toll样受体 推荐指数 1 1 1 1 1 1
科研热词 马流感病毒 进化 血凝抑制试验 聚合酶基因 神经氨酸酶 流感病毒a型,h1n1亚型 流感病毒 活化 抗原 微生物敏感性试验 小干rna 变异(遗传学) γ δ t细胞 h3亚型 a型h1n1流感病毒
推荐指数 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及初步表达
甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及初步表达（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：杨靖，张卫东，曹康，蒋中华，李虹，李明远[摘要] 目的:构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体。
体外转染真核细胞株HEK293细胞并检测目的蛋白的表达。
方法:从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA，用特异引物进行RT－PCR，扩增M2基因。
通过分子克隆技术将所扩增片段插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)。
经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到HEK293细胞中，通过免疫荧光技术鉴定其表达。
结果:经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。
免疫荧光技术证实流感病毒M2基因的表达。
结论:甲型流感病毒M2蛋白是一种具有高保守性，可形成离子通道并影响流感病毒表面蛋白血凝素(HA)天然构象的形成，被认为是具有交叉免疫保护性的结构蛋白。
甲型流感病毒M2基因真核表达质粒的构建及成功表达将为甲型流感病毒基因工程疫苗，通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。
[关键词] 甲型流感病毒；M2基因；真核表达载体；免疫荧光技术Abstract:Objective To construct eukaryotic expression plasmid containing M2 gene from influenza A virus , transfer it into HEK293 eukaryotic cell line and detect the expression of target protein.Methods RNA was extracted from allantoic fluid of chicken embryo inoculated with influenza A virus A/PR/8/34. M2 gene was amplified by RT-PCR with specific primer and inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+) for constructing the recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-M2. Then the recombinant plasmid was transfected into HEK293 cells with PolyFect Transfection Reagent after identification by restriction enzyme analysis, PCR and sequencing analysis.Results Restriction enzyme identification, PCR and sequencing analysis demonstrated that the M2 gene was successfully cloned and inserted into pcDNA3.1(+). Immunofluorescence assay confirmed that the M2 gene could be expressed in HEK293 cells.Conclusion M2 protein of influenza A virus is a kind of highly conserved protein in amino acid sequence and its ion channel activity can affect the structural stabilization of haemegglutinin (HA) of influenza virus. So the study provides a basis for exploring genetic engineeredvaccine，DNA vaccine and broad-spectrum vaccine for influenza A virus.Key words:influenza virus; M2 gene; eukaryotic expression vector; immunofluorescence assay1933年Smith等人首先用雪貂分离出甲型流感病毒，确定了流感病毒的病因。
流感病毒基础知识
流感的危害流行性感冒简称流感，是由流行性感冒病毒引起的呼吸道疾病，具有传染性强、流行面广、潜伏期短、发病率高等特点，在儿童、老人及高危人群中的死亡率很高。
有数据表明，每年冬季流感爆发期会使全球人口近10％感染致病。
流感病毒简介流行性感冒病毒（influenza virus）简称流感病毒，是引起流行性感冒（流感）的病原体，属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）。
(是与粘液蛋白有特殊亲和性病毒中的1科)粘病毒是指对人或某些动物红细胞表面的黏蛋白有亲和力的病毒。
正、副粘病毒的区分以其核酸是否分节段为标准，分节段者为正粘病毒，不分节段者为副粘病毒，正粘病毒科只有流感病毒一个种。
（一）形态与结构流感病毒具有多形态，一般为球形，也有的呈丝状或杆状，病毒直径为80-120nm。
流感病毒的结构主要包括内部的核心、衣壳（核衣壳）和外面的包膜（附图）。
Fig. (1) Schematic representation of the influenza A virus (Reference [22])1、核心（core）流感病毒的核酸为分节段、负链单股RNA，称为分节段基因组（segmented genome）。
其中甲型和乙型流感病毒的核酸分为8个节段，而丙型流感病毒的分为7个节段。
每一基因节段分别编码不同的蛋白，决定流感病毒的遗传特性。
第1~6基因节段分别编码RNA多聚酶（RNA polymerase）PB2、PB1、PA、血凝素（hemagglutinin，HA）、核蛋白（nucleoprotein, NP）、神经氨酸酶（neuraminidase, NA）；第7基因节段编码包膜蛋白，包括内膜基质蛋白（M1）和膜蛋白（M2）；第8节段编码非结构蛋白（nonstructural protein, NS）NS1和NS2。
流感病毒各基因节段复制后，组装入子代病毒体中，但在组装过程中极易发生基因重组而导致新病毒株的出现，这是流感病毒容易发生变异而出现大流行的主要原因。
病毒的基本形态和分类病毒的感染与免疫病毒感染的实验室诊断全
病毒的感染与免疫
病毒的感染方式
水平传播： 通过黏膜表面：呼吸道、消化道、泌尿生殖 道 通过皮肤传播：媒介昆虫叮咬皮肤 医源性传播：经输血、注射、拔牙、手术等
垂直传播： 经胎盘传播 经产道传播
病毒感染的类型
病毒的鉴定－－最后鉴定
中和试验
已知抗体＋待检病毒－→细胞培养－→观察有无细胞病变
交叉保护试验
病毒免疫动物－→2周后，用标准动物作攻击试验 不接种病毒的动物－→2周后，用标准动物作攻击试验
病毒的血清学诊断
标本采集：早期和恢 复期双份血清
急性期单份血清IgM 的测定
双份血清的IgG 的测 定
常用方法 中和试验 补体结合试验 血凝抑制试验 免疫荧光试验 酶免试验 胶乳凝集试验 间接血凝试验
隐性感染：成为病毒携带者；获得免疫 显性感染： 急性感染 持续性感染 慢性感染 潜伏感染： 慢发感染
病毒的致病机制
一、病毒对宿主细胞的直接作用 影响细胞的生命力 杀细胞感染 非杀细胞感染 细胞融合 形成包涵体：有些病毒感染的细胞在普通光学显 微镜下可观察到胞浆或胞核内出现圆形或卵圆形 的斑块状结构 细胞转化 细胞凋亡
互补DNA
RNA:DNA
双股DNA
整合宿主细胞DNA
RNA 逆转录病毒的合成
呼吸道病毒
种类 正粘病毒：
流感病毒 副粘病毒：
麻疹病毒 腮腺炎病毒 风疹病毒 呼吸道合胞病毒
流行性感冒病毒
属正粘病毒科 是引起流行性感冒的病原体 分甲、乙、丙三型 甲型流感病毒常引起流感的大流行
生物学特性
形态结构：球形；属RNA病毒；有包膜
甲乙流感病毒实验室风险评估_2
甲型/乙型流感病毒实验室活动风险评估报告一、生物学特征（一）种类和分型流行性感冒病毒（influenza virus）, 是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的代表种, 简称流感病毒, 包括人流感病毒和动物流感病毒, 人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型, 是流行性感冒（流感）的病原体。
其中甲型流感病毒抗原性易发生变异, 多次引起世界性大流行。
例如1918～1919年的大流行中, 全世界至少有2000万～4000万人死于流感；乙型流感病毒对人类致病性也比较强, 但是人们还没有发现乙型流感病毒引起过世界性大流行；丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染, 很少造成流行。
甲型流感病毒于1933年分离成功, 乙型流感病毒于1940年获得, 丙型流感病毒直到1949年才成功分离。
流感分类根据流感病毒感染的对象, 可以将病毒分为人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒以及禽流感病毒等类群, 其中人类流感病毒根据其核蛋白的抗原性可以分为三类:甲型流感病毒（Influenza A virus）, 又称A型流感病毒乙型流感病毒（Influenza B virus）, 又称B型流感病毒丙型流感病毒（Influenza C virus）, 又称C型流感病毒感染鸟类、猪等其他动物的流感病毒, 其核蛋白的抗原性与人甲型流感病毒相同, 但是由于甲型、乙型和丙型流感病毒的分类只是针对人流感病毒的, 因此通常不将禽流感病毒等非人类宿主的流感病毒称作甲型流感病毒。
在核蛋白抗原性的基础上, 流感病毒还根据血凝素HA和神经氨酸酶NA的抗原性分为不同的亚型。
（二）形态结构流感病毒呈球形, 新分离的毒株则多呈丝状, 其直径在80至120纳米之间, 丝状流感病毒的长度可达4000纳米。
流感病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。
病毒的核心包含了存贮病毒信息的遗传物质以及复制这些信息必须的酶。
流感病毒的遗传物质是单股负链RNA, 简写为ss-RNA, ss-RNA与核蛋白 (NP)相结合, 缠绕成核糖核蛋白体 (RNP), 以密度极高的形式存在。
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推荐228个畜牧兽医专业毕业论文题目参考1、10%丁香酚纳米乳的研制2、2009-2011年国内传染性支气管炎病毒分子流行病学研究3、3种植物多糖抗猪蓝耳病病毒及免疫增强作用研究4、ATF6在内质网应激引起的HepG2细胞自噬与凋亡中作用机制的研究5、A型流感病毒16种HA血清型DNA微阵列检测方法研究6、A型流感病毒感染机理研究：肥大细胞与调节性T细胞7、A亚群禽白血病病毒不同分离株的基因组和生物学特性比较8、H5N1流感病毒感染孕鼠的机制以及养禽业人员禽流感感染风险调查9、H9N2亚型禽流感病毒气源性传染的监测及其分子机制的研究10、H9亚型禽流感病毒遗传演化分析及致病性研究与疫苗免疫效果评估11、Nsp9-Nsp12与高致病性PRRSV的增殖能力和致死性毒力的相关性12、p53在I型干扰素介导的先天性抗甲型流感病毒中的作用研究13、PHEV感染小鼠大脑皮质mRNA和microRNA表达谱变化及其诱导细胞凋亡机制的研究14、PI3K/Akt信号通路与天然免疫限制性因子SAMHD1在PRRSV感染过程中的作用研究15、PRRSV Nsp2与宿主细胞蛋白BAG6和AIF1相互作用的分子机制16、PRRSV对猪肺泡巨噬细胞天然免疫功能影响的分子机制17、PRRSV感染诱导细胞自噬及内质网应激的机制研究18、PRRSV诱导炎症反应及其调控机制19、PRRSV诊断方法的建立及鲁豫冀地区PRRSV的流行与遗传变异研究20、RNA干扰途径抗猪瘟病毒研究21、β-肾上腺素受体激动剂克伦特罗的免疫特性及中毒病理学研究22、阿魏酸钠抗炎分子机制及对奶牛子宫内膜炎疗效初步观察123、靶向黑色素瘤重组免疫毒素MSH-PE38KDEL的表达、纯化及其靶向抗肿瘤生物学效应24、毕赤酵母表达犬长效干扰素融合蛋白的研究25、变异猪伪狂犬病毒的分离鉴定及生物学特性分析26、冰川棘豆毒素的毒性及细菌降解研究27、博落回杀螨活性成分的研究28、不同来源多重耐药性沙门氏菌分离株的耐药机制和脉冲场凝胶电泳分析29、不同条件下小鼠子宫内膜雌激素受体及HOXA10基因表达的研究30、不同宿主来源新城疫病毒全基因组特征及其V蛋白对DF-1细胞IFN-β生成的影响31、布鲁氏菌wzm/wzt基因对其毒力、免疫原性及蛋白质表达影响的研究32、产苦马豆素疯草内生真菌的分离鉴定及其遗传多态性研究33、成年体细胞克隆山羊研究34、宠物源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的多药耐药机制研究35、川牛膝多糖对小鼠免疫反应的影响及机理研究36、大肠杆菌、乳酸杆菌“活的非可培养状态”研究37、大豆磷脂对AA肉鸡脂肪代谢及肉品质影响的研究38、蛋鸡ALV-J的分离鉴定及分子致瘤机制的研究39、典型肉鸡生产链中弯曲菌耐药性调查及风险评估研究40、丁香叶总黄酮的提取工艺及抑菌效果评价41、冬虫夏草无性繁殖研究及其产物对HepG2细胞凋亡的影响42、动物疾病诊断专家系统的研究与应用43、动物性食品中喹恶啉类药物代谢物和磺胺类-喹诺酮类药物多残留免疫分析方法研究44、动物性食品中喹诺酮类药物残留的荧光偏振免疫分析研究45、动物性食品中酰胺醇类残留化学发光检测技术研究46、断奶仔猪源大肠杆菌毒力因子的分子流行病学及F18菌毛部分特性的研究47、多拉菌素的抗炎作用及其对相关信号转导通路的调控248、鹅源新城疫病毒部分生物学特性鉴定及其囊膜糖蛋白基因序列分析49、恩诺沙星和磺胺二甲嘧啶核酸适配体的筛选及化学发光检测方法的研究50、发酵豆粕对断奶仔猪生长性能和肠道微生物的影响51、防治奶牛乳房炎新型中药制剂的研究52、防治奶牛子宫内膜炎新型复方药物制剂宫炎清的研究53、仿生骨修复支架材料的设计及其成骨诱导机制的研究54、非淀粉多糖酶制剂对鸡、猪生长的影响及其作用机制研究55、疯草（甘肃棘豆）生物碱系统分析及其毒性的比较病理学研究56、疯草内生真菌合成苦马豆素的研究57、孵化温度对鸭胚胎发育和机体代谢的影响研究58、副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究59、副猪嗜血杆菌毒力因子筛选和capD基因功能研究60、副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的转录组学研究与环介导恒温扩增法的建立61、副猪嗜血杆菌耐药性分子机制研究62、副猪嗜血杆菌耐药性调查和耐药机制研究63、副猪嗜血杆菌重要免疫原性相关蛋白发掘及GAPDH免疫调节机理研究64、钙离子结合蛋白S100A4的原核表达纯化以及S100A6单克隆抗体的制备65、甘草总黄酮抗金黄色葡萄球菌作用及其治疗奶牛乳房炎的应用研究66、甘肃的虫草及其相关真菌的多样性67、高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒及其弱毒感染性克隆的构建和应用68、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定、遗传变异及致病性分析69、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒人工感染模型的建立及其部分生物学特性研究70、镉对大鼠大脑皮质神经细胞毒性损伤的机制71、弓形虫疫苗候选抗原IMP1生物学特性及其免疫原性研究72、谷物、猪饲料和牛奶中赭曲霉毒素A的检测方法研究73、瓜子金皂苷己抑制神经细胞缺血再灌注损伤及抗神经炎症作用的体外研究374、规模化猪场猪瘟疫苗群体免疫程序的研究75、国内外动物源食品安全保障体系研究76、国内外兽药产业现状与发展趋势研究77、寒区温室型犊牛舍的设计与冬季应用效果的研究78、寒区育肥牛舍冬季环境测定与通风改造的研究79、河北省猪链球菌病病原学调查与分析80、黑龙江省部分猪场猪伪狂犬病流行病学调查81、黑龙江省奶牛场生命周期评价82、黑曲霉菌在生物发酵饲料上的应用及其产品对动物抗病力的影响83、红景天苷的抗炎作用及其对炎症信号转导通路的调控84、湖南地区猪流行性腹泻病毒的分子流行病学和血清流行病学调查85、黄芪多糖益生菌合生元对雏鸡生长和免疫作用的研究86、黄芪提取物对鸡生长发育及免疫功能的影响87、黄芩苷对小鼠金黄色葡萄球菌性乳腺炎的作用及机制研究88、黄土高原13个栽培牧草品种的生产性能对模拟轮牧的响应89、鸡枞菌多糖的免疫调节作用及其注射液的研制90、鸡痘病毒282E4株基因组和蛋白质组解析、载体构建与HIV重组疫苗研究91、鸡柔嫩艾美耳球虫西宁株的分离鉴定、生物学特性及抗药性研究92、鸡双向选择家系肠道微生物宏基因组学研究93、基于基因打靶技术的人胚胎干细胞向功能性肝细胞分化的研究94、基于犬2型腺病毒和1型腺相关病毒载体的小反刍兽疫重组疫苗的研究95、基于微生物固态发酵豆粕转化大豆异黄酮的研究96、吉林省羊传染性脓疱病流行病学调査及其灭活疫苗的研制97、集约化猪场粪便处理的生命周期评价98、减毒痘苗病毒天坛株的构建、致病性及免疫原性研究99、金黄色葡萄球菌噬菌体GH15及其裂解酶三维结构与分子作用机制研究4100、金丝桃素抗菌及抗鸡球虫的研究101、咖啡酸抗LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤作用及其分子机制102、口蹄疫、猪瘟和蓝耳病三种疫苗同步分点免疫技术研究与推广应用103、口蹄疫病毒VP1蛋白抑制细胞Ⅰ型干扰素产生的分子机理104、狂犬病病毒CVS-11株感染性cDNA克隆的构建及其应用105、狂犬病病毒核酸适配体的筛选及其生物学活性鉴定106、喹赛多在猪、鸡、鱼和大鼠体内代谢及分布研究107、雷公藤多甙纳米乳透皮给药系统的研究108、冷应激对鸡肝脏脂肪代谢与炎性因子的影响109、凉山半细毛羊Mef2A、Mef2C基因克隆与组织时空表达110、辽宁省盘锦地区动物病原性大肠杆菌的分离鉴定及其耐药性研究111、骆驼挤奶机结构与工作参数的试验研究112、绿原酸抗乳腺炎作用及机制研究113、马立克氏病病毒RB1B株感染鸡的蛋白质组、转录组学及天然免疫机理研究114、美洲型、欧洲型PRRSV及PCV2基因工程疫苗构建及实验免疫研究115、锰对体外鸡脾淋巴细胞炎症因子和细胞因子mRNA表达的影响116、锰诱导体外鸡脾淋巴细胞HSPs 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(动物病毒学)第12章负链RNA病毒
(antigenic shift） ---Reassortment
+/genetic mutations
流感难以控制!!
抗原漂移（Genetic mutations）导致免疫失败
1.流感疫苗（2株A型流感病毒和 1株B型流感病毒）
2.免疫后，机体产生针对3种毒株 的抗体
3.在流感流行季节，若有流感病 毒感染机体，体内的抗体与HA 抗原结合，阻止病毒吸附到细 胞上
n1n9血凝素hemagglutininhaproteolyticactivationcleavagehydrophobicmembranedomainhydrophobiccytoplasmicdomainha1ha2ss使其具有血细胞凝集活性是病毒的吸附蛋白病毒以膜融合方式迚入细胞需要ha的水解诱生中呾抗体呾细胞免疫反应决定病毒的亚型ha基因裂解位点与病毒组织嗜性horimotokawaoka2005ha基因中除裂解位点外97108126138217位的氨基酸与毒力的关系也非常密识别细胞受体水解其末端n乙酰基神经氨酸促迚病毒迚入靶细胞病毒在细胞表面成熟时na移去出芽点上的神经氨酸利于病毒粒子成熟呾释放
• 神经氨酸酶活性：
➢NDV的HN蛋白具有神经氨酸酶功能，能水解唾 液酸的糖苷键，使受体从红细胞表面脱离，从而 使已经被病毒凝集的红细胞发生解凝集。
• 细胞融合：
➢NDV复制时，病毒首先吸附于细胞受体，随后病 毒囊膜与细胞膜发生融合。NDV感染还可导致2 个或多个细胞之间的细胞膜融合，形成合胞体
5、NDV的血清分型
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以前的几次大流感导致的死亡人数
➢ 1918-1919，H1N1: Spainish flu, 50 M Death ➢ 1957-1958，H2N2: Asian flu, 2 M Death ➢ 1968-1969，H3N2: Hong Kong flu,1 M death ➢ 1977-1978，H1N1: Russian flu，Not known ➢ 1997-Now，H5N1: AIV 493 infection，292 death
pSC101-pMB1质粒双复制子质粒的构建
pSC101-pMB1质粒双复制子质粒的构建
莫冰;余克花
【期刊名称】《南昌大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2009(049)008
【摘要】目的构建带有pSC101和pMB1复制子的质粒.方法将pSC101、pUC19(pMB1型复制子)分别用EcoRI限制性内切酶消化后,DNA连接酶连接,转化大肠杆菌DH5a,筛选重组子,提取质粒电泳分析;氯霉素培养条件下提取双复制子质粒及其检测OD260值,并将双复制子质粒转化ploA-大肠杆菌.结果阳性重组子带有1个11.9 kb质粒,该质粒带有氨苄青霉素和四环素耐药基因的质粒,氯霉素培养条件下双复制子质粒的提取物OD260值增加,并能转化ploA-大肠杆菌.结论构建的质粒带有pSC101和pMB1 2类复制子.
【总页数】2页(P31-32)
【作者】莫冰;余克花
【作者单位】南昌大学基础医学院微生物学教研室,南昌,330006;南昌大学医学实验教学部,南昌,330006
【正文语种】中文
【中图分类】R378.2+1
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周斌;周元平;曾艳丽;李威;王俊洁;张健;张浩;刘叔文
3.双复制子质粒消除耐药质粒的研究 [J], 莫冰;余克花;黎帆;李蓉;宋矿余
4.马流感病毒血凝素基因甲病毒复制子重组表达质粒的构建及其免疫效力评价 [J], 仇铮;郭巍;孙元;戚亭;仇华吉;相文华
5.双复制子质粒消除耐药质粒的研究 [J], 莫冰;余克花;黎帆;李蓉;宋矿余;
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马流感病毒血凝素基因甲病毒复制子重组表达质粒的构建及其免疫效力评价仇铮1,2，郭巍2，孙元3，戚亭2，仇华吉3，相文华2*(1.东北农业大学动物医学院，黑龙江哈尔滨150030；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室，黑龙江哈尔滨150001；3.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪病研究室，黑龙江哈尔滨150001)摘要：为评价马流感病毒(EIV)HA 基因核酸免疫效果，本研究以甲病毒复制子载体pSFV1CS 分别构建了表达EIV H3N8亚型的美洲型和欧洲型HA 基因的重组真核表达质粒。
并将其转染293T 细胞，经间接免疫荧光鉴定表明HA 基因获得表达；以重组质粒免疫的BALB/c 鼠能够检测到特异性抗体产生，而且HI 抗体水平持续升高，同时小鼠体内IFN-γ、IL-4分泌水平也有所升高。
攻毒后小鼠表现轻度临床症状，但病毒分离和RT-PCR 均未检测到病毒。
上述结果表明，该重组质粒pSFV1CS-EIV-HA 具有良好的免疫原性并且可以诱导免疫动物产生较高免疫应答的能力。
关键词：马流感病毒；甲病毒复制子载体中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2012)07-0568-04Immunization responses against equine influenza virus (EIV)based on recombinant Alphavirus replicon plasmidexpressing EIV hemagglutinin geneQIU Zheng 1,2,GUO Wei 2,SUN Yuan 3,QI Ting 2,QIU Hua-ji 3,XIANG Wen-hua 2*(1.College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Division of Livestock Infectious Diseases,State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001,China;3.Division of Swine Infectious Diseases,State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultrual Sciences,Harbin 150001,China)Abstract :To evaluate DNA vaccination against equine influenza virus (EIV),the hemagglutinin (HA)genes of American and European H3N8subtype EIV were amplified by RT-PCR and cloned into a Semliki forest virus (SFV)replicon based plasmid of pSFV to construct the recombinant plasmid pSFV1CS-EIV-HA,respectively.The HA expressions were identified in the 293T cells transfected with the recombinant plasmid by indirect immunofluorescence assay.Furthermore,the specific HI antibody,IFN-γor IL-4level were detected in BALB/c mice immunized with either single or both of the recombinant plasmids.However,the virus was failed to detect in immunized BALB/c mice by the RT-PCR detection or the virus isolation.The results indicated that the recombinant plasmids possessed a capability for inducing effective immune responses in animals,which was a promising candidate DNA vaccine against EIV infection.Key words :equine influenza virus;alphavirus replicon vector 收稿日期：2012-01-19基金项目：农业部公益性行业科研专项(201003075)；2010年农业部马属动物疫病监测与诊断项目作者简介：仇铮(1982-)，女，黑龙江哈尔滨人，博士，主要从事分子生物学与免疫学研究.*通信作者：E-mail ：xiangwenhua1@中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第34卷第7期2012年7月Vol.34，No.7Jul.2012doi:10.3969/j.issn.1008-0589.2012.07.16*Corresponding author自20世纪60年代开始使用马流感病毒(Equine influenza virus，EIV)疫苗以来，商品化的EIV疫苗大多为灭活的全病毒疫苗、亚单位疫苗及病毒载体疫苗。
流感病毒灭活疫苗和亚单位疫苗同样存在抗体效价高，但抗体持续时间短的特点。
病毒载体疫苗如痘病毒载体疫苗使用安全，然而机体可能存在针对痘病毒的特异性抗体，会对再次使用的相同重组病毒疫苗产生干扰[1]。
基于pSFV真核表达载体构建的“自杀性”重组质粒，是以外源基因代替甲病毒的结构蛋白基因，并在非结构蛋白基因上游插入CMV启动子，从而启动外源基因高水平表达，以激发免疫反应[2]。
该载体在猪瘟病毒、流感病毒、人单纯疱疹病毒等多种病毒性疾病DNA疫苗的动物实验结果中均取得良好的免疫效果[3-4]。
本研究采用在中国分离的EIV H3N8亚型的美洲型和欧洲型病毒株，通过SFV复制子载体以研究EIV核酸免疫，并对其免疫效果进行评价。
1材料和方法1.1病毒株、载体及主要试剂A/equine/Xinjiang/ 3/2007美洲型和A/equine/Qinghai/1/1994欧洲型H3N8亚型EIV由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所马病实验室分离并保存[5-6]，效价分别为109.8 EID50/mL和108.0EID50/mL；pSFV1CS载体为哈尔滨兽医研究所猪传染病实验室惠赠；限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司；脂质体转染试剂盒Lipofectamine TM2000Reagent购自Invitorgen公司；质粒纯化试剂盒Wizard R PureFection Plasmid DNA Purification System购自Promega公司；抗EIV多抗由本实验室制备并保存；FITC标记的羊抗兔荧光抗体(FITC-IgG)购自Sigma公司；小鼠IFN-γ、IL-4 ELISA检测试剂盒购自武汉博士德生物技术公司；RNA抽提试剂盒购自上海华瞬生物技术有限公司。
1.2实验动物及细胞4周龄～6周龄雌性BALB/c 鼠和9日龄～10日龄SPF鸡胚均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心；293T细胞由本实验室冻存。
1.3重组表达质粒的构建和鉴定1.3.1重组表达质粒的构建与纯化根据GenBank 中登录的EIV XJ HA株基因序列(EU794560.1)设计一对特异性引物：5'-GACCCGGGCTATCAGTTTAC TCAAATG-3'和5'-GCGGATCCGCCACCATGAAGA CAACCATTAT-3'(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。
将两种EIV分别接种的鸡胚尿囊液中提取RNA，通过Uni-12随机引物反转录合成cDNA，并以其为模板PCR扩增HA基因，克隆于pMD18-T中进行测序。
提取重组质粒，以Bam HⅠ和SmaⅠ双酶切目的片段并胶回收，与同样双酶切的pSFV1CS载体在T4DNA连接酶的作用下进行连接，转化感受态细胞DH5α，经过培养后，提取重组质粒进行测序，将两种病毒株的重组质粒命名为pSFV1CS-HA(XJ)和pSFV1CS-HA(QH)。
将重组质粒pSFV1CS-HA按照质粒纯化试剂盒说明书进行纯化，并转染细胞；按碱裂解法大量提取pSFV1CS-HA和pSFV1CS质粒。
1.3.2重组质粒在293T细胞中的瞬时表达及检测采用脂质体转染试剂盒将pSFV1CS-HA(XJ)和pSFV1CS-HA(QH)分别转染293T细胞，以空载体质粒pSFV1CS作为阴性对照。
以多聚赖氨酸处理的细胞培养板培养293T细胞，按转染试剂盒说明书操作方法分别将重组质粒和空载体转染60%的293T 细胞，在5%CO2，37℃条件下培养。
转染48h 后，冷丙酮固定10min，以抗EIV多抗作为一抗(1∶200)，羊抗兔FITC-IgG荧光抗体为二抗(1∶10000)进行间接免疫荧光(IFA)鉴定。
1.4动物免疫4周龄～6周龄雌性BALB/c鼠，随机分为7组，每组15只(表1)。
后腿内侧肌肉(100g/只)接种，每3周一次，共免疫2次。
第二次免疫后，小鼠用干冰迅速麻醉，通过鼻腔接种108EID50的A/equine/Xinjiang/3/2007(H3N8)或A/equine/Qinghai/ 1/1994(H3N8)病毒稀释液(50μL/只)。
1.5抗体检测1.5.1HI抗体检测免疫后小鼠每周采血进行HI 检测；小鼠攻毒后每隔2d采血，并进行HI检测。
1.5.2IFN-γ、IL-4分泌水平检测采集免疫小鼠外周血血清，采用检测试剂盒进行IFN-γ、IL-4含量的检测，具体操作参照试剂盒说明书。