H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体的制备及鉴定

（Ａ 、 Ｅ Ｖ）马传 染性 贫血病毒 （ Ｉｖ）马 日本 脑 炎病毒 （Ｅ 发 生交叉反应 。研 究为 建立单克 隆抗 体介 导的检 测 ＥＡ 、 Ｊ Ｖ）
马流 感病毒抗 原和抗 体的血清 学方法 以及 为 实现 马流 感标 准化诊 断奠定基础 。 关键 词 ： Ｎ８亚型 马流 感病 毒 ； Ｈ３ 单克 隆抗 体 ； 血凝 素 ； 特性 鉴 定
［３ 方法 建立 间接 Ｅ ＩＡ， 酶 标 板 上 进 行 方 阵滴 上 。用含 １ｇ Ｌ牛血清 白蛋 白的 Ｐ Ｓ在 ４℃条 件下 １］ ＬＳ 在 ／ Ｂ
定 ， 定检 测抗原 全病 毒 的最佳 包 被浓 度 及 阳性 、 确 阴
性对 照血 清 的最 佳稀 释浓 度 。 １ ２ ２ ３ 血 凝 抑制 试 验 检测 方 法 的 建立 小 鼠血 ．． ． 清前 处理 方法 ： Ｐ Ｓ将 血 清做 １： 用 Ｂ ５倍 稀 释 ， 入 加
中 图 分 类 号 ：８ ２ ６ ２ ￥ ５ ． ５ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：ｏ ７５ ３ （Ｏ １Ｏ —０ １Ｏ ｌ ０—Ｏ ８ ２ ｌ ）６０Ｏ 一４
马 流行 性 感 冒 （ ｑ ｉｅｉｆ ｅ ｚ ， Ｉ 是 由正 黏 Ｅ ｕｎ ｌ ｎａ Ｅ ） ｎｕ
病毒 快 速简 便 的检测 方法 奠定 基础 。
病毒 科 流感 病 毒 属 马 Ａ 型 流 感 病 毒 （ ｑ ｉｅｉｆ — １ 材 料 与 方 法 Ｅ ｕｎ ｎｌ ｕ ｅ ｚ ｉ ｓ Ｅ Ｖ） ｎ ａｖｒ ， Ｉ 引起 马属 动 物 的一种 急性 暴 发 性 流 １ １ 材 料 ｕ ． 行 的传 染 病 ， 马 属 动物 中极 易 传 播 ［ 。世 界 动物 在 １ ］ 卫生 组 织 （ Ｅ） 其 列 为 法 定 报 告 动 物 疫 病 ［ ， ＯＩ 将 ２ 我 ］ 国将 其 列 为三类 动 物疫 病 。 Ｈ３ Ｎ８亚 型 马 流感 病 毒 于 １６ ９ ３年 在美 国迈 阿密 马群 中首次 分 离 到［ ， ３ 此后 ］ 在 多个 国家暴发 和流 行 。２ ０ ０ ７年 ， 大 利 亚 、 澳 日本 、 马 流感 病 毒 Ａ／ ｑ ｉｅＪｌ ／ ／ ９ ９ Ｈ３ ） Ｅ ｕｎ ／ｉｎ １ １ ８ （ Ｎ８ 为 ｉ １８ ９ ９年吉 林 分离株 ， 马流感 病毒 Ａ／ ｑ ｉｅＢ ｉｎ ／ Ｅ ｕｎ ／ ｅ ｉｇ ｊ １ １ ７ （ Ｎ７ 由吉 林 出入 境 检 验 检 疫局 技 术 中心 ／ ９ ４ Ｈ７ ） 生物 室保 存 ， 动 脉 炎 病 毒 （ ＡＶ） 马传 染 性 贫 血 马 Ｅ 、
按 试剂 盒说 明进 行 。
１ ２ ３ ３ 抗 体 特 异性 鉴 定 使 用 Ｗｅｔｒ ｌｔ ．．． ｓｅｎ ｂｏ 方
法进 行 ｍＡｂ特异 性 和所识别 的靶 位进 行鉴定 ， 按文
Ｈ７ Ｉ Ｎ７Ｅ Ｖ病 毒 以及纯 化 的 Ｅ ＡＶ、 Ｉ Ｅ ＡＶ、Ｅ 全病 ＪＶ
剂乳 化 ， 强 免疫 ２次 ， 量 同首 免 。融 合 前 ３ｄ加 献 ［５ 方 法 进 行 。具 体 为 ， 纯 化 的 Ｈ３ Ｉ 加 剂 １］ 将 Ｎ８ＥＶ、 １ ２ ２ ２ 间 接 Ｅ Ｉ Ａ检 测方 法 的建 立 ． ．． ＬＳ 参 照 文献 毒进 行 Ｓ ＳＰ Ｄ － ＡＧＥ 并 转 移 到 硝 酸纤 维 素 （ ， ＮＣ） 膜
命 名为 ３ ２ ５ ０和 ５ ０ Ｃ 、Ｇ１ Ａ１ 。 ２ ２ ｍＡｂ的效价 测定 ．
间接 Ｅ Ｉ Ａ 法测定 ３株 ｍＡｂ的腹 水效 价 ，Ｃ ＬＳ ３２ 和 ５ ０为 １： ４０ ０ ５ ０为 ｌ： ２０ ０ Ｇ１ ６ ０ ，Ａ１ ３ ０ 。ＨＩ 方法
１ ２ ２ ４ 细 胞融 合 、 选及 克 隆 ．．． 筛
融合后 ， 用血凝 抑制试验 （ ） 间接 Ｅ Ａ 方 法筛选获得 ３株 （ Ｃ 、Ｇ１ ＨＩ和 ｕＳ ３ ２ ５ ０和 ５ ０ 能稳定 分泌 Ｈ３ Ａ１ ） Ｎ８亚型 马
流感病 毒单 克隆抗体 （ ｂ 的 杂交瘤 细胞 株 。其 中 ３ ２和 ５ ０为 ＩＧ２ ，Ａ１ ｍＡ ） Ｃ Ｇ１ ｇ ａ５ ０为 ＩＭ 亚类 ， 水抗体 效价检 ｇ 腹 测显 示 ，Ｃ ３ ２和 ５ ０为 １： ４０ ０ ５ ０为 １： ２０ ０ Ｇ１ ６ ０ ，Ａｉ ３ ０ 。ＨＩ Ｗｅｔ ｎｂｏ 结果表 明， 株 单克 隆抗体 均为 Ｅ Ｖ 和 ｓ ｒ ｌｔ ｅ ３ Ｉ 血凝 素特异性 单克 隆抗体 。特异 性试验 结果表 明 ， 获得 的 ｍＡｂ不 与 Ｈ７ 所 Ｎ７亚 型马流 感病 毒 、 马动脉 炎病 毒
１ ２ １ 病 毒 抗 原 制 备 将 Ａ／ ｑ ｉｅＪｌ ／ ／ ９ ９ ． ． Ｅ ｕｎ ／ ｉｎ １ １ ８ ｉ （ Ｎ８ 种 毒 经 ｌ Ｈ３ ） １日龄 Ｓ Ｆ鸡胚 尿 囊 腔 接种 扩 增 ， Ｐ ７ ２ｈ收集 感染鸡 胚 的尿 囊 液 ， 糖 密 度 梯度 离 心 纯 蔗 化病 毒 。
动物 医学进 展 ，０ １ ３ （ ） Ｉ４ ２ １ ，２ ６ ：－
Ｐｒ ｒ ｓ ｎ Ｖｅ ｅ ｉ ｒ ｅ ｉ ｉ ｏｇ ｅ ｓ ｉ ｔ ｒｎａ ｙ Ｍ ｄ ｃｎｅ
Ｈ３ Ｎ８亚 型 马 流 感 病 毒 单 克 隆 抗体 的制 备 及 鉴 定
肖成蕊 宋战 昀 杨 立英 王伟利¨ ， ， ， ， 孟庆峰 盂 日增 ，
测定 ３株 ｍＡｂ的 腹 水 ＨＩ效 价 ， Ｃ ３ ２为 ｌ× ２ ¨， 匀 。在铺 有饲 养 细 胞 的 ９ ６孔 板 上 每 孔 加 入 １ ０ ５ Ｏ为 １ ｕ，Ａ１ ０ Ｌ Ｇｌ ×２ ５ ０为 １ 。 ×２ 。 融合 细胞 悬 液 ， 后 将 融合 细 胞 培 养 板 于 ３ 最 ７℃ 、 体
动 物 中心 ；Ｐ ／ Ｓ ２ ０骨 髓 瘤 细 胞 系 由吉 林 出入 境 检 验 感疫 情 ， ９ ９年 我 国东北 地 区 发 生 Ｈ３ １８ Ｎ８亚 型 马 流 检疫 局 技术 中心 生 物室 保 存 ； 克 隆抗 体 亚 型鉴 定 单 感 ［ ， ９ ３年 华 北 地 区暴 发 Ｈ３ ６ １９ ］ Ｎ８亚 型 马 流感 ［ 。 ７ ］ 试剂 盒 等为 Ｓｇ ｉｍａ公 司 产 品 ； ＨＲＰ 羊 抗 鼠 Ｉ － ｇ购 自 ２０ ０ ７年 １ ０月 ， 华 北 地 区某 赛 马场 的 赛 马 也 发 生 在 中 国 惠 世 生 化 试 剂 有 限 公 司 ； ａ ｅ ｌｒＭ Ｐ ｅ — Ｐ ｇ ＲｕｅＴ ｒｓ 了 Ｈ３ Ｎ８亚 型马 流感 。 Ｊ ｔｉｅ ｒｔｉ ｒ ｅ 购 自Ｆ ｒ ｎａ 公 司 ， 分子 ａｎ ｄＰ ｏｅｎＭａｋ ｒ ｅｍｅ ｔｓ 低 马 流感 的实验 室血 清学诊 断 方 法 有血 凝 抑 制试 蛋 白质 量 Ｍａ ｅ 购 自上 海 生物 化 学 研究 所 ， ｋｒ 预染 蛋 验 （ ） 单 向辐射 溶血试 验 （ ＲＨ） 。。， 检 测结 ＨＩ 、 Ｓ 等［ 。其 白质 Ｍａ ｋ ｒ 自宝 生物工 程 （ ｒｅ 购 大连 ） 限公 司 。 有 果 确切 ， 是操 作 复 杂 ， 测 周 期 长 ， 要 测 定 被 检 但 检 需
２ ３ 抗体 亚类 鉴定 ．
积 分数 为 ５ 的 Ｃ 培 养箱 中培 养 。用 间 接 Ｅ ＩＡ Ｏ。 ＬＳ 被 抗 原 所
１ ２ 方 法 ．
马 匹急 性期 和恢 复期 的双 份 血 清 ， 隔期 为 １ ～ 间 ４ｄ
２ ， 抗体 升高 ４倍 以上 ， ０ｄ 如 即诊 断 为 Ｅ Ｖ 感 染［ Ｉ １ 。 由单 克 隆抗 体介 导 的血清 学方 法 是 最 有效 的检测 方 法 之～ ［］ 具 有 操 作 简 单 、 异 性 强 等 特 点 。本 研 １， 。 特
（． １ 吉林 出 入 境 检 验 检 疫 局 ， 林 长 春 １ ０ ６ ；． 林 省 磐 石 市 动 物 检 疫 站 ， 林 磐 石 １２ ０ ） 吉 ３０２２吉 吉 ３ ３ ０
摘
要： 以灭活马流 感病 毒 （ Ｉ Ａ／ ｑ ｉｅＪｌ ／ ／ ９ ９ Ｈ３ ） Ｅ Ｖ） Ｅ ｕｎ ／ｉｎ １ １ ８ （ Ｎ８ 为免 疫原 ， 疫 Ｂ ｌ／ 鼠 ， ｉ 免 ａ ｃ小 ｂ 经常规 细胞
作者简 介： 肖成蕊（ ９ ８ ， 山东费县人 ， １５ 一） 女， 高级兽 医师， 主要从 事兽医检 验检 疫工作。 ＊通讯作者
２
动 物 医学 进 展
２１ ０ １年
第３ ２卷
第 ６ （ 期 总第 ２ ６ ） １期
２ｍＬ Ｌ甲醛 灭活后 与 弗 氏完 全佐 剂 等体 积 乳 化 混 ／ 匀， 腹腔 和皮 下 分 别 注 射 雌 性 ８周 龄 Ｂ ｌ／ 小 鼠， ａｂ ｃ ０ ２ｍＬ 只 。以后每 间 隔两 周 用 等量 弗 氏不 完 全佐 ． ／ 强免 疫 ， 量 加倍 。 剂
用 于血凝 抑 制试验 ， 测抗 体滴 度 ， 凝抑 制 试验 方 检 血 法 按 照文献 ［ １ 进 行 ， １］ 并将 ＨＩ结 果 与 建 立 的 间 接
Ｅ Ｉ Ａ方 法获 得 的结果 与进行 比较 。 ＬＳ
经过 细胞融 合 、 间接 Ｅ ＩＡ 法和 ＨＩ Ｌｓ 方法 筛选 ，
获 得 ３ 株 能 稳 定 分 泌 Ａ Ｅ ｕｎ ／ ｉｎ １ １ ８ ／ ｑ ｉｅＪｌ ／ ／ ９ ９ ｉ （ Ｎ８ 株 病毒 特异 性 ｍＡｂ的杂 交 瘤 细胞 株 ， Ｈ３ ） 分别
封 闭过夜 ， Ｐ Ｓ 用 Ｂ Ｔ洗涤 ３次 ， 每次 ５ｒｉ ； 以制 备 ｎ再 ａ 的 ｍＡｂ为 一 抗 ，７ ℃孵 育 １ｈ 洗 涤 同 上 ； 抗 鼠 ３ ， 羊 ＩＧ ＨＲＰ １：１ ｏ ） ｇ－ （ ０ ｏ ｏ 为二 抗 ， ７℃孵 育 １ｈ 洗 涤 ３ ， 同上 ； 最后 用 Ｄ ＡＢ显 色 １ ｉ ， 去离 子 水 洗 涤 中 ５ｒ ｎ 用 ａ 止反应 ， 察结 果并 照相 。 观
等体积 的 白陶土悬 液混 匀 ， ４℃孵 育 ２ ｎ 期 间混 ０ｍｉ（
匀 ２次 ～３次 ） ４℃ 、 ０ ／ ｉ 心 １ ｉ ， ， １０ ０ｒｒ ｎ离 ａ ５ｒ ｎ 收集 ａ 上层血 清 ， 到原 血清 １： ０的稀 释液 ， 得 １ 此稀 释血 清