制备单克隆抗体的技术要点
单克隆抗体(McAb)制备注意事项
单克隆抗体(McAb)制备注意事项(一) 免疫动物的选择用于免疫的动物，应选择与亲本骨髓瘤细胞同一品系的动物，因为免疫动物品系和骨髓瘤细胞种系越远，融合的杂交瘤细胞越易发生免疫排斥反应，越不稳定。
目前使用的瘤细胞系，仍限于小鼠和大鼠的骨髓瘤细胞系，其中多来源于纯系BALB/c小鼠，所以要选择该系小鼠用作免疫动物，一般认为，为了减少盲目性，融合前，应测定免疫小鼠的抗体反应性，如果呈阳性，可供融合用，那些对特定抗原不产生血清抗体的小鼠，得不到特异的杂交瘤细胞。
一般选择8～12周龄，重约20g，健康无病的纯系小鼠，雌雄均可应用。
(二) 免疫方案1 抗原免疫用的抗原尽量设法提高其纯度，并保存其活性。
同样浓度的抗原，若含有较多的杂质，会明显影响抗体的产生，并为杂交瘤细胞分泌抗体的筛选带来麻烦，获得所需的分泌特异抗体的杂交瘤细胞的机率也低。
2 免疫小鼠一次免疫务必同时免疫几只小鼠，以免小鼠中途死亡。
每次注入抗原后，次日，小鼠会出现全身反应，体温升高、盗汗、耸毛等，此时对室温和饲养均需注意，以防小鼠死亡。
在融合前末次静注或腹腔注射时，谨防速发型过敏反应发生，而导致小鼠死亡。
3 不同抗原的免疫方法可溶性抗原，在初次免疫用明矾沉淀抗原100μg与2×109灭活百日咳杆菌混合皮下注射，间隔4～6周，用盐水抗原100～200μg 加强免疫，3天后取脾作融合；细胞抗原免疫，用2×107个细胞注入小鼠腹腔，间隔2～3周，再重复一次，3周后用同样数量细胞注入小鼠腹腔，3天后取脾作融合。
除上述常规免疫方法外，近年来还建立了脾内免疫法及体外细胞免疫法。
脾内免疫是将抗原直接注入小鼠的脾脏，具有抗原用量小及免疫周期短的优点；体外细胞免疫，是将抗原加入于体外培养的淋巴细胞中，使之形成免疫细胞。
(三) 融合剂PEG对细胞有毒性，一般采用分析纯规格。
浓度越高，对细胞的毒性越大。
以40%～50%的浓度为宜，pH值以80～82促融率最高。
单克隆抗体技术（文献综述）
文献综述—单克隆抗体技术的原理、发展与主要的实验步骤1. 单克隆抗体制备的基本原理经免疫的动物产生的致敏B淋巴细胞能分泌特异性的抗体，但这些细胞不能在体外长期存活；而骨髓瘤细胞则可以在体外大量地、无限地繁殖，但不能分泌特异性的抗体。
如果应用杂交瘤技术使骨髓瘤细胞与那些能分泌特异性抗体的细胞相融合，那么得到的杂交瘤细胞（hybridoma cell）将同时具有两种亲本细胞的特性：既能够象肿瘤细胞那样无限繁殖，又具有B淋巴细胞的不断分泌抗体的能力。
根据克隆选择学说，由于每个致敏的B淋巴细胞只能针对同一抗原决定簇产生同种的、完全一样的抗体，所以经过克隆化的杂交瘤细胞就能够分泌对某一抗原决定簇具有特异性的单克隆抗体。
这就是单克隆抗体制备的基本原理。
2. 单克隆抗体技术的诞生、发展和展望1975年，George Kohler 和 Cesar Milstein在Nature上发表了一篇文章，第一次描述了一种获得单克隆抗体的方法。
他们所创立单克隆抗体技术给免疫学乃至整个生物医学领域带来了一次巨大的革命。
Kohler 和Milstein 也因此而荣获1984年诺贝尔奖。
单克隆抗体技术诞生后，立即引起了许多研究者的注意，人们纷纷投入这一崭新领域的研究。
经过多年的发展，到二十世纪八十年代中期，单克隆抗体技术已日臻完善，单克隆抗体也开始广泛应用于生物医学研究和生物技术的各个领域，以及临床诊断和治疗的许多领域。
最初，单克隆抗体技术是以小鼠－小鼠杂交瘤为研究的中心而发展起来的。
由于小鼠源性的单克隆抗体在生产与应用中有其内在的缺点，八十年代后，小鼠－大鼠、大鼠－大鼠、小鼠－人以及人－人杂交瘤技术也被尝试并取得了不同程度的成功,有力地推动了单克隆抗体技术的发展和生物医学研究的深入。
尽管早有准备,单克隆抗体技术的影响之深远还是大大超出了人们的预想：在八十年代中到九十年代末的短短十多年中，为了满足临床诊断和治疗的需要，双特异性抗体技术及人－鼠嵌合抗体技术、人源化抗体技术、小分子抗体技术、植物基因工程抗体技术、抗体酶技术、抗体库(噬菌体显示）技术、外因鼠(XenoMouse)技术等基因工程抗体技术在经典单克隆抗体技术的基础上也被创立并得到了突飞猛进的发展。
单克隆抗体制备的主要技术
单克隆抗体制备的主要技术单克隆抗体制备的主要技术_______________________________单克隆抗体（Monoclonal Antibody，简称mAb）是一种特殊的抗体，它们可以特异性地识别抗原，并且具有极高的特异性和稳定性。
它们已经在临床治疗和诊断方面发挥了重要作用，因此单克隆抗体制备技术已成为生物医学研究的重要手段。
一、单克隆抗体制备的基本原理单克隆抗体制备的基本原理是将一种特定的抗原分子和一种抗原特异性的抗体分子连接起来，从而产生一种特定的单克隆抗体。
这种联合物可以由一种具有抗原特异性的单克隆抗体分子或多克隆抗体分子所表示。
单克隆抗体制备的基本过程可分为四个步骤：选择抗原；制备抗原；选择和培养单克隆抗体产生细胞；制备和纯化单克隆抗体。
1、选择抗原在进行单克隆抗体制备时，首先必须选择一种特定的抗原，以便于产生特异性的单克隆抗体。
常用的抗原来源有蛋白质、多肽、核酸、糖蛋白和合成化学物质。
2、制备抗原根据所选用的抗原，可采用不同的方法对其进行制备。
例如，蛋白质通常可以采用蛋白质表达或免疫原制备方法；多肽可以采用合成方法或者从天然蛋白质中分离出来；核酸可以采用合成方法或者从样品中分离出来；糖蛋白可以采用表达方法或者从天然蛋白质中分离出来；而合成化学物质可以直接合成。
3、选择和培养单克隆抗体产生细胞在单克隆抗体制备中，必须使用能够产生特异性单克隆抗体的产生细胞。
目前常用的单克隆抗体产生细胞包括B细胞、T细胞和流感株融合细胞。
在这些产生细胞中，B细胞是最常用的，因为它能够快速、有效地产生大量的特异性单克隆抗体。
4、制备和纯化单克隆抗体当B细胞产生了足够数量的单克隆抗体之后，就可以采用不同的方法将它们制备和纯化出来。
常用的方法包括浸出法、寡核苷酸酶切法、蛋白酶浸出法、杂交法和Ion-exchange chromatography。
这些方法可以帮助我们得到高度纯化的单克隆抗体。
二、单克隆抗体制备的优势单克隆抗体制备是一种高效、可靠的方法，它可以用来高通量地产生大量特异性的单克隆抗体。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）是指由单一B细胞克隆分离得到的抗体，其具有高特异性和高亲和力。
制备单克隆抗体的方法主要有杂交瘤技术和重组DNA技术。
以下是单克隆抗体制备的步骤及注意事项。
步骤一：抗原免疫1.选择合适的抗原：根据需要检测的分子或细胞表面标志物，选择合适的抗原。
2.免疫动物：常用的动物有小鼠、兔子等。
选择适合的动物后，根据抗原的种类和免疫动物对该抗原的敏感性，设计免疫方案。
3.免疫计划：免疫计划包括免疫剂量、免疫途径和免疫次数等。
通常先进行原位免疫，然后再以单体或混合抗原进行体内免疫。
步骤二：细胞融合1.收集脾细胞：在最佳时期，解剖免疫动物，取出脾脏。
2.细胞培养：将收集的脾细胞在无菌条件下分散成单个细胞，并在培养基中培养，以供细胞融合使用。
3.准备骨髓瘤细胞：选择合适的骨髓瘤细胞，例如NS0或SP2/0等。
将其培养至对数生长期。
4.细胞融合：在抗原刺激下，将脾细胞与骨髓瘤细胞以一定比例混合，用聚乙烯醇或其他化合物促进细胞融合。
步骤三：细胞筛选与扩展1. HT增重培养：用含有hprt缺陷的培养基筛选融合细胞，以选择杂交瘤细胞。
2. Limited Dilution扩展：以一细胞一孔的方式将杂交瘤细胞进行有限稀释，使其实现单克隆化。
3.细胞培养：将单克隆细胞株移植到培养瓶中，进行培养和扩增。
步骤四：单克隆抗体鉴定1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：用ELISA方法筛选单克隆细胞株，检测其抗原特异性。
2.免疫组织化学检测：将单克隆抗体应用于细胞和组织切片，检测其在特定细胞或组织中的反应。
3.流式细胞术：通过流式细胞仪检测单克隆抗体与特定细胞表面标志物的结合情况。
步骤五：单克隆抗体生产与纯化1.细胞培养：将单克隆细胞株培养扩增至一定程度。
2.抗体收集：将培养上清液进行抗体收集。
3.纯化与浓缩：利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等技术，对抗体进行纯化和浓缩。
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
简述单克隆抗体的制备原理
简述单克隆抗体的制备原理
单克隆抗体是指由单个B细胞克隆所产生的同一种抗体分子，具有高度特异性和亲和力。
制备单克隆抗体的方法有多种，其中最常用的是杂交瘤技术。
制备单克隆抗体的过程主要分为以下几个步骤：
1. 免疫动物
首先需要选取与目标抗原相关的免疫原来免疫动物，一般常用的免疫原包括蛋白质、多肽、糖类、细胞表面分子等。
免疫动物可以选择小鼠、大鼠、兔子等。
2. 分离B细胞
将免疫动物的脾脏取出，制备成单细胞悬液，然后通过离心、梯度离心等方法分离出B细胞。
B细胞是免疫系统中产生抗体的主要细胞类型。
3. 杂交瘤的制备
将B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
骨髓瘤细胞是一种白血病细胞，具有无限增殖的能力，但不产生抗体。
通过融合，可以将B细胞的抗体产生能力与骨髓瘤细胞的无限增殖能力结合在一起，形成具有两种细胞的特点的杂交瘤细胞。
4. 筛选单克隆抗体
将杂交瘤细胞进行分离和培养，筛选出产生特定抗原的单克隆抗体。
可以通过酶联免疫吸附试验、流式细胞术等方法鉴定和筛选出单克隆抗体。
5. 大规模制备和纯化
通过大规模培养杂交瘤细胞，可以得到足够数量的单克隆抗体，然后通过柱层析、电泳等方法对单克隆抗体进行纯化，得到高纯度的单克隆抗体。
总的来说，单克隆抗体的制备过程需要经过免疫动物、分离B细胞、杂交瘤的制备、筛选单克隆抗体和大规模制备和纯化等步骤。
这些步骤需要严格控制条件和技术，以确保制备出高质量的单克隆抗体。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
二、骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
三、细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
单克隆抗体的制备方法与应用
单克隆抗体的制备方法与应用一、前言单克隆抗体是指一种具有高度特异性和亲和力的抗体，其来源于单个B细胞克隆。
相比多克隆抗体，单克隆抗体更加纯净、稳定和可靠，因此在生物医学研究、诊断和治疗等方面有着广泛的应用。
本文将介绍单克隆抗体的制备方法与应用。
二、单克隆抗体的制备方法1. 免疫动物首先需要选取适当的动物进行免疫，通常选择小鼠或大鼠。
在进行免疫前需要对动物进行预处理，例如注射低剂量的抗生素来消除潜在的感染。
2. 免疫原选择选择合适的免疫原是制备单克隆抗体的关键步骤。
常见的选择包括蛋白质、多肽、细胞表面分子等。
在选择时需要考虑到其特异性、稳定性和可重复性等因素。
3. 免疫程序在进行免疫前需要对动物进行预处理，例如注射低剂量的抗生素来消除潜在的感染。
接着，将免疫原注射到动物体内，通常需要多次免疫以增强免疫效果。
在免疫过程中需要对动物进行监测，例如采集血样检测抗体水平。
4. 融合细胞的制备在获得足够的抗体后，需要从动物体内采集B细胞并与骨髓瘤细胞进行融合。
常用的骨髓瘤细胞包括SP2/0和NS0等。
5. 单克隆抗体筛选通过限稀法或单一细胞分离法等方法将融合细胞分离为单个克隆，并通过ELISA、免疫印迹等方法筛选出特异性较高的单克隆抗体。
接着对筛选出的单克隆抗体进行扩增和纯化等处理。
三、单克隆抗体的应用1. 生物医学研究单克隆抗体在生物医学研究中有着广泛的应用，例如作为特定蛋白质或分子的检测工具、用于药物开发和治疗等。
2. 诊断单克隆抗体在诊断方面也有着重要的应用，例如用于肿瘤标志物的检测、病原体的检测等。
3. 治疗单克隆抗体在治疗方面也有着广泛的应用，例如用于治疗癌症、自身免疫性疾病等。
其中一些单克隆抗体已经被批准为药物并用于临床治疗。
四、总结单克隆抗体是一种具有高度特异性和亲和力的抗体，在生物医学领域中有着广泛的应用。
其制备方法包括适当动物选择、合适免疫原选择、多次免疫程序、融合细胞制备和单克隆抗体筛选等步骤。
单克隆抗体制备操作方法及注意事项JEN
单克隆抗体制备操作方法及注意事项JEN无菌室清洁要求：1、进入无菌间，须更换白大褂，口罩、鞋套必须戴上，最好戴上帽子、手套；2、进去后用酒精棉球擦洗手；3、生物安全柜常见酒精棉球擦洗，擦后棉球不显黑；柜内垃圾当日及时清理；柜内所有实验操作应在酒精灯前进行；经常紫外杀菌；4、无菌间物件传递，经窗口紫外照射方可；5、有关试剂使用后及时用封口膜封住；6、细胞培养盖子旋松，以便二氧化碳气体进入；拿瓶、加液体均需注意瓶口，避免污染瓶盖；7、出门后需要用钥匙锁上；8、整个无菌间两周清洁一次；免疫动物：选择与瘤细胞同一品系的动物做为免疫对象，现在常见的是Balbc/c小鼠，6-8周龄，一种抗原一次性注射2-3只小鼠，小鼠不宜过大，雌性相对较好；首次注射抗原100微克与等体积弗氏完全佐剂混匀，在背部两侧皮下与腹腔分别注射，形成几个小泡；间隔两周左右时间（14天）二次免疫注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，一般上次背部小泡依然存在；间隔两周左右时间（14天）三免小鼠注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，一般上次背部小泡依然存在；间隔7-10天左右时间尾部采血测定抗体效价：方法一：手拇指和食指从背部抓住小鼠颈部皮肤，将小鼠头朝下，小鼠保定后将其尾巴置于50°热水中浸泡数分钟，使尾部血管充盈。
擦干尾部，再用剪刀或刀片剪去尾尖1～2mm，用试管接流出的血液，同时自尾根部向尾尖按摩。
取血后用棉球压迫止血并用6%液体火棉胶涂在伤口处止血。
每次采血量0.1ml。
方法二：固定小鼠，一人捏住小鼠耳朵固定小鼠，同时抓住尾梢协助取血，另一个人左手捏住小鼠尾巴根部，右手用酒精棉球擦洗，使尾部血管充盈，食指抵住尾巴，用一次性1ml注射器穿刺血管，用10微升移液枪及时吸取全血2.5微升，加在盛有97.5微升的PBS缓冲液中稀释10倍，再稀释一百倍，之后做倍比稀释测定效价，读数到阴性血清值的 2.1倍，合理效价应高于12.8万倍。
单抗体制备
单抗体制备引言单抗（monoclonal antibody）是指来源于单一克隆细胞的抗体，具有高度特异性和高亲和力。
单抗在医学、生物工程和疾病治疗等领域具有广泛应用前景。
本文将介绍单抗的制备方法，包括杂交瘤细胞制备、单克隆细胞培养和纯化等步骤。
一、杂交瘤细胞制备杂交瘤细胞是由B淋巴细胞（B lymphocyte）和骨髓瘤细胞（myeloma cell）融合而成的细胞系，具有无限增殖能力和产生单克隆抗体的能力。
制备杂交瘤细胞的步骤如下：1.1.采集B淋巴细胞从免疫动物（如小鼠）的脾脏或淋巴结中采集B淋巴细胞。
这些细胞是免疫系统中产生抗体的关键细胞。
1.2.准备骨髓瘤细胞选择一种骨髓瘤细胞系，如NS-1细胞或SP2/0细胞，作为杂交瘤的母细胞。
这些细胞具有无限增殖能力，适合用于制备杂交瘤细胞。
1.3.融合细胞将采集到的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞按照一定比例混合，加入聚乙二醇等融合剂，使细胞融合为杂交瘤细胞。
融合后的细胞称为杂交瘤。
二、单克隆细胞培养杂交瘤细胞具有无限增殖能力，但并不能产生单一的抗体。
为了获得单克隆抗体，需要对杂交瘤细胞进行单克隆化培养。
2.1.稀释培养将融合后的杂交瘤细胞进行稀释培养，使细胞以单个细胞的形式分散在培养基中。
这样可以使每个细胞形成一个单克隆。
2.2.筛选单克隆细胞将稀释后的杂交瘤细胞进行筛选，通常采用限稀稀释法或HTP法。
限稀稀释法是在培养基中加入一定浓度的杂交瘤细胞，使每个细胞在培养皿上形成单个克隆。
HTP法则是将杂交瘤细胞分装到96孔板中，每个孔中只有一个细胞，便于单克隆的筛选。
2.3.培养和扩增单克隆细胞将筛选出的单克隆细胞进行培养和扩增，可以使用无血清培养基，添加合适的生长因子和抗生素，促使细胞的生长和分裂。
三、单抗纯化经过单克隆细胞培养，可以得到大量的单克隆抗体，但其中还含有其他蛋白质和杂质。
为了获得纯净的单抗，需要进行纯化步骤。
3.1.采集培养上清将培养单克隆细胞的上清液收集起来，其中含有分泌的单克隆抗体。
3.细胞融合及单克隆抗体的制备
(3) 细胞融合： 50%PEG(400~1000), pH8.0, 37oC, 2min
3.融合细胞的筛选
融合后细胞混合液
HAT培养基
2 weeks later
HT培养基
1 week later
正常培养基
4.抗体的检测
常用方法：
要求： ➢ 简便、快速、敏感; ➢ 在短时间内能检测大量样品
+3.6ml M
150ul/孔
E、F、 G、H
调细胞浓度为1-5х103cell/ml 取100个cell于7.2ml完全培养液 (M)中
2个cell/孔
1个cell/孔
0.5个cell/孔
6.杂交瘤细胞的鉴定
染 色 体 核 型 分 析
大规模培养——批量生产单克隆抗体
常用的大规模培养方法：
动物接种法 转瓶培养法
溶液能产生最多杂交细胞。 PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。
PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿 需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过 程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG 可能对细胞有毒害。
PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有 轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋 白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间 形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促 使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动 性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。
电融合的基本过程：
细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液
中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过 溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶 极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项制备步骤如下：1.免疫原选择：选择具有免疫原性的抗原作为单克隆抗体制备的靶点。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类等。
2.动物模型选择：根据免疫原的性质选择适合的动物模型，如小鼠、兔子等。
应考虑动物模型对免疫原的免疫响应情况以及制备成功的单克隆抗体的应用价值。
3.免疫原注射：将免疫原注射到动物模型体内，通常通过多次注射来诱导免疫反应。
在注射前，可以选择适当的佐剂来增强免疫原的免疫原性，如完全弗氏佐剂或委氏佐剂。
4.混合细胞瘤的制备：在免疫原注射后，等待免疫反应充分发生。
细胞瘤可用于细胞融合，产生融合细胞并筛选单克隆抗体。
常用的细胞瘤包括SP2/0和NS-15.细胞融合：将免疫小鼠脾细胞和癌细胞融合成杂交瘤细胞。
融合的常见方法有聚乙二醇融合法和电融合法。
6.肿瘤细胞筛选：将融合细胞播种在含有选择剂的培养基上，通过选择剂来杀死未融合细胞和不产生抗体的融合细胞，留下产生单克隆抗体的细胞。
7.单克隆抗体筛选：对产生的单克隆细胞进行筛选，常用的方法有ELISA和细胞免疫荧光检测。
8.单克隆抗体培养：将筛选出的单克隆细胞进行扩增培养，获得大量的细胞。
9.单克隆抗体纯化：将培养得到的细胞培养上清进行蛋白A/G亲和层析柱纯化，获得纯化的单克隆抗体。
10. 单克隆抗体鉴定：通过Western blot、免疫组化或其它适当的方法对单克隆抗体进行鉴定，确定其特异性和亲和力。
注意事项如下：1.免疫原的选择应根据具体实验要求合理选择，确保其免疫原性和制备成功的单克隆抗体的应用价值。
2.在注射免疫原前，应充分考虑动物模型对所选择免疫原的免疫响应情况，并进行充分的预备实验和试验。
3.免疫小鼠注射免疫原时，需要严格控制免疫原注射的剂量和频率，以避免过度免疫导致不良反应。
4.细胞融合时，应根据实验要求选择合适的融合方法，并注意细胞融合的时间和条件，以获得高效的细胞融合率。
5.单克隆抗体筛选和鉴定时，应使用多种合适的方法进行综合评估，确保获得特异性和亲和力较高的单克隆抗体。
制备单克隆抗体的技术要点
制备单克隆抗体的技术要点1．交瘤技术的技术流程如图4-1所示。
图4 杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本流程2．技术要点1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。
免疫的方法取决于所用抗原的性质。
免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。
2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。
骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。
3）细胞融合融合是杂交瘤技术的关键一步，细胞融合应在无菌条件下，于室温或37℃水浴中进行。
瘤细胞与脾细胞之比为1：8～10，在l～2min内滴加50%PEG 1.0ml 边加边摇，静置1-2min。
然后再在2～3min内缓慢滴加无血清培养液，终止反应。
1000rpm离心10min。
最后加含20%小牛血清的HA T培养液。
将细胞混匀，接种于96孔培养板中培养，每孔加0．1ml，同时还加0．1ml的饲养细胞悬液。
4）阳性克隆的筛选应尽早进行。
通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。
检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。
具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。
常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。
其中ELISA 法最简便，RIA法最准确。
阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。
5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。
克隆化应尽早进行并反复筛选。
这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。
反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。
克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。
（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。
这种方法操作复杂，效率低，故不常用。
（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。
单克隆抗体的制备技术
单克隆抗体的制备技术单克隆抗体是一种特定的抗体，由同一种克隆的B细胞产生，并具有相同的抗原结合特异性。
这种抗体制备技术是通过将B细胞与瘤细胞融合而形成的杂交瘤细胞来实现的。
以下是关于单克隆抗体制备技术的详细解释。
1. 免疫原制备：要制备单克隆抗体，首先需要准备免疫原。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖脂或其他小分子化合物。
免疫原的选择基于所需抗体的特异性。
一般来说，免疫原应具有较高的纯度，并且能够激发免疫系统产生特定的抗体。
2. 免疫动物免疫：接下来，将免疫原注射到实验动物体内，以激发其免疫系统产生抗体。
常用的实验动物包括小鼠、大鼠或兔子。
在注射过程中，免疫原通常与佐剂混合以增强免疫反应。
注射免疫通常在一段时间内进行多次，以确保充分激发免疫系统产生抗体。
3. B细胞的筛选和融合：在动物免疫后，从其脾脏或骨髓中收集B细胞。
这些B细胞是产生抗体的主要细胞类型。
通过在培养基中培养，可以增加B细胞的数量。
然后，将这些B细胞与一种名为骨髓瘤细胞的癌细胞融合。
这种骨髓瘤细胞有着无限增殖的能力，而B细胞则提供了抗体生产所需的特定性。
4. 杂交瘤细胞的筛选：融合后的细胞形成了杂交瘤细胞。
这些细胞具有两个来源的特性，具有骨髓瘤细胞的无限增殖能力和B细胞的抗体产生能力。
为了筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞，可以使用细胞培养基中的特定抗原进行筛选。
只有与特定抗原结合的杂交瘤细胞才能存活和增殖。
5. 克隆的建立：经过筛选后，单个杂交瘤细胞被分离并单独培养，以建立纯化的单个细胞克隆。
这些克隆细胞会持续产生与免疫原结合的特定抗体。
这些单克隆抗体可以通过培养细胞并收集培养上清液来获取。
6. 单克隆抗体的纯化和特性分析：单克隆抗体的纯化是将其从其他细胞产物和杂质中分离出来。
这通常包括离心、过滤和亲和层析等步骤。
纯化后的抗体可以进行各种特性分析，如亲和性测定、特异性测定和功能性分析等。
这些测试可以验证抗体的特异性和效能。
总结：单克隆抗体的制备技术是一种通过将免疫的动物B细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞的方法。
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【原创】单克隆抗体研制最详细步骤5、杂交瘤细胞的冻存与复苏（1）杂交瘤细胞的冻存在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故，如停电、污染、培养箱的温度或CO2控制器失灵等给正在建立中的杂交瘤带来灾难，通常尽可能早地冻存一部分细胞作为种子，以免遭到不测。
在杂交瘤细胞建立以后，更需要冻存一大批，以备今后随时取用。
细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度（0℃——-20℃，每分钟下降1℃；-20℃——-40℃每分钟下降2℃），可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。
下面介绍我们实验室的细胞冻存方法，经几年来对多种细胞的使用，细胞复苏存活率均在80%以上。
A、材料：a. 带盖吸管筒一只（铝质或洋铁皮制），内壁（包括筒底和盖）衬1-2层石棉纸或石棉布。
b. 含10-20%血清、5-10% DMSO的HT培养基，冰浴降温至0℃左右（用作冻存液）。
c. 灭菌安瓶或带盖小瓶。
d. -70℃冰箱。
e. 液氮及液氮罐。
f. 处于对数生长中期、健康而活力好的杂交瘤细胞。
B、方法：a. 将杂交瘤细胞（或其他细胞）离心，重新悬浮于预冷的冻存液中，浓度为106-107左右/ml，分装安瓶，每瓶1ml，置冰浴上；安瓶上标明细胞名称、冻存日期、批号等。
b. 安瓶封口后仍置冰浴上。
c. 将安瓶放入一带收口绳的小布袋内，布袋上标明冻存号、细胞名称等，立即将布袋放入吸管筒内，置-70℃冰箱。
d. 2-4小时后或过夜后从-70℃冰箱取出吸管筒，将盛有细胞的布袋移入液氮罐；在布袋的线绳上作好标记或代码；最后在液氮冻存簿上作详细记录。
e. 液氮罐应定期补充液氮（最好是专人管理）；补充液氮及存取细胞时应带保护眼镜和手套，以免因液氮冻伤等。
（2）杂交瘤细胞的复苏杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。
简述利用杂交瘤细胞制备单克隆抗体的基本原理
简述利用杂交瘤细胞制备单克隆抗体的基本原理杂交瘤细胞制备单克隆抗体是一种重要的生物技术手段。
本文将介绍杂交瘤细胞制备单克隆抗体的基本原理、流程及其应用。
一、原理单克隆抗体是指来自同一B细胞克隆的抗体，它具有高度的特异性和稳定性，广泛应用于生物医学、生命科学和工业等领域。
杂交瘤细胞制备单克隆抗体的基本原理是将体外免疫的B细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，使其继承了B细胞产生抗体的能力和骨髓瘤细胞的不死性，从而长期稳定的产生单克隆抗体。
二、流程制备单克隆抗体的流程主要分为以下五个步骤：1. 免疫动物：将抗原注射于小鼠等哺乳动物体内，诱导其产生抗体。
2. 分离B细胞：从免疫动物体内获取脾脏，制备成单细胞悬浮液。
3. 融合细胞：将分离的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
4. 筛选杂交瘤细胞：用选择性培养液筛选并纯化杂交瘤细胞，使其长期稳定的产生单克隆抗体。
5. 鉴定鉴定单克隆抗体：对产生的单克隆抗体进行鉴定，并获取其蛋白质序列，以便制备大规模的单克隆抗体。
三、应用杂交瘤细胞制备的单克隆抗体已广泛应用于许多领域。
在医学上，单克隆抗体已成为重要的诊断和治疗工具。
例如，抗癌单克隆抗体可以选择性地靶向癌细胞，疗效显著。
在生命科学领域，单克隆抗体也广泛应用于分子生物学、组织学和免疫学等方面。
在工业领域，单克隆抗体可以用于生化工业、食品工业和环保等方面。
综上所述，杂交瘤细胞制备单克隆抗体是一种重要的生物技术手段。
它的原理简单、流程清晰，经过鉴定的单克隆抗体具有高度的特异性和稳定性，有着广泛的应用前景。
单克隆抗体的制备流程及基本原理
单克隆抗体的制备流程及基本原理
原理：在体液免疫反应中，一个抗原分子上可能含有许多抗原决定簇（即表位），每个淋巴细胞都会产生针对一个抗原决定簇的特异性抗体，若能把此B细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可得单一种类的抗体，只会对一种抗原决定簇反应，其专一性极高。
大量培养此细胞株，即可有质量一定、纯度均一的抗体，此即为单克隆抗体。
基本过程：先免疫动物，分离脾细胞，准备骨髓瘤细胞的准备，细胞融合，筛选与克隆融合细胞，最后大量制备单克隆抗体。
单克隆抗体制备简要流程
单克隆抗体制备简要流程
单克隆抗体制备是指由经过严格筛选的单一B淋巴细胞克隆所产生的免疫球蛋白。
与
多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更高的特异性和亲和力，常用于临床诊断、治疗和生物
学研究等领域。
1. 免疫原制备
选择适当的免疫原，如蛋白质、多肽、糖类、细胞表面标志物等，制备纯度高的免疫原。
2. 动物免疫
将免疫原注射到小鼠、大鼠、兔子、山羊等动物体内，使其产生抗体。
多次免疫可提
高抗体产量。
3. 获得脾细胞
动物免疫一定时间后，取获得抗体最高的动物的脾脏，制备成脾细胞悬液。
4. 杂交瘤细胞的制备
将获得的脾细胞与哺乳动物体系中的恶性肿瘤细胞进行杂交并筛选得到杂交瘤细胞。
杂交细胞的特点是具有脾细胞的免疫能力和长时间的生长能力。
5. 筛选单克隆抗体
使用ELISA、免疫印迹等技术检测杂交瘤细胞是否产生抗体。
筛选出产生单一种抗体
的细胞克隆。
将筛选得到的细胞克隆大量培养，并收集其分泌的单克隆抗体。
通过某些纯化技术，
如蛋白A、蛋白G亲和层析，将单克隆抗体制备成较纯的制剂。
7. 鉴定和应用
对制备好的单克隆抗体进行活性和特异性的检测，鉴定其性质和效力。
通过结构修饰
或复合其他物质，制备具有更高效能和生物学适应性的单克隆抗体，用于临床诊断、治疗、疫苗开发和科学研究等领域。
以上就是单克隆抗体制备的主要流程，这一技术的发明与发展给医学和生物科技领域
带来了重大的推动和创新。
单克隆抗体制备注意事项
单克隆抗体(McAb)制备技术1975年Khler和Milstein首次利用杂交瘤技术生产单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)获得成功，开创了免疫学和分子生物学研究的新纪元，被人们誉为“免疫学中的一场革命”，该项技术具有巨大生命力和发展前景，目前已被成功地用于分子生物学、免疫学、细菌学、病毒学、生物化学、遗传学、药物学等许多领域的研究。
下面以抗空肠弯曲菌共同抗原McAb的制备为例，介绍McAb的制备技术。
一、材料和方法(一) 材料1 PRMI1640培养液 PRMI1640培养基粉104g，双蒸馏水1000ml，抽滤或高压蒸气灭菌，每瓶80ml分装。
2 完全PRMI1640培养液 PRMI1640培养液80ml,1mol/L Hepes2ml,0.2mol/L谷氨酰胺1ml，青、链霉素溶液(1000u/ml)1ml，灭活小牛血清20ml。
3 次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT母液×100)次黄嘌呤1361mg，胸腺嘧核苷387mg，蒸馏水加至100ml。
在45～50℃水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。
4 氨基喋呤(A母液×100)氨基喋呤176mg，蒸馏水90ml，1mol/L NaOH 0.5ml，加蒸馏水至100ml，再加0.5ml 1mol/L HCl中和，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。
5 HAT选择性培养基完全PRMI1640培养液100ml,100×HT母液1ml，100×A母液1ml。
用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。
6 HT培养液完全RPMI1640培养液100ml，100×HT母液1ml。
用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。
7 50%聚乙二醇(PEG)溶液将PEG(MW4000)放在试管内加盖，121.3℃高压蒸气灭菌20min。
使用前加入等量的pH值8.2无血清培养液，置56℃混合，直至完全溶解，移置37℃备用。
单抗生产工艺及原理
单抗生产工艺及原理
单抗生产工艺是指生产单克隆抗体的过程，其主要原理是利用免疫学技术和生物工程技术，通过体外培养和筛选，获得具有高度特异性和亲和力的单克隆抗体。
单抗生产工艺一般包括以下几个步骤：
1. 免疫动物：将抗原注射到动物体内，刺激其免疫系统产生抗体。
一般采用小鼠或兔子作为免疫动物。
2. 细胞融合：将免疫动物的脾细胞与肿瘤细胞（如骨髓瘤细胞）进行融合，形成杂交瘤细胞。
3. 筛选：通过筛选技术，筛选出具有高度特异性和亲和力的单克隆抗体阳性细胞系。
4. 克隆化培养：将单克隆抗体阳性细胞系进行克隆化培养，使其快速增殖并产生大量单克隆抗体。
5. 分离纯化：将培养液中的单克隆抗体分离纯化，得到高纯度的单克隆抗体。
6. 制剂：将单克隆抗体进行制剂处理，如灭菌、稀释等，制备成最终产品。
单抗生产工艺的关键在于筛选出具有高度特异性和亲和力的单克隆抗体，这需要利用免疫学技术和生物工程技术，结合细胞融合和克隆化培养等手段，进行高效的筛选和纯化。
单抗生产工艺的成功应用，为单克隆抗体的广泛应用提供了
重要的技术支持。
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制备单克隆抗体的技术要点
1．交瘤技术的技术流程
如图4-1所示。
图4 杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本流程2．技术要点
1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。
免疫的方法取决于所用抗原的性质。
免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。
2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。
骨髓瘤细胞
用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。
3）细胞融合融合是杂交瘤技术的关键一步，细胞融合应在无菌条件下，于室温或37℃水浴中进行。
瘤细胞与脾细胞之比为1：8～10，在l～2min内滴加50%PEG 1.0ml 边加边摇，静置1-2min。
然后再在2～3min内缓慢滴加无血清培养液，终止反应。
1000rpm离心10min。
最后加含20%小牛血清的HAT培养液。
将细胞混匀，接种于96孔培养板中培养，每孔加0．1ml，同时还加0．1ml的饲养细胞悬液。
4）阳性克隆的筛选应尽早进行。
通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。
检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。
具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。
常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。
其中ELISA 法最简便，RIA法最准确。
阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。
5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。
克隆化应尽早进行并反复筛选。
这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。
反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。
克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。
（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。
这种方法操作复杂，效率低，故不常用。
（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定
的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。
第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。
由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。
应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义的细胞。
（3）软琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。
在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的。
但此法不如有限稀释法好。
（4）荧光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞，然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞，并进行单细胞培养。
6）细胞的冻存与复苏细胞冻存与复苏的总原则是缓慢冷冻和快速复苏，反之则容易导致细胞内的冰晶形成。
细胞株用5%～10%甘油或二甲基亚砜(DMSO)为保护剂，并含有高浓度(40%～60%)的小牛血清，在液氮中保存。
细胞悬液以10C～30C / 分的速度降温，15～20分钟后放入液氮罐的气室中，以100C / 分的速度降温至-1000C～-1500C，3～4个小时后快速放入液氮中。
复苏时，将存有冷冻细胞的试管直接放入370C～400C的水浴中迅速解冻，然后在解冻的试管中快速加10ml的新鲜培养液，离心去除冷冻剂，再加含小牛血清的新鲜培养液进行培养。
7）单克隆抗体的制备大量生产单克隆抗体的方法可分为体内和体外两大类，目前仍以体内法为主。
先给小鼠腹腔注射降植烷(pristane)
造成无菌性腹膜炎，7～14天后将l×106个杂交瘤细胞悬浮于0．5 ml 生理盐水中，并注入小鼠腹腔。
10～14天后即可从小鼠腹水中获得高浓度的单克隆抗体。
8）单克隆抗体的纯化与保存
（1）亲和层析法本法的成本高而效率低，故比较少用，但用本法获得的产品纯度高。
（2)中性盐沉淀法小鼠腹水在40C下，2000×g离心20分钟，去除纤维蛋白、不溶性颗粒、以及表面的脂肪层。
然后向上清中滴加等体积的pH = 7～8的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，然后静置4～6小时。
离心后取沉淀物再用半饱和硫酸铵溶液洗两次。
最后将沉淀溶于少量PBS中，并直接用PBS透析。
（3)离子交换层析法小鼠腹水在40C下，2000×g离心20分钟，去除纤维蛋白、不溶性颗粒、以及表面的脂肪层后，对0.02M Tris、0.1M NaCl、pH = 8.4的缓冲液(含0.02%叠氮钠) 40C下充分透析。
然后将其加至经同一缓冲液平衡的DEAE-Sepharose CL6B离子交换柱，用该平衡液洗脱，分管收集并测OD280值。
一般情况下，单克隆抗体集中在第一峰中。
虽然有时出现第二峰，但该峰常无抗体活性。
（4）凝胶过滤法用Sephadex G200或Sephacryl S300进行层析。
此法主要用于IgM类单克隆抗体的纯化。
（5)Protein A-Sepharose CL4B层析本法适用于IgG1 和IgM类单克隆抗体的纯化。
纯化后的单克隆抗体最好保存在0.3M NaCl- 0.04%NaN3 -0.03M 6-氨
基己酸的环境中。
在此环境中，40C下可保存数月。
有条件时在上述环境中冷冻干燥保存。
9）单克隆抗体的鉴定
（1）纯度的鉴定：可用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等方法进行纯度的鉴定。
单克隆抗体在SDS-PAGE上表现为一条区带，但在等电聚焦电泳上并不是一条区带。
王世中等报告，纯化后的单克隆抗体在等电聚焦电泳上表现为三条区带。
在等速电泳上，单克隆抗体表现为一个主峰，而多克隆抗体则表现有4～5各主峰。
目前认为这一指标可作为区别单克隆抗体和多克隆抗体快速而灵敏的方法。
（2）免疫球蛋白及其亚型的鉴定：可用兔抗小鼠各类别及其亚型的抗血清进行鉴定。
常用的方法是免疫扩散试验。
（3）抗原决定簇属性的鉴定：可用RIA法或ELISA法进行鉴定。
用同位素(或酶)标记一个抗体，另一个不标记。
当两个抗体同时与抗原作用时，如有明显的竞争现象，说明是两个不同抗原决定簇的单克隆抗体，否则就是一个。
（4）特异性的鉴定：与多克隆抗体相同，也是用交叉反应率表示。
（5）亲和力的鉴定：与多克隆抗体相同。
10）杂交瘤细胞染色体的鉴定：杂交瘤细胞应为整倍体细胞，所以染色体的数目应成倍的增加。
3．影响杂交瘤技术的因素
影响杂交瘤技术的因素主要有如下几个方面:
1）试剂和器材所有应用的试剂如水、培养基、融合剂(PEG等)、胎牛或小牛血清等，最重要的是血清和融合剂，应用前都必须经过严格的筛选。
2）培养技术在培养技术方面重要的是保证无菌操作，避免污染，其中最常见和最严重的是支原体污染和真菌污染。
因此，应确保工作台、培养箱以及各种用具的清洁消毒。
所有用具均应高压灭菌后使用。
3）早期克隆化克隆化应早期进行，以避免无关细胞克隆过度生长。
有些克隆在低细胞密度时生长较差，此时加适量的饲养细胞、使用高质量的胎牛血清可能有帮助。
在克隆化过程中，应保留所有可能有意义的细胞，以便作进一步的克隆化和检查，避免杂交瘤细胞的丢失。