最新单克隆抗体制备方案
单克隆抗体制备方法(全)
单克隆抗体制备方法1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。
主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。
其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。
此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。
方法动物的选择与免疫1. 动物的选择BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2. 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
单克隆抗体的制作流程
单克隆抗体的制作流程一、前期准备工作1. 确定目标抗体：根据研究需求确定需要制备的单克隆抗体。
2. 筛选免疫原：选择适合的免疫原，如蛋白质、多肽、细胞等。
3. 动物选择：选择适合的动物，如小鼠、大鼠、兔子等。
4. 免疫计划设计：设计出合理的免疫计划，包括免疫剂量、次数、间隔时间等。
二、免疫过程1. 免疫原制备：将所选的免疫原纯化或合成后进行检测和确认。
2. 免疫动物注射：将免疫原与佐剂混合后注射到动物体内，按预定计划进行多次注射。
3. 血清采集：在最后一次注射后采集动物血清，检测抗体滴度是否达到预期水平。
三、杂交细胞制备1. 细胞系选择：选择适合的细胞系如SP2/0或NS0等。
2. 细胞培养：将细胞系培养至稳定生长状态，并进行筛选和确认。
3. 细胞融合：将免疫小鼠脾细胞与SP2/0或NS0细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤筛选：利用HAT培养基对杂交瘤进行筛选，筛选出产生单克隆抗体的杂交瘤。
四、单克隆抗体制备1. 单克隆细胞培养：将单个杂交瘤细胞进行单克隆分离和培养。
2. 单抗酶标法检测：利用ELISA等技术检测单克隆抗体的特异性和亲和力。
3. 大规模培养：将筛选出的单克隆细胞进行大规模培养，得到足够多的单克隆抗体。
4. 纯化和鉴定：通过亲和层析、离子交换层析等技术对单克隆抗体进行纯化，并进行质量鉴定。
五、应用1. 体外实验应用：如ELISA、Western blotting等技术中作为检测试剂使用。
2. 体内实验应用：如流式细胞术、组织切片染色等技术中作为荧光标记或特异性结合试剂使用。
3. 临床应用：如治疗肿瘤、自身免疫性疾病等方面的治疗药物。
六、总结单克隆抗体的制备流程包括前期准备工作、免疫过程、杂交细胞制备、单克隆抗体制备和应用等环节。
其中，前期准备工作和免疫过程是制备成功的关键，而单克隆抗体制备需要经过多次筛选和鉴定才能得到高质量的单克隆抗体。
单克隆抗体在医学和生命科学领域有着广泛的应用前景，对于推动科学发展具有重要意义。
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程单克隆抗体是一种来源于单一B细胞克隆的抗体，具有高度的特异性和亲和力，被广泛应用于生物医药领域。
其制备流程主要包括免疫原制备、动物免疫、细胞融合、筛选和鉴定等步骤。
下面将详细介绍单克隆抗体制备的流程。
1. 免疫原制备。
首先需要准备纯化的抗原蛋白，可以是蛋白质、多肽、细胞膜蛋白等。
抗原蛋白的纯度和活性对单克隆抗体的制备至关重要，因此需要进行严格的纯化和活性检测。
通常采用亲和层析、离心、电泳等方法进行抗原蛋白的提取和纯化。
2. 动物免疫。
将纯化的抗原蛋白注射到小鼠或兔子等动物的体内，诱导其产生特异性抗体。
在免疫过程中，需要注意控制免疫程序，监测抗体滴度，以及合理调整免疫方案，以提高单克隆抗体的产量和质量。
3. 细胞融合。
从免疫动物中获取脾细胞或骨髓细胞，与骨髓瘤细胞（如SP2/0、NS-1等）进行融合，得到杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有较高的产抗体能力，能够长期稳定地分泌单克隆抗体。
4. 筛选和鉴定。
通过ELISA、免疫印迹、细胞免疫荧光等方法对杂交瘤细胞培养上清液进行筛选和鉴定。
筛选出特异性较强的单克隆抗体阳性杂交瘤细胞，并进行亚克隆的鉴定，最终获得单克隆抗体细胞株。
5. 扩大培养和纯化。
将筛选出的单克隆抗体细胞株进行扩大培养，获得大量的单克隆抗体上清液。
然后采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等方法对单克隆抗体进行纯化，获得高纯度的单克隆抗体制剂。
总结。
单克隆抗体制备流程是一个复杂而又精细的过程，需要在每个环节都严格控制条件，确保单克隆抗体的产量和质量。
通过上述步骤的实施，可以获得高效、高纯度的单克隆抗体，为生物医药领域的研究和应用提供有力支持。
单克隆抗体药物生产工艺流程
单克隆抗体药物生产工艺流程单克隆抗体药物生产那可是个很有趣的事儿呢。
咱先说说细胞构建这一块。
这就像是搭积木的第一步，要找到合适的细胞来生产咱们想要的单克隆抗体。
得从一些特殊的细胞系开始，这些细胞系就像是一个个小小的工厂原料，经过各种基因工程的魔法，把生产抗体的基因给它整合进去。
比如说，把那些能编码特定抗体的基因放进细胞的基因组里，就像给这个小工厂安装上了专门生产某种产品的机器。
这个过程需要特别精细，就像给一个超级精密的手表装零件似的，稍微差一点都不行。
细胞构建好了，就到了细胞培养的阶段啦。
这时候的细胞就像是一个个小婴儿，得给它们提供特别舒服的环境才能茁壮成长。
要有合适的温度，就像我们人感觉最舒服的温度那样，大概是37摄氏度左右呢。
还要有合适的营养物质，这就好比是给小婴儿喂的各种奶粉、辅食之类的。
像葡萄糖、氨基酸这些都是细胞宝宝爱吃的东西。
而且呀，这个环境还得特别干净，一点点污染都不能有，就像咱们住的房子，要是到处是灰尘垃圾，肯定住着不舒服，细胞也是一样的道理。
再说说收获这个环节吧。
等细胞培养到一定的阶段，就像果子成熟了一样，可以收获了。
这时候要把细胞从培养的环境里弄出来，可不能太粗鲁了，得小心翼翼的。
就像摘花一样，要是太用力，花就被弄坏了。
收获后的细胞里就含有咱们想要的单克隆抗体啦。
然后就是纯化的过程。
这就像是从一堆宝藏里把最珍贵的那颗钻石挑出来。
细胞里有各种各样的东西，但是咱们只想要单克隆抗体。
纯化就是用各种高科技的方法，把抗体和其他的杂质分开。
比如说利用抗体和一些特殊物质的亲和力不一样，就像磁铁吸铁一样，把抗体吸附出来，把其他东西留在一边。
最后就是制剂这一步啦。
纯化好的单克隆抗体还不能直接用呢，得把它做成合适的剂型。
就像咱们把面粉做成面包、面条一样。
可以做成注射液之类的剂型，这样就能方便地给病人使用啦。
这个过程也要注意很多细节，像药物的稳定性、无菌性这些都是必须要保证的。
制备单克隆抗体的流程
制备单克隆抗体的流程首先呢，得免疫动物。
就是要给动物注射特定的抗原哦。
这个抗原的选择可重要了呢！我觉得这一步得好好考虑清楚，要根据你想要得到的单克隆抗体的特性来选抗原。
你可别随便就选一个呀！当然啦，不同的动物对不同抗原的反应可能不太一样，这就需要你有点经验或者多做些小试验来确定啦。
接下来，就是取免疫后的动物细胞啦。
一般是取脾脏细胞，这一步要小心点哦！因为脾脏这个器官比较脆弱，要是不小心弄坏了，可能会影响后面的实验呢。
不过也不用太紧张，只要按照基本的操作规范来就好。
然后呢，要把取出来的细胞和骨髓瘤细胞融合。
怎么融合呢？这就用到一些特殊的试剂啦。
这一步呀，我觉得在操作的时候要特别细致。
根据我的经验，融合的条件得控制好，像温度啊、试剂的浓度啊这些，要是稍微有点偏差，可能融合的效果就不太理想了。
融合之后呢，就有了杂交瘤细胞啦。
这时候要进行筛选哦。
为什么要筛选呢？因为我们只想要得到那些成功融合的细胞呀！这一步可不能马虎，要把那些没融合好的细胞或者其他杂质细胞去掉。
这个筛选的方法有好几种呢，你可以根据自己实验室的条件和习惯来选择，我觉得这环节可以根据实际情况自行决定。
筛选出杂交瘤细胞后，就是克隆化培养啦。
这一步很关键呢！要让这些细胞不断地繁殖，得到足够多的细胞。
刚开始可能会觉得这个过程有点漫长，不过习惯了就好了。
在这个过程中，要注意细胞的生长状态，给它们提供合适的生长环境，像营养物质啊、温度啊、湿度这些都得照顾到。
最后呢，就是要检测单克隆抗体啦。
看看你得到的抗体是不是你想要的那种。
这一步要特别注意！小提示：别忘了最后一步哦！要是前面都做对了，最后却没检测好，那可就有点亏啦。
好啦，这就是制备单克隆抗体的大致流程啦。
当然啦，在实际操作过程中，可能会遇到各种各样的小问题，但只要多做几次，积累经验，就会越来越熟练的。
希望大家都能顺利制备出自己想要的单克隆抗体哦！。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程
一、抗体cDNA克隆
2、结合分离：抗体和抗原之间采用免疫学方法，进行亲和结合分离，在病理学中，可以采用细胞亲和免疫电泳或者细胞色素紧缩技术来进行识
别性结合分离抗体。
3、mRNA提取：使用RNAsy Plus Kit根据操作说明提取亲和结合分
离后的抗体的mRNA，用于cDNA合成。
4、cDNA合成：使用双链cDNA合成试剂盒，根据说明书操作，将mRNA合成双链cDNA。
5、克隆：将双链cDNA进行克隆，经过构建的一系列步骤，最终将cDNA克隆到载体上，构建出抗体cDNA克隆库。
二、抗体cDNA克隆抗体制备
1、选择克隆体：选择抗体cDNA克隆库中的抗体表达克隆，采用PCR
技术进行选择，并检测克隆体具有良好的免疫特性，可以快速确定最佳克
隆体。
2、表达载体构建：将最佳克隆体插入到表达载体中，构建出属于克
隆体的表达载体，以此保证克隆体的正确表达。
3、表达系统筛选：利用多种表达系统，筛选出最佳的表达系统，以
此来达到最佳的表达效果。
4、表达调控：对于最佳的表达系统，根据cDNA克隆体的特性，进行
最佳的表达调控，以此达到最佳的抗体表达效果。
单克隆抗体制备方法
单克隆抗体制备方法
1. 嘿，你知道单克隆抗体制备第一步是啥吗？就好像搭房子得先有稳固的地基呀，这第一步就是免疫动物。
比如给小老鼠打上特定的抗原，让它的免疫系统开始行动起来！
2. 然后呢，就要融合细胞啦！这就像把两种不同的力量汇聚在一起，产生奇妙的反应。
像骨髓瘤细胞和免疫细胞的融合，多神奇呀！
3. 筛选阳性克隆，哇哦，这可是个精细活儿呀！就好像在一堆沙子里找出金子一样不容易呢。
比如说在众多细胞中找出能产生我们需要抗体的那一个。
4. 接下来得克隆化培养啦！这就好似精心呵护一棵小树苗，让它茁壮成长。
把筛选出来的细胞好好培养，让它不断繁殖。
5. 扩大培养也很重要哟！这不就像把一个小团队发展成一个大部队嘛。
让细胞数量大量增加，为后面做准备。
6. 单克隆抗体的收集，哇，终于等到这一刻啦！就像收获辛勤劳作后的果实一般让人开心呀。
把产生的抗体收集起来。
7. 之后还得对抗体进行鉴定呢，这难道不像是给一件宝贝做个全面检查，看看它是不是真的厉害。
比如检测它的特异性啥的。
8. 纯化抗体也是必不可少的步骤呀，这就好比把杂质去掉，只留下最纯净的精华，让抗体更加好用。
9. 最后可别忘记保存抗体哦，要好好地保护起来，让它随时能发挥作用。
就像把宝贝放在一个安全的地方。
我的观点结论：单克隆抗体的制备真的是一个很神奇的过程，每一步都至关重要，需要我们认真对待才能得到好用的单克隆抗体呀！。
单克隆抗体制备方法
杂交瘤细胞产生 单克隆抗体示意图
单抗与多抗
性 质
常规血清抗体
单克隆抗体
抗体含量
少 μg/ml
多 mg/ml
无关的Ig
多
少或几乎无
其它血清蛋白
有
少，培养物上清常有10％胎牛血清
Ag-Ab结合
免疫原的全部成分的全部抗原决定簇
免疫原中的一种成分的一个抗原决定簇
特异性亲和力的重复性
不同批号间有变化
无变化
从液氮罐中取出安瓶立即放37℃水浴中速溶。
01
无菌操作打开安瓶，取出细胞悬液，转入组织培养瓶。
02
逐滴缓慢加入20％FCS－1640培养液3.5ml，这个过程延续3min。
03
5％CO2饱和湿度，37℃培养。
04
4h后弃去培养液上清，加入新鲜的20％FCS－1640培养液。
05
继限稀释法
五、杂交瘤细胞的克隆化
1
2
3
4
5
04
六、单克隆抗体的鉴定
体内接种杂交瘤细胞，制备腹水。
七、单克隆抗体的大量生产
腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。
与其它抗原的交叉反应
与带有共同抗原决定簇的抗原有部分交叉
一般无。结合到共同决定簇则是完全的
免疫球蛋白的种类与亚类
完全是混合的
只是一种或几种
免疫球蛋白的物理性质
典型光谱
抗体的单一性质
主要步骤包括：
（1）抗原制备；
单克隆抗体制备实验步骤
单克隆抗体制备实验步骤
嘿，咱今儿就来唠唠单克隆抗体制备实验这档子事儿哈！
首先呢，得选个好苗子，就像咱挑水果得挑个水灵的，这就是要选对细胞啦。
把咱要的免疫细胞找出来，这可是关键的第一步哟！
然后呢，把这些小家伙放到合适的环境里，让它们好好长。
就好比给花浇水施肥，得让它们茁壮成长呀。
接着呀，得让这些细胞和骨髓瘤细胞来个亲密接触，这就像一场特别的相亲会，得找到最合适的那一对。
这可不是随便凑凑就行的，得精心挑选呢。
之后呢，把它们放在一块儿培养，看着它们融合在一起，就好像看到了新的希望诞生啦。
再然后，就得筛选啦！把那些不符合要求的淘汰掉，留下最棒的融合细胞。
这就像选秀比赛，只有最出色的才能留下来。
接下来，把这些选出来的宝贝们放到合适的地方继续培养，给它们提供最好的条件，让它们不断繁殖。
再往后，还得检测检测它们的能力呢，看看是不是真的厉害。
这就像考试，得检验一下真本事。
等确定了它们确实是我们想要的，那就可以大量生产啦！就像工厂生产产品一样，源源不断地制造出我们需要的单克隆抗体。
你想想，这过程多像培育一个小生命呀，从最开始的挑选，到精心呵护，再到筛选出最优秀的，最后让它发挥大作用。
这单克隆抗体制备实验可不简单，但要是做好了，那可真是了不起呀！它能帮我们解决好多难题呢，在医学、生物学等好多领域都大有用处。
所以呀，可别小瞧了这一系列步骤，每一步都得认真对待，就像对待一件珍贵的宝贝一样。
咱得有耐心，有细心，才能让这个实验成功呀！大家都加油吧，让我们一起在单克隆抗体制备实验的道路上越走越远，创造出更多的奇迹！怎么样，是不是觉得很有意思呀？。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程一、免疫准备1）试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂2）常用免疫原：纯化蛋白、融合蛋白、多肽。
3）耗材：1ml、2ml注射器，橡胶管，1.5ml EP管，刀片（或毛细玻璃管），酒精棉球。
4）免疫动物：小鼠（BALB/c,雌性6-8周）5）乳化器（或者手动推）二、免疫过程1）免疫前取血取血方式：酒精棉擦拭尾部后（酒精多了伤口挤压出来的血液易分散），用锋利的刀片在小鼠尾部靠近静脉处划开小口，如下图箭头所示方向从上往下挤压血管，血从伤口处流出后用枪吸取放入EP管中（30ul血够用）离心取上清放冰箱备用。
此方法取血最为简单易行，避免眼球取血毛细管扎瞎老鼠眼睛。
注意点：①避免切断老鼠尾巴②切口劲量靠近尾末端，方便挤压血管③伤口消毒酒精不要太多，不利于伤口血液凝固。
2）免疫原制备：一支2ml注射器吸抗原，另一支注射器吸等量体积佐剂，橡胶管连接两支注射器来回推几下混匀，然后放乳化器上乳化（为防止蛋白变性，乳化器上可放置冰袋），大约来回推1500次左右可乳化完全（滴一小滴到静水中若不扩散说明乳化完全）。
换上1ml注射器针头免疫小鼠（2ml注射器免疫不好控制，可将乳化液转移到1ml注射器中免疫，但这样会损失部分抗原）。
注：①每只老鼠免疫蛋白量10-100ug,初次免疫参考量50ug蛋白/只，加强免疫及融合前冲击免疫25ug蛋白/只。
初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，融合前冲击免疫不使用佐剂可用缓冲液如PBS等稀释抗原（如果需要）。
②免疫量100ul-300ul/每只小鼠。
③多点免疫，一针不要打太多。
3）免疫方式和免疫时间根据免疫原决定免疫方式，皮下免疫和腹腔注射较为常见(纯化蛋白、融合蛋白多肽)。
皮下注射免疫，免疫时间间隔为2周，第三次免疫一周后（8-10d）采血测效价，决定是继续加强免疫还是冲击免疫后做融合。
较好的效价应该在10W以上，附表1 免疫接种时间表天数操作佐剂免疫方式0 初次免疫CFA 皮下14 第二次免疫IFA 皮下28 第三次免疫IFA 皮下36-38 收集血清测效价＿＿42 第四次免疫（如果需要）IFA 皮下50 收集血清测效价＿＿52 融合前冲击免疫＿腹腔55 收获脾细胞和融合＿＿注：如果第四面免疫血清效价仍然达不到要求可以继续加强免疫，如果免疫超过6次仍然达不到要求免疫基本失败。
单克隆抗体制备的具体步骤
单克隆抗体制备的具体步骤
嘿，咱今儿就来唠唠单克隆抗体制备的那些事儿！
你想啊，要制备单克隆抗体，就像盖一座特别的房子。
第一步呢，
得选好材料呀，这就好比选建房子的砖头和瓦片。
咱得先找到合适的
抗原，这抗原就像是房子的基石，得稳稳当当的呢。
然后呢，就该让免疫细胞出马啦！把抗原注射到小鼠体内，让小鼠
的免疫系统动起来，产生抗体。
这小鼠啊，就像个勤劳的小工匠，努
力地工作着。
接着，等小鼠的免疫系统被激发得差不多了，就把它的脾脏取出来。
这脾脏就像是个藏宝库，里面有好多我们需要的宝贝细胞呢。
把脾脏
细胞弄出来后，再和骨髓瘤细胞融合在一起，这融合的过程就好像两
种不同的材料要完美结合在一起，变成一种全新的、更厉害的东西。
融合之后，可不是所有的细胞都能用哦，得经过筛选才行。
这就好
比在一堆沙子里找金子，得仔细挑挑拣拣呢。
把那些能产生我们想要
的抗体的细胞选出来，其他的就淘汰掉。
选出来的细胞还得培养呀，给它们提供一个舒适的环境，让它们好
好长大，多多生产抗体。
这就像照顾小树苗，得给它浇水、施肥，让
它茁壮成长。
最后，经过一系列的步骤，我们就能得到我们心心念念的单克隆抗体啦！这抗体就像是我们盖房子最后的成品，坚固又好用。
你说这单克隆抗体制备是不是很神奇？它就像是一个魔法的过程，把一些看似普通的东西，通过一系列复杂的操作，变成了非常有用的宝贝！这过程虽然有点复杂，但每一步都充满了惊喜和挑战呢。
咱要是能把这单克隆抗体给制备出来，那可真是了不起呀！你难道不想试试吗？。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程首先，在单克隆抗体制备之前，需要选择一个适当的抗原。
抗原可以是蛋白质、多肽、糖类或其他小分子。
选取抗原时，需要考虑抗原的表达水平、抗原的免疫原性以及抗原的稳定性等因素。
接下来，选择一个合适的实验动物进行免疫。
常用的实验动物有兔子和小鼠。
在免疫之前，需要先给实验动物注射适量的佐剂，以增强免疫效果。
通常，实验动物会被多次免疫，每次免疫之间有一段时间的间隔。
在实验动物免疫一段时间后，可以进行细胞融合以产生混杂瘤细胞。
混杂瘤细胞通常是由B细胞和骨髓瘤细胞融合而成，对于小鼠骨髓瘤细胞，常用的有SP2/0和NS0细胞系。
融合的方法主要有两种：一种是将免疫细胞和骨髓瘤细胞混合，然后使用聚乙二醇（PEG）进行融合；另一种是使用电击脉冲进行细胞融合。
融合细胞会经过适当的培养条件进行筛选和扩增。
在融合细胞扩增过程中，会进行筛选以保证融合细胞是产生单克隆抗体的。
最常用的筛选方法是酶联免疫吸附测定（ELISA）。
抗原会被固定在微孔板上，然后将培养液中的细胞涂覆在孔中。
如果其中一孔中有抗体分泌，则抗原会被结合，并且可以通过添加辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗和基质来检测抗体的存在。
经过筛选和鉴定后，选择一个或多个产生单克隆抗体的细胞进行单克隆扩增。
单克隆扩增时，可以通过细胞有限稀释法以及酵母酶聚合酶链式反应（YAC-PCR）等方法进行。
最后，可以通过收集上述单克隆细胞的上清液或细胞提取物来得到单克隆抗体。
上清液或细胞提取物中的抗体可以通过纯化方法，如蛋白A/G 亲和层析或蛋白L亲和层析等，得到纯化的单克隆抗体。
综上所述，单克隆抗体的制备流程包括抗原选择、免疫动物、细胞融合、筛选和克隆等步骤。
通过这些步骤，可以获得单克隆抗体用于科学研究和临床应用。
单克隆抗体的制备步骤
单克隆抗体的制备步骤
嘿，咱今儿个就来讲讲单克隆抗体的制备步骤，这可真是个神奇又有趣的事儿呢！
你想啊，单克隆抗体就像是一群专门对付坏家伙的精兵强将。
那怎么才能把这些精兵强将给训练出来呢？
首先，得找个合适的“训练营”，也就是实验动物啦。
把特定的抗原注射到这动物体内，就像给它一个挑战任务，让它的免疫系统行动起来。
然后呢，等免疫系统被激发了，就能在动物体内找到那些产生抗体的细胞啦，就像在茫茫人海中找到有特殊本领的人一样。
接下来，把这些有本领的细胞挑出来，和一种能无限增殖的细胞融合在一起，这就好比给这些有本领的人配上了超级装备，让他们能不断壮大自己的队伍。
融合之后，就会得到好多好多的细胞，但可不是所有细胞都能成为厉害的单克隆抗体哟！得像选秀一样，把那些最棒的选出来。
怎么选呢？通过一些特殊的培养条件和检测方法呀，把那些真正有实力的细胞留下来。
再之后呢，就是让这些选出来的细胞大量增殖啦，就像让一支精锐部队不断扩充人数。
最后，就能得到大量的单克隆抗体啦！这些抗体可厉害啦，可以精
准地去对付特定的目标，就像射箭一样，一箭射中靶心。
你说这单克隆抗体的制备是不是很神奇？就好像我们在打造一支超
级厉害的特种部队，专门去解决那些棘手的问题。
这过程可不简单，
但一旦成功，那带来的好处可太多啦！可以用来诊断疾病，治疗疾病，甚至还能在科研中发挥大作用呢！所以啊，科学家们才会花费那么多
精力去研究和制备单克隆抗体呀！你明白了吗？。
单克隆抗体制备方案
单克隆抗体制备方案细胞融合前准备一、动物免疫1.1 动物选择与所用骨髓瘤细胞同源的纯系Balb/c小白鼠，雌雄皆可，鼠龄8周左右。
为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
1.2免疫原制备15ml离心管15个、50ml离心管7个、10ml注射器5支、Tip头20个、电子天平、CFA、PBS、CFA（使用前需震摇）50μg /只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入7mlPBS中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
100μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入3mlPBS中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
150μg/只：称取90mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入2mlPBS中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
200μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入1mlPBS中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
250μg/只：称取100mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入1mlPBS 中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
人单克隆抗体制备
人单克隆抗体制备一、引言人单克隆抗体是由一种单一的免疫细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力。
与传统的多克隆抗体相比，人单克隆抗体具有更好的一致性和稳定性，因此在医学研究和临床应用中具有重要意义。
二、制备方法人单克隆抗体的制备可以通过以下步骤完成：1. 免疫原选择：选择与目标疾病相关的适当免疫原，如病毒、细菌、肿瘤抗原等。
2. 免疫动物免疫：将免疫原注射到合适的动物体内，如小鼠、大鼠等，以激发免疫反应。
3. 混合细胞免疫：从免疫动物中获取免疫细胞，如B细胞，与骨髓细胞融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤细胞筛选：使用选择性培养基筛选出能够产生目标抗体的杂交瘤细胞。
5. 单克隆细胞扩增：将合适的杂交瘤细胞注射到小鼠或裸鼠体内，获得单个克隆的杂交瘤细胞。
6. 抗体表达和纯化：将单克隆细胞培养并收集上清液，通过亲和层析、离子交换层析等技术纯化目标抗体。
三、应用领域人单克隆抗体在医学领域有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 治疗：人单克隆抗体可以用于治疗各种疾病，如癌症、自身免疫性疾病等。
通过与靶标分子结合，抑制病理过程或刺激免疫系统，达到治疗效果。
2. 诊断：人单克隆抗体可以作为诊断试剂，用于检测疾病的标志物或特定分子。
例如，通过检测血清中的特定抗体可以判断是否感染某种病原体。
3. 研究工具：人单克隆抗体可以作为研究工具，用于研究特定分子的功能、相互作用等。
例如，可以使用单克隆抗体来检测蛋白质在细胞中的定位和表达水平。
4. 药物研发：人单克隆抗体也可以作为药物研发的载体。
通过将药物结合到抗体上，可以提高药物的靶向性和稳定性，减少副作用。
四、发展前景人单克隆抗体制备技术的不断发展，为医学研究和临床治疗带来了巨大的机遇。
随着基因工程和生物技术的进步，越来越多的人单克隆抗体将被制备出来，并在各个领域得到广泛应用。
然而，人单克隆抗体的制备过程还存在一些挑战和限制。
例如，制备过程中可能出现杂交瘤细胞的不稳定性和纯化困难等问题。
人源化单克隆抗体的制备方法
人源化单克隆抗体的制备方法人源化单克隆抗体的制备方法1. 引言人源化单克隆抗体作为一种重要的生物药物，在医学诊断和治疗上发挥着重要的作用。
它们能够通过特异性结合目标物质，如病毒、癌细胞等，以识别、中和或破坏它们，具有广泛的应用前景。
人源化单克隆抗体通过将小鼠源的初始抗体进行改造和人源化，弥补了小鼠抗体在人体内产生反应的缺陷，进而提高了其临床应用的安全性和有效性。
2. 人源化单克隆抗体的制备方法2.1 选择目标抗原在制备人源化单克隆抗体之前，首先需要明确目标抗原。
这是指研究人员要制备对特定疾病或病原体具有高度特异性的抗体。
目标抗原的选择对于后续的实验设计和结果分析至关重要。
2.2 制备小鼠源的初始抗体为了制备人源化单克隆抗体，通常需要使用小鼠或其他动物作为初步制备抗体的源头。
研究人员通过免疫注射小鼠来激发其免疫系统产生特定抗原的抗体。
之后，从小鼠体内提取抗体进行初步鉴定和筛选。
2.3 克隆筛选通过克隆和筛选的过程，选择那些对目标抗原具有高度特异性的抗体克隆。
这一步骤的目的是从小鼠源的初始抗体中挑选出性能最佳的抗体克隆，为后续的人源化操作打下基础。
2.4 人源化改造人源化改造是将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体。
在这一步骤中，研究人员会通过基因工程技术将小鼠源抗体的大部分小鼠特异性区域替换为人源的同源区域，以减少人体对外源蛋白的免疫反应。
这可以通过重组DNA技术，将人源抗体的DNA序列嵌入到小鼠源抗体的DNA序列中，使其具有人源性。
2.5 生产和纯化经过人源化改造的抗体需要进行大规模的生产和纯化。
这通常通过基因工程的方法，在合适的细胞系中表达和生产抗体。
随后，使用各种纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等，将抗体从混合物中纯化出来，以获得高纯度的人源化单克隆抗体。
3. 个人观点和理解人源化单克隆抗体的制备方法是一项复杂的过程，其中涉及到多个关键步骤和技术。
通过人源化改造，可以将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体，从而提高其在人体内的安全性和有效性。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体得制备流程（一）动物得选择与免疫1。
动物得选择纯种ＢALB ／C 小鼠，较温顺，离窝得活动范围小,体弱，食量及排污较小,一般环境洁净得实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术得实验室多选用纯种ＢALA/Ｃ小鼠。
2．免疫方案选择合适得免疫方案对于细胞融合杂交得成功,获得高质量得Mc Ａb 至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原得特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂,半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原１~５0μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0、8~1ml,0 、２mｌ／点）↓３周后第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip （腹腔内注射）（ip 剂量不宜超过0、5ml）↓３周后第三次免疫剂量同一,不加佐剂,iｐ（5～7 天后采血测其效价）↓2～3 周加强免疫,剂量50～５00μg为宜,ip 或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原（特别就是一些弱抗原）得免疫方案也不断有所更新，如:①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原得免疫原性，另一方面可降低抗原得使用量。
②改变抗原注入得途径,基础免疫可直接采用脾内注射。
③使用细胞因子作为佐剂,提高机体得免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原得反应性。
（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好得免疫效果。
以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1~2×107个细胞。
初次免疫１ ×107/０、5ml ip↓2～３周后第二次免疫1×1０７/0、5ｍl ｉｐ↓3周后加强免疫（融合前三天）１ ×1０7/0、5ｍl ip 或iv↓取脾融合（二）细胞融合1.细胞融合前准备（1）骨髓瘤细胞系得选择: 骨髓瘤细胞应与免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高,也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量M ｃAb.（2 ）饲养细胞:在组织培养中,单个或少数分散得细胞不易生长繁殖,若加入其它活细胞,则可促进这些细胞生长繁殖，所加入得这种细胞数被称为饲养细胞.在制备ＭcＡb得过程中,许多环节需要加饲养细胞,如在杂交瘤细胞筛选、克隆化与扩大培养过程中，加入饲养细胞就是十分必要得。
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单克隆抗体制备方案单克隆抗体制备方案细胞融合前准备一、动物免疫1.1 动物选择与所用骨髓瘤细胞同源的纯系Balb/c小白鼠，雌雄皆可，鼠龄8周左右。
为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
1.2免疫原制备15ml离心管15个、50ml离心管7个、10ml注射器5支、Tip头20个、电子天平、CFA、PBS、CFA（使用前需震摇）50μg /只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入7mlPBS 中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
100μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入3mlPBS 中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
150μg/只：称取90mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入2mlPBS 中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
200μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入1mlPBS 中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
250μg/只：称取100mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入1mlPBS 中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
1.3 实验步骤初次免疫： 50μg、100μg、150μg、200μg、250μg抗原溶于PBS中，加等体积的福氏完全佐剂（CFA）腹腔和皮下注射。
（共25只小鼠，每组5只，两只采用背部皮下注射，共1ml，0.2ml/点，3只采用腹腔注射）3周后第二次免疫：与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加福氏不完全佐剂（IFA），腹腔和皮下注射3周后第三次免疫：与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加IFA，腹腔和皮下注射，5天后内眦静脉或断尾取血以ELISA间接法测效价2～3周后加强免疫：取初次免疫抗原一半的量溶于PBS，静脉或脾内缓慢注射，以免动物发生过敏性休克而死亡。
3～4天后腹腔注射大鼠、小鼠一般一人即可注射：以左手大拇指与食指执住鼠两耳及头部皮肤，腹部向上，将鼠固定在手掌间，必要时，以左手无名指及小指夹住鼠尾；右手持连有5号针头的注射器，将针头从下腹部朝头方向刺入腹腔，回抽无回血或尿液，表示针头未刺入肝、膀胱等脏器，即可进行注射。
进行腹腔注射时应注意：1、针头刺入部不宜太近上腹部或太深，以免刺破内脏。
2、针头与腹腔的角度不宜太小，否则容易刺入皮下。
3、用的针头不要太粗，以免药液注射后从注射孔流出。
注射后用棉球按一下注射部位。
4、为避免注射后药液从针孔流出，也可在注射时先使针头在皮下向前推一小段距离，然后再刺入腹腔。
皮下注射皮下注射较简单，一般都取背部及后腿皮下。
注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入，固定后即进行注射。
注射器针头不易进入，硬进容易折断针头，故给这些动物作皮下注射时不应选背部皮肤。
一般狗、猫多在大腿外侧；豚鼠在后大腿内侧或小腹部；大鼠可在侧下腹部。
兔在背部或耳根部注射。
1.4 注意事项①免疫时抗原的剂量应根据其免疫原性制定，若免疫原性较弱，需在50～100μg 基础上增加。
②商品化的福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
抗原溶液的体积不能大于佐剂的体积，否则很难乳化好。
一般首次注射时佐剂和抗原溶液的比例为1:1。
③佐剂加入抗原后一定要充分混合成乳剂，混合的方法有研磨法和注射器混合法。
乳化完全与否的鉴定方法是将一滴乳剂滴入水中，如立即散开，则未乳化好；如保持完整不散开，呈滴状漂在水面则为乳化完全。
乳化过的物质放置一段时间出现油水分层也表明未乳化好。
④测抗体效价的方法有ELISA间接法、免疫双扩散法、环状实验等。
用双向免疫法测定时效价达到1：16以上可用于融合实验；用ELISA方法测定时效价达到1：16000后可用于融合。
皮下注射给药皮下注射给药是将药液推入皮下结缔组织，经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环的过程。
作皮下注射常选项背或大腿内侧的皮肤。
操作时，常规消毒注射部位皮肤，然后将皮肤提起，注射针头取一钝角角度刺入皮下，把针头轻轻向左右摆动，易摆动则表示已刺入皮下，再轻轻抽吸，如无回血，可缓慢地将药物注入皮下。
拔针时左手拇、食指捏住进针部位片刻，以防止药物外漏。
二、脾淋巴细胞1. 试剂4%的台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨后，再加蒸馏水至100ml，用滤纸过滤，4℃保存。
使用时需用0.1mol/L的PBS稀释至0.4％（w/v），即1ml 4%的台盼蓝加9ml 0.1mol/L的PBS。
RPMI-1640培养液10%FCS-1640培养液2. 试验步骤①加强免疫3天后摘除眼球放血，收集血清留作抗体检测时的阳性对照。
试管静置30～60min后，将血块轻轻剥离管壁，3000r/min离心15～20min，吸取上清（血清）4℃冰箱保存备用。
②脱椎处死小鼠，浸泡于75％酒精中消毒1min③在超净工作台中用无菌手术剪刀剪开小鼠左侧皮肤，暴露腹膜，打开腹腔，在无菌条件下取出脾脏置于盛有10ml不完全RPMI-1640培养液的平皿中，轻轻洗去脾脏上的红细胞并细心剥去周围结缔组织，于盛有10ml的RPMI-1640培养液的无菌平皿中过不锈钢筛网用注射器针芯研磨脾脏后用玻璃吸管吹打数次制成细胞悬液，移入10ml离心管中。
④沉降大块的结缔组织，把细胞悬液转移到50ml离心管中⑤以RMPI-1640培养液充满50ml离心管，配平后在室温下以1000r/min离心10min，弃上清⑥用约10ml的新鲜RPMI-1640培养液重悬⑦重复⑤⑥步骤⑧计数活细胞：把细胞悬液稀释到约6个/ml，将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。
用移液枪取0.9ml细胞悬液和0.1ml浓度0.4％的台盼蓝工作液于EP管中，充分混匀中静置1～2min，不超过5min。
如果染色时间太久，细胞将下沉或受损，而且部分活细胞也会着色。
用加样器小心混匀细胞悬液后，立即用微量加样器将其加于血球计数板，置于倒置显微镜下观察并计数活细胞和死细胞。
死细胞被染成淡蓝色，活细胞排斥台盼兰，不被染色。
活细胞数大于80%为合格。
3. 注意事项①取样计数前应充分混匀细胞悬液。
②数细胞的原则是只计数完整的细胞，镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
若细胞压在格线上时，只计上侧和左方的。
③操作时注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。
④一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍，细胞数为2×108左右。
三、饲养细胞①10～12周龄Balb/c小鼠脱椎处死，浸泡于75％酒精，消毒3min～5min②用注射器抽取5ml预冷的10%的FCS-1640培养液注射到小鼠腹腔（严禁刺破肠管）并用手指轻揉3min～5min后，用无菌剪刀剪开小鼠腹部一小口，用圆头尖吸管吸出并移入50ml离心管中。
吸的过程一定不要刺破肠管以免细菌污染。
③室温1200r/min离心5min～6min④弃上清液，用10%胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105个/ml⑤将细胞转入96孔培养板，每孔100μl，放入37℃CO2培养箱中培养.四、骨髓瘤细胞1.骨髓瘤细胞介绍目前应用最多的是Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株SP2/0-Ag14（简称SP2/0）细胞株。
骨髓瘤细胞适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。
细胞的最大密度不得超106个/ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
一般在融合前两周就应该对其进行复苏。
SP2/0细胞为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
在细胞融合的前一天用新鲜的10%FCS-1640培养基调整细胞浓度为2.0×105个/ml，次日取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞，于室温1000g（3000r/min）离心10min收集沉淀，以无血清RPMI-1640培养液重悬并计数。
此时细胞形态良好，观察形态完整，排列整齐，密度为0.1×106～1×106个/ml。
经胎盼蓝染色活细胞数>95%。
SP2/0细胞是肿瘤细胞株，一般注射到小鼠体内约1周左右就可以使小鼠致死。
在其状态萎靡的时候就可以用基础培养基洗出其腹腔中的细胞，分离SP2/0细胞。
整个过程要保证无菌，否则就前功尽弃了。
为了防止骨髓瘤细胞（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶HGPRT缺陷株）变异出现返祖现象，在融合前骨髓瘤细胞株可在含有15μg/ml或20μg/ml的8－氮鸟嘌呤(8-AG)的培养基内适应性培养一周或定期对细胞进行筛选，再转入完全培养基培养1～2周即可用于融合。
8-AG一般试剂公司都有（如Sigma），使用时需仔细看说明，根据根据说明配置相应浓度的8-AG。
2.细胞培养①每月用新洁尔灭或84消毒液擦拭无菌间的所有所有器件、地板和墙壁一次，进行彻底消毒。
②一般在实验前用紫外灯照射无菌室30～60min，实验做完后再用紫外灯照射30min。
配合紫外线灭菌灯使实验室经常保持高度的无菌状态。
紫外灯开启时间较长时，可激发空气中的氧分子缔合成臭氧分子，这种气体分子具有很强的杀菌作用，可以对紫外线没有直接照到的角落产生灭菌效果。
由于臭氧有碍健康，在进入操作之前应先关掉紫外线灯，关后十分钟即可进入。
③实验前开启超净工作台内紫外灯，照射10～30min，然后让超净工作台预工作10min～15min，以除去臭氧和使工作台面空间呈净化状态。
④进入无菌培养室原则上应按外科手术进行洗手和着装，即穿戴无菌服、帽子和口罩，并换鞋。
用后要清洗消毒备用。
开始操作前用75%酒精和0.2%新洁尔灭消毒手和前臂，洗手时要洗刷到肘部。
使用过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。
⑤无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。