绿色荧光蛋白的应用及发展前景汇总

学士学位论文文献综述题目绿色荧光蛋白的应用及发展前景

姓名周紫嫣学号

专业生物工程

指导教师周小萍职

称教师

中国·武汉二○一二年四月

目录

摘要······················································································ II 关键词 ···················································································· II Abstract ··················································································· II Key words ················································································ II

1 GPF的发现 (1)

2 GFP的结构及发光原理 (1)

2.1 GFP的结构 (1)

2.2 GFP的发光原理 (2)

3 GFP在生物技术中的应用 (2)

3.1 GFP作为报告基因 (2)

3.2 GFP用于研究病毒与宿主的关系 (3)

3.3 GFP用于药物筛选 (3)

3.4 GFP作为生物传感器 (3)

3.5 GFP用于融合抗体 (4)

3.6 GFP用于计算细胞生长速度 (4)

3.7 GFP用于基因表达调控 (4)

4 GFP存在问题及发展前景 (4)

参考文献 (5)

致谢 (5)

绿色荧光蛋白的应用及发展前景

摘要

绿色荧光蛋白(GFP）是一种由水母（Aequorea Victoria）体内发现的发光蛋白。分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。本文综述了绿色荧光蛋白的发现过程，基本性质，应用及其发展前景。

关键词

绿色荧光蛋白；报告基因；药物筛选；融合抗体

Green fluorescent protein application and development prospect

Abstract

Green fluorescent protein (GFP) is a kind of the jellyfish (Aequorea Victoria) found in the body of the luminous protein. Molecular quality as kDa 26, with 238 amino acids, 65 ~ 67 of amino acid (Ser-Tyr-Gly) form shine group, is mainly the position of the light. The light the formation of the group has no species specificity, a fluorescent stability, and does not need to rely on any auxiliary factors or other matrix and shine. Green fluorescent protein gene into the host cell is stable, for most of the host physiology no effect, the report is a common gene. This paper reviewed the green fluorescent protein discovery process, basic properties, application and development prospect.

Key words

Green fluorescent protein；Report gene；Drug screening；Fusion antibody

1 GPF的发现

2008年的诺贝尔化学奖授予从事有关:“绿色荧光蛋白( GFP) 的发现,表达和发展”并取得重要成就的三位科学家：日本科学家下村修（Osamu Shimomura）；美国科学家马丁·沙尔菲（Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）。绿色荧光蛋白( GFP) 是一种在维多利亚多管水母体内所发现的蛋白质。是在1962年由下村修等科学家发现。而水母所发出的绿色荧光,并非由GFP发出,它是因照相中所使用闪光的反射所致。

2 GFP的结构及发光原理

2.1 GFP的结构

由维多利亚多管水母中发现的GFP是一种化学性能稳定的小分子蛋白质，由238个氨基酸残基组成。在蓝色波长范围的光线激发下，发出绿色萤光。GFP的原初结构式通过氨基酸残基65-67(Ser-Tyr-Gly)而生成的荧光发色团(Cody et al，1993)。在GFP的65-67(Ser-Tyr-Gly)可自发的形成一种P-羟基亚苄基咪唑酮的荧光发色团（如图1所示）。

图1 发色团

GFP的晶体结构是11个β-折叠组成的β-桶状结构组成的二聚体，在桶中央有一个α-螺旋。β-

桶状结构直径约3nm，高约4nm。β-折叠彼此紧密结合，像桶板一样形成桶状结构的外围，并且形成了一个规则的氢键带（如图2所示）。桶状结构和位于其末端的短α-螺旋以及环状结构一起组成一个单独的致密结构域，没有可供扩散的配体进入缝隙。这种坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗变性的特点（Yang F et al，1996）。蛋白的一级结构大部分用来形成β-折叠和α-螺旋。蛋白质原初结构中,很大一部分用于构筑β-管道，以及线状的α-螺旋体。在能保持GFP荧光发射的条件下，从GFP的N2端和C2端可以除去的N2端残基和C2端的残基(总数达230～238) 是无序的（吴世康，2008）。

图二 GFP的晶体结构

2.2 GFP的发光原理

GFP的激发光谱在400nm处有一主要激发峰，在470nm处有一次要激发峰，发射光谱在505nm处有一尖锐的主要发射峰，在540nm处有一肩峰。这一结果是于1998 年,由Tsien所测得。

GFP的性质和发射光谱的稳定性与其生色团结构的稳定性紧紧相关。GFP表达后折叠，在氧存在的条件下，使得66位氨基酸残基的α，β键间脱氢。由65～67位的氨基酸残基(Ser-Tyr-Gly)环化成稳定的对羟基苯咪唑啉酮(4-P-hydroxybene-5-imidazolinone)，形成生色团（吴沛桥等，2009）。GFP 的生色基团是蛋白质自身催化环化的结果，环化是一个有氧过程，在严格厌氧条件下GFP不能形成荧光，因为GFP的生色团形成需要氧使Tyr66脱氢氧化。生色基团通过Tyr66的脱质子(酚盐)和质子化状态(羟酚基)的转换决定荧光发射（徐飞虎和龚兴国，2002）。

3 GFP在生物技术中的应用

3.1 GFP作为报告基因

报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的DNA，如荧光素酶(LUX)基因和β-葡萄糖苷酶(GUS)基因。GFP作为基因报告可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测（吴沛桥等，2009）。

常用的质粒克隆载体的报告基因如LacZ ,是利用酶促催化反应,需要加入外源底物和诱导物(如IPTG,X-gal) ,不仅操作繁琐且价格昂贵。现已构建了以GFP S65 T 基因作为筛选标记的新型克隆载体,建立了以绿白斑筛选法筛选阳性重组子的新方法（孙德惠等，2006；范学政等，2005）,替代LacZ 蓝白斑筛选,不需X-gal ,经济简单可行。

作为一种新的报告基因，GFP在生物学研究中得到广泛的应用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机原理，可将GFP作为蛋白质标签，利用DNA重组技术将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，所以将其和其他蛋白融合不会影响自身发光。1996年，Ehrdardt等人首次报道利用GFP研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成一个环状物，并且至少有9种蛋白在细胞分裂中起到重要作用，虽然对这些蛋白功能并不是很清楚，但是利用GFP已经搞清楚他们聚合的顺序及蛋白定位中的一些特征。除了用于蛋白的标记定位之外，GFP也可以大量用于细胞器的标记。