绿色荧光蛋白GFP
gfp绿色荧光蛋白序列_概述及解释说明
gfp绿色荧光蛋白序列概述及解释说明
1. 引言
1.1 概述
GFP（绿色荧光蛋白）是一种具有独特发光特性的蛋白质，被广泛应用于细胞和分子生物学领域。其绿色荧光可以通过外源激活而观察到，使得科学家们能够可视化细胞内发生的过程，并实时跟踪靶标分子的定位与转移。GFP的序列是理解其结构、功能以及应用关键的基础。
1.2 文章结构
本文将从多个方面对GFP绿色荧光蛋白序列进行概述及解释说明。首先，我们将介绍GFP的历史和发现过程，以及其在现代生物学中的重要性。随后，我们将详细探讨GFP序列的组成和编码基因信息，并解析与功能相关性方面的研究进展。最后，我们将阐述GFP序列在生物学研究中的广泛应用，并就目前存在的问题和未来发展进行思考。
1.3 目的
本文旨在提供有关GFP绿色荧光蛋白序列的全面概述及解释说明，深入探讨其组成、结构、功能和应用，并对其未来发展进行展望。通过本文的阐述，读者将能够更好地理解和应用GFP序列在生物学领域中的价值，为相关研究提供指导
和启示。同时，我们也希望通过此文促进对GFP技术的探索和创新，推动生物科学的不断发展。
2. GFP绿色荧光蛋白序列概述
2.1 GFP简介
GFP（Green Fluorescent Protein）绿色荧光蛋白是一种来自于海洋水母的蛋白质。它的主要特点是能够发出绿色荧光，并且在非生物致死条件下仍然保持稳定。由于这些特性，GFP成为了生物学领域中一种广泛使用的标记工具。
2.2 GFP的发现历程
GFP最早是在1960年代末期由奥斯汀·盖因斯、罗德南·麦迪安和道格拉斯·普里肯特等科学家在研究水母Aequorea victoria时发现的。他们观察到当GFP暴露在紫外线下时会发出绿色荧光，并且将其提取出来进行进一步研究。随后，科学家们发现GFP能够自身形成一个染色体，而不需要其他辅助物质。
绿色荧光蛋白的结构与应用
抗体生产
GFP现已广泛应用于各物 种中作为标记蛋白进行细胞定 位以及蛋白分析，因此，开发 适用于多种属细胞的GFP抗体 是必要的。GFP抗体可通过免 疫印迹方法对GFP及其标记蛋 白进行定量，从而防止GFP扩 散。Dong等利用GFP基因 cDNA全序列构建了原核表达 载体，并进行亲和纯化免疫新 西兰大白兔，结果表明该抗体 能很好的识别莱茵衣藻、大肠 杆菌等内的GFP。
04 参考文献
参考文献
绿色荧光蛋白（GFP）的结构与应用
[1]孙艺佩.绿色荧光蛋白——结构及应用[J].当代化工研究,2017(08):124-1 25. [2]胡业辉,李益鹏,王紫英,陈勖,任真,丁澦.绿色荧光蛋白结合蛋白的表达纯化 与鉴定[J].复旦学报(自然科学版),2019,58(02):183-190. [3]李科友,武永军,刘林丽,刘晶莹,陈鹏.绿色荧光蛋白之光——生物技术综合 大实验课程教学的改革与探索[J].生命的化学,2018,38(04):667-672.
绿色荧光蛋白（GFP）的结构与应用
GFP灵敏度高，不需要其他辅助底物就能产生 较强的荧光，且通过导入GFP基因在实验体内表达， 对细胞无毒害，能在转化后遗传给后代，因此是理 想的报告基因。作为报告基因，通过测定GFP的荧 光强度可对生物体内一个或多个基因的表达水平进 行检测，目前在动植物及微生物检测基因转化效率 中已有较广泛的应用。
绿色荧光蛋白简述
2000年10 月2日诞生 于，美国俄 勒冈保健科 学大学的 “安迪” （Andi）
2009年5月27日，日本研究人员宣布培育出 了一种转基因绒猴，这种猴的发根、皮肤和 血液在特定光线照射下都会发出荧光，且该 特性能遗传给下一代。这是世界上第一批可 以复制人类疾病并且会发光的转基因灵长类 动物。
• 1994年，钱永健教授开始研 究并改造GFP，并获得了多项 发现。世界上用的大多数是 他们实验室改造后的变种。 钱永健教授对GFP的研究，对 人们理解GFP及GFP族的化学 荧光特性做出了重要的贡献， 同时得到了红色、黄绿色、 蓝色等多种颜色的荧光蛋白， 大大拓宽了GFP研究的领域。 从而使科学家能够对各种蛋 白和细胞施以不同的颜色， 这使科学家可以在同一时刻 跟踪到多个不同的生物学过 程使之成为极有效的研究动 态生命过程的基因标记工具。
• 具对C. elegans进行研究， 它可以作为变化的绿色信 号对线虫不同细胞间的活 动进行示踪观察。沙尔菲 教授的研究证实了作为发 光的遗传标签的GFP在研 究各种生物现象时的巨大 作用。至此，生物医学研 究的一场“绿色革命”揭 开了序幕。 •1994年当沙尔菲教 授得知GFP后，他意 识到可以使用这一工
转到
GFP的性质
• GFP荧光极其稳定, 抗光漂白能力比荧光素 强，GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素 标记的荧光抗体高。 • GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂 能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴 露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢 复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中 度氧化剂对GFP荧光影响也不大。 • 由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光 的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP 作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用 是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。
绿色荧光蛋白
绿⾊荧光蛋⽩
绿⾊萤光蛋⽩（Green fluorescent protein；简称GFP），由下村脩等⼈于1962年在维多利亚多管发光⽔母中发现，其基因所产⽣的蛋⽩质，在蓝⾊波长范围的光线激发下，会发出绿⾊萤光，整个发光的过程中还需要冷光蛋⽩质⽔母素的帮助，冷光蛋⽩质与钙离⼦（Ca2+）可产⽣交互作⽤。2008年10⽉8⽇，⽇本科学家下村脩、美国科学家马丁·查尔菲和钱永健因为发现和改造绿⾊荧光蛋⽩获得了诺贝尔化学奖。绿⾊萤光蛋⽩现常被⽤来研究⾻架和细胞分裂、动⼒学和泡囊运输、发育⽣物学等，并可应⽤于转染细胞的确定、体内基因表达的测定、蛋⽩质分⼦的定位、细胞间分⼦交流的动态监测等。
基本信息
中⽂名：绿⾊荧光蛋⽩
英⽂名：green fluorescent protein
别名：GFP
发现者：下村修
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载体蛋⽩
载体
GAPDH
cDNA⽂库
免疫荧光
PCR
热休克蛋⽩
鸟枪法
shRNA
显影液
断裂基因
同源重组
酵母双杂交
宏基因组
透射电镜
构造组成
正在加载科学家在线形⾍体内植⼊绿⾊荧光蛋⽩质
由⽔母Aequorea victoria中发现的野⽣型绿⾊荧光蛋⽩
，395nm和475nm分别是最⼤和次⼤的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。由海肾（sea pansy）所得的绿⾊荧光蛋⽩，仅有在498nm有⼀个较⾼的激发峰点。
在细胞⽣物学与分⼦⽣物学领域中，绿⾊荧光蛋⽩基因常被⽤作为⼀个报导基因(reporter gene）。⼀些经修饰过的型式可作为⽣物探针，绿⾊荧光蛋⽩基因也可以克隆到脊椎动物（例如：兔⼦上进⾏表现，并拿来映证某种假设的实验⽅法。
绿色荧光蛋白(GFP)
经钱永健改造 后的各色荧光 蛋白。
“我总是被色彩所吸引，”钱永健说，正是色彩，让他的工作更有趣， “当工作进展得不顺利时，因为色彩，我可以把工作继续进行下去。如果我天 生是色盲，估计我不会取得今天的成就了。”
目录
绿色荧光蛋白简介 GFP应用前景
最新进展
绿色荧光蛋白（GFP）
GFP由238个氨基酸组成，分子量 为26.9 kDa，最初是从维多利亚多管发 光水母中分离出来的，在蓝光照射下会 发出绿色荧光。来源于水母的野生型 GFP在395 nm和475 nm分别有主要和 次要的激发峰，它的发射峰在509 nm， 处于可见光谱的绿色区域（图1）。来 源于海肾的GFP只在498 nm有单个激 发峰。
2008年诺贝尔化学奖获得者
下村修
1961年，下村修等人从大量的多管水 母属中分离了水母素及腔肠素。他们发现 生物发光是由钙离子引发的。这项研究开 展了对绿色荧光蛋白的研究。 1962年，他从一种水母中发现了荧光 蛋白，被誉为生物发光研究第一人。
维多利亚多管发光水母能够放出蓝色的荧光。这是 透过快速释放与水母素相互作用的钙离子（Ca2+）生 成的。所放出的蓝光会被绿色荧光蛋白转变为绿光。水 母素和绿色荧光蛋白都是生物学研究的重要工具。
GFP标记的微管
绿色荧光蛋白的应用前景
2.药物筛选 荧光探针的概念： 利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联， 根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在 迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小， 因而常用作荧光探针。 筛选原理： 受体常常被用作药物筛选的目标，若某一药物具有与信号分子类似的功能 ，那么该药物即具有潜在的医药价值。利用GFP荧光探针，将很容易从数 量众多的化合物中判断出哪些化合物具有与信号分子相似的能引起配体一 受体复合物迁移并介导生理反应的功能，且这一筛选过程简单方便，所需 成本也很低。由于GFP在细胞内的穿透性强及独特的发光机制，因而在药 物筛选中具有相当大的应用潜力。
绿色荧光蛋白(GFP)
2008年诺贝尔化学奖获得者
下村修
1928年出生于日本京都市， 毕业于名古屋大学，是日本化 学家、海洋生物学。
1960年开始，在美国普林 斯顿大学学者约翰逊的邀请下， 前往美国，先后在普林斯顿大 学、波士顿大学和麻省伍兹霍 尔海洋生物实验所工作。
利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些 过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发 育和信号转导等。除用于特定蛋白的标记定位外， GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质 膜、细胞核等等。
GFP标记的微管
绿色荧光蛋白的应用前景
2.药物筛选
荧光探针的概念： 利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联， 根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在 迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小， 因而常用作荧光探针。
绿色荧光蛋白（GFP）
GFP是典型的β桶形结构，包含β 折叠和α 螺旋，将荧光基团包含在其 中（图2）。严密的桶形结构保护着 荧光基团，防止它被周围环境淬灭。 GFP表达后折叠环化，在氧存在下， 内部面向桶形的侧链诱导Ser65– Tyr66–Gly67三肽环化，导致荧光基 团形成。
绿色荧光蛋白（GFP）
绿色荧光蛋白(GFP)技术在细胞生物学研究中的应用
细胞内许多酶的作用，例如：蛋白水解酶、激酶、 氧化还原酶以及一些小配基的浓度[20]。
精选完整ppt课件
17
7 用于细胞示踪实验研究
利用GFP的荧光可以清楚地对肿瘤细胞的生长和转移进行追踪。体内肿瘤侵 袭的研究要求在周围正常细胞背景下，能识别少量甚至是单个的瘤细胞。以 往用抗肿瘤细胞特异性抗原、抗体进行免疫组化分析，操作较为复杂,且对抗 原性有较高要求。利用β半乳糖昔酶(Lac Z)作为标记基因转染肿瘤细胞，操 作较为复杂，且需底物分子。而用GFP就可以准确而简便地对肿瘤细胞进行 示踪。
另外一种可以用来研究细胞内反应动力学的方法就是荧光相关性分光 光镜检查(FCS)。这种方法是首先通过聚焦照射在细胞内形成一个一 定大小的光洞，光洞中荧光探针的移动会引起荧光的波动，通过校正 计算出荧光颗粒的平均滞留时间和平均数量，再根据已知光洞的大小 和平均光滞留时间就可以计算出扩散蛋白的动力学参数[19]。
精选完整ppt课件
12
2 细胞筛选
基于GFP能够吸收、发射光，并且荧光稳定以及检测方法 快速、方便的特性，GFP在细胞筛选上应用广泛。譬如应 用流式细胞计数仪来筛选蛋白产量增强的细胞。Yuk等 [14]使用GFP 作为标记能快速筛选出在生长抑制环境下， 仍能保持重组蛋白大量表达的CHO细胞。另外，研究发现 通过GFP 荧光的减少，可以测量出鼠和人细胞的凋亡 [15]。利用GFP融合蛋白作为细胞表面活体荧光标记，通 过筛选已经获得GFP表达的E.coli、人体肾细胞和猿猴 COS- 1细胞等特殊类型。Sheen J 等在GFP转染玉米原 生质体中出现两类细胞丛，第一类与对照相似，呈现红色 荧光，约占细胞总数66.3%；第二类细胞丛呈现绿色荧 光，荧光强度是对照的74 倍[16]。因此，用流式细胞计 数仪或荧光活化细胞计数仪( FACS) 很容易将两类细胞分 离开来。
绿色荧光蛋白和PCR技术
绿色萤光蛋白
(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。
由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白，395nm和475nm 分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。由海肾(sea pansy)所得的绿色萤光蛋白，仅有在498nm有一个较高的激发峰点。
在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene)。一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。
2008年10月8日，日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所）、美国科学家马丁·查尔菲（哥伦比亚大学）和钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校）因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年（2008）的诺贝尔化学奖。
GFP的性质
GFP荧光极其稳定,在激发光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450～
490nm蓝光波长下更稳定。
GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP
转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光
GFP
绿色荧光蛋白
一、定义
从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。
二、基本介绍
绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。
绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形，就像一个桶，负责发光的基团位于桶中央，因此，绿色荧光蛋白可形象地比喻成一个装有色素的“油漆桶”。装在“桶”中的发光基团对蓝色光照特别敏感。当它受到蓝光照射时，会吸收蓝光的部分能量，然后发射出绿色的荧光。利用这一性质，生物学家们可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细胞，然后在蓝光照射下进行显微镜观察。原本黑暗或透明的视场马上变得星光点点——那是被标记了的活动目标。对生物活体样本的实时观察，在绿色荧光蛋白被发现和应用以前，是根本不可想象的。而这种彻底改变了生物学研究的蛋白质，最初是从一种广泛生活于太平洋海域的发光水母体内分离得到的。
绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位
绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位
绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是一种自然存在
于海洋水母Aequorea victoria中的荧光蛋白，其拥有强烈的绿
色荧光。由于其广泛应用于细胞生物学和生物化学领域，GFP
已经成为研究生物过程和信号传递的强有力工具。
GFP的结构由238个氨基酸组成，具有一个单独的蛋白质区域，称为圆柱螺旋(Beta-can)。GFP基因含有GFP编码序列，该序
列通过表达可以产生GFP蛋白质。GFP的荧光性质是由三个
氨基酸残基组成的染色体枢纽部分决定的，即丝氨酸(Tyr66)、谷氨酸(Pro68)和脯氨酸(Ala80)。
在GFP的自然状态下，并不发出荧光。但当该基因被转录和
翻译成蛋白质之后，在有氧条件下，GFP的氨基酸序列会发
生类似于玉米的光合作用过程，使得GFP的荧光激活。
在细胞生物学领域，GFP被广泛用作标记工具，以帮助研究
人员观察细胞内部的某些组分或结构。研究人员可以通过将GFP基因与目标蛋白的基因融合，使目标蛋白在表达时也表
达GFP。由于GFP的荧光性质，这样就可以通过荧光显微镜
直接观察到目标蛋白的位置和分布。
通过GFP技术，科学家们得以研究细胞核或细胞器在发育过
程中的变化，以及探索细胞活动的机制。此外，通过将GFP
基因与多个目标蛋白的基因融合，科学家们可以标记多种细胞结构，并观察它们在细胞活动过程中的相互关系和动态变化。
除了在细胞生物学领域的应用外，GFP还被广泛应用于分子
生物学、生物化学、药物筛选和基因治疗等领域。由于GFP
绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达
绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达
摘要
绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。
关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆表达
1.前言
1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）
绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物
发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。
1.2 GFP 的结构
GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。
1.3 GFP的研究应用
GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。
gfp荧光值
gfp荧光值
GFP，即绿色荧光蛋白，是一种在生物学研究中广泛应用的荧光标记物。GFP的荧光特性主要源于其独特的发光机制，它能够在受到特定波长的光激发后，发出明亮的绿色荧光。这种荧光不仅具有高度的可见性，而且相对稳定，使得GFP成为生物学研究中的重要工具。
GFP的荧光值与多种因素有关，其中最重要的因素是激发光的波长。GFP在受到紫外光或蓝光激发时，能够发出明亮的绿色荧光。其吸收的光谱峰值位于395nm（紫外）处，并有一个副吸收峰位于470nm（蓝光）处。尽管450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于该激发光对细胞的伤害较小，因此在实际应用中，多使用该波段的光源，尤其是488nm的激光。
除了激发光的波长，GFP的荧光值还受到其他因素的影响，如荧光蛋白的浓度、环境的pH值、温度以及可能存在的荧光猝灭剂等。在适当的条件下，GFP的荧光值可以达到很高的水平，使得研究人员能够在复杂的生物环境中清晰地观察到被标记的目标。
GFP的荧光特性不仅在基础研究中发挥着重要作用，而且在生物医学领域也具有广泛的应用价值。例如，在癌症研究中，研究人员可以利用GFP标记肿瘤细胞，从而实时追踪肿瘤的生长和转移过程。此外，GFP还可用于药物的筛选和开发，通过观察药物对GFP荧光的影响，研究人员可以评估药物的疗效和潜在的副作用。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达(新手详细注释版)
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达
背景知识
绿色荧光蛋白( green fluorescent protein ， GFP)是一类存在于包括水母、水螅
和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时， GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子。发色团是其蛋白质一级序列固有的。 GFP 由 3 个外显子组成，长 2.6kb ；GFP 是由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白 ,相对分子质量为27. 0kMr ，其蛋白性质十分稳定，能耐受 60℃处理。 1996 年 GFP 的晶体结构被解
出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长 420 nm，宽 240 nm，由 11 个围绕中
心α螺旋的反平行β 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光
活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内
部第 65-67 位的 Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成 .
实验一质粒DNA 的分离与纯化
一、实验目的
掌握一种最常用的质粒 DNA 提取方法：碱裂解法。该法用
于从小量培养物中抽提质粒 DNA ，比较方便、省时，提取的
质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。
二、基本原理
质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到
200kb 。质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地
绿色荧光蛋白GFP-南开大学
（五）免疫印迹（ immunoblotting ）
又称蛋白质印迹（Western blotting），是
GFP的发光原理
GFP的开放阅读框架长度约为 740bp，编码238个氨基酸残基。GFP表达后折叠环化， 在氧存在下，由65～67位的氨基酸残基环化，形成发色 基团，无需添加任何酶和底物，在长紫外或蓝光激发下 就能发荧光。
转GFP基因线虫
构成生色基团的3个氨基酸:Ser-dehy-droTyr-Gly
氢键和疏水健打开，与之形成蛋白质－SDS复合物。由于SDS带有负 电荷，消除了不同蛋白质间原有的电荷差异，使蛋白质分子在凝胶 中的迁移率主要取决于它的分子量。
§ 6、加样、电泳
将玻璃夹板、电泳槽内芯、玻璃夹板依次放入槽内
（短玻板一面朝内）
插入楔型板 加注电泳缓冲液
（液面高于短玻板，低于长玻板）
拔掉梳子 每孔加样20μ l
2、试剂与材料 3、仪器及用具
紫外检测仪、超声波细胞粉碎机、垂直 板式电泳系统、半干式蛋白质印迹电转 移系统等。
三、实验原理与方法
（一）质粒的提取、酶切及琼脂糖凝胶电泳检测
质粒 DNA：细菌细胞中小的共价闭合环状双链 DNA。 （1kb～200kb） 共价闭环 DNA ，超螺旋 开环 DNA ，两条链中有一条发生一处或多处断裂 线性 DNA ，两条链在同一处断裂
绿色荧光蛋白(GFP) 的特性及其在分子生物学研究中 的应用
一 GFP 的结构、特性与功能
❖ 1 GFP 的结构
❖ P rasher DC 首 先 克 隆 了 水 母 Jellyfish(A equorea v ictoria GFP)的cDNA[ 6 ],GFP编码的238个氨 基酸的多肽单体，推导分子量Mr=26888，与先前用变性电泳测得的天然 GFP 分子量 （30 KD a ） 接近。根据DNA序列推导的氨基酸序列与大部分天然GFP的多肽片段相同。只有完整的GFP 分子才会 产生生物荧光, 但与荧光的产生直接有关的是GFP 分子中一小段被称为色基(Ch rom opho re ) 的部位 （图2。在GFP的初级氨基酸序列上, 第65～67个氨基酸(SerˉTyrˉGly）ˉˉˉˉ
绿色荧光蛋白(GFP) 的特性及 其在分子生物学研究中 的应用
.
生物发光现象, 在无脊椎动物中很普遍。它是生物能量的一种转换方式 [ 1, 2 ]。在水母(Jellyfish) 中, 当能量从 Ca + + 活化的水母蛋白(A equo rin ) 转移到绿色荧光蛋白(Green F luo rescen t P ro tein, 简称GFP)上以 后，它即发出绿色荧光。活体GFP与纯化的 GFP 具有相同光谱特性, 即吸收蓝光, 放射绿光。可以用紫外灯、荧光显微镜或荧光活化流体分 光光度计进行活体检测 。由于GFP 稳定、灵敏度高、无生物毒性、荧 光反应不需要任何外源反应底物及表达无物种或细胞组织的专一性, 因 此它是一种独特的 报告蛋白(R epo rter p ro tein) , 可广泛用于基因的表 达与调控、蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化, 以及细胞的分离与纯化等研究领域。90年代后, 有关GFP 及其利用的研 究进展较快，已引起分子生物学家极大的兴趣与关注。
gfp荧光值
gfp荧光值
GFP荧光值是一种常用的生物标记方法，可用于追踪蛋白质或细胞的运动和定位。通过插入GFP基因到感兴趣的细胞或生物体中，可以使这些细胞或生物体发出绿色荧光。这种荧光值不仅可以用来研究生物体的生理过程，也可以用于疾病的诊断和治疗。
GFP荧光值的测量是基于光的特性。当GFP发出荧光时，它会吸收外部光源的能量并发出特定的波长的绿色光。这种荧光值的测量通常是非常准确和重复性的，因为它是一种可靠的定量方法。
GFP荧光值的测量还可以用于研究细胞或生物体的代谢活性。通过测量GFP的荧光强度，可以了解细胞或生物体的活力水平。这对于研究细胞的生长、分化和死亡过程非常重要。
除了生物研究，GFP荧光值还可以应用于医学领域。例如，通过将GFP基因插入癌细胞中，可以追踪癌细胞的扩散和转移。这对于癌症的早期诊断和治疗非常重要。
虽然GFP荧光值的测量在科学研究中非常常见，但是我们需要注意一些限制和注意事项。首先，GFP荧光值的测量需要专业的设备和技术，这对于一般的实验室可能不太容易实现。其次，GFP荧光值的测量结果可能受到许多因素的影响，如光源的强度、样本的处理方法等。因此，在进行实验时需要仔细控制这些因素。
GFP荧光值是一种重要的生物标记方法，可以用于研究细胞和生物
体的运动、定位和代谢活性。它在生物研究和医学应用中发挥着重要的作用。通过准确测量GFP荧光值，我们可以更好地理解生物体的功能和疾病的发生机制，为科学研究和医学进展提供重要的支持。
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绿色荧光蛋白GFP综述
生命科学学院 2010级李积锋 1241410007
【摘要】绿色荧光蛋白(GFP) 是一种最先来源于水母的蛋白质，现已成为在生物化学和细胞生物学中研究和开发应用得最广泛的蛋白质之一。其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时小峰可高效发射清晰可见的绿光。它已成为一个监测在完整细胞和组织内基因表达和蛋白质定位的理想标记。在生理指示剂、生物传感器、光化学领域以及生产发光纤维等方面展示了广阔前景。
【关键词】水母绿色荧光蛋白生色团变种
1绿色荧光蛋白简介
绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，当受到紫外或蓝光激发时，发射绿色荧光。其独特之处在于：它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的来源于水母的氨基酸残基组成。
水母的绿色荧光蛋白很稳定，无种属限制，已在多种动植物细胞中表达成功并产生荧光。GFP的荧光受外界的影响较小，另外GFP的检测十分方便，而对细胞的伤害极小。由于这些优点，GFP已经成为检测体内基因表达及细胞内蛋白质原位定位的极为重要的报告分子。
2绿色荧光蛋白的表达和成熟
GFP的表达水平受多种因素的影响。在植物细胞中表达GFP时，改变一些原GFP 基因的密码子为该植物使用的偏爱密码子，并消除潜在的剪接位点。目前适用于哺乳动物的表达系统不受影响。GFP还可以顺利的在无细胞的体外翻译系统中表达并自发折叠。
用一些小体积的氨基酸残基取代大体积残基可以提高GFP在高温下正确折叠的速度。这些突变位点分布于成熟蛋白质三维结构的各个部位，几乎不能提供如
何帮助GFP折叠和成熟的线索。另外，分子伴侣的存在也有助于GFP的折叠，反过来，这个发现也使GFP成为检测分子伴侣功能的一个好底物，因为GFP可以提供一个连续的、无破坏性的检测蛋白折叠成功的分析方法。
3绿色荧光蛋白的应用
3.1报告基因和细胞标记
GFP作为报告分子和细胞标记最明显的优势是无需底物或辅因子参与；无论在活细胞还是在完整的转基因胚胎和动物中，都能有效地监测基因转移的效率。但在这方面的应用中，最大的缺点就是没有放大作用，它不能象酶一样能通过加工无数的底物分子而将信号放大所以一般都需强启动子以驱动GFP基因在细胞内足量的表达也可用亚细胞分辨率的显微成像系统检测基因产物，靶入的基因被限制于一个细胞器内，GFP的浓度则相对提高了许多倍。
3.2融合标记
应用得最多和最成功的是GFP同宿主蛋白构成融合子来监测宿主蛋白的定位
和最后归宿既有荧光又有宿主蛋白原有的正常功能和定位的融合蛋白效果最佳GFP可融合于宿主蛋白的C端或N端，也可插入其内部迄今为止，GFP已成功地靶入了大部分细胞器中，如质膜、细胞核、内质网、高尔基体、分泌小体、线粒体、液泡和吞噬体等。
3.3 其它
GFP分子生色团的坚固外层保护荧光不被熄灭，但同时也降低了GFP分子的荧光对环境的敏感性通过随机重组和基因定向突变得到了多种对环境敏感的GFP，它们可用作环境指示剂如：对PH敏感GFP的可以测定细胞器内的PH值；通过基因工程，可GFP在中插入磷酸化位点以便用磷酸化控制GFP的荧光。另外，最近报道的利用靶入了水母GFP基因的丝蛋白昆虫病毒，感染蚕的幼虫，用改造的基因取代了蚕的正常基因，当蚕吐丝时这种丝是一种能在黑暗中发绿色荧光的纤维。
4应用特点
GFP这一新型报告基因，在短短几年时间内就得到了众多研究者的青睐，其原因就在于它具有以下优点：
(1)检测方便：因为GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子，也就不存在这些物质可能难进入细胞的问题，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别。
(2)荧光稳定：GFP对光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光照；对高温(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。
(3)无毒害：从目前的研究结果来看，GFP对生活的细胞基本无毒害，对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞仍可连续传代。
(4)共用性和通用性：首先表现在GFP的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达其次是GFP没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧光。
5)易于构建载体：由于GFP分子量较小，编码GFP的基因序列也很短，为所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。
(6)可进行活细胞定时定位观察：对活细胞中蛋白的功能研究，更能接近自然真实的状态。通过GFP可实时观察到外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程，借助于近来广泛使用的。
5展望
尽管GDP基因作为新型报告基因越累越受到关注，但必尽只是近几年的事，对GDP的基础理论研究远远赶不上其应用的速度。目前还存在很多的问题，如除了水母外的其他发光生物（如珊瑚、水螅等）中基因的克隆、是怎样折叠成桶状结构的、突变是如何影响生色团形成的、荧光波长是否可以再增加以适合更多种标记和报告分子及中介转移受体、可否在的分子内部融合其他蛋白质以及研究如何利用生物合成有色纤维、多数生物有微弱的自发荧光现象，并有着类似的激发和发射波长，影响某些GDP的检测，新生GDP通过折叠和加工成为具有活性的性质，过程十分缓慢紫外激发对某些GDP有光漂白和光破坏作用，导致荧光型号快速丧失等。随着对GDP的基础理论研究的发展和新型突变体的不断出现，我们有理由相信这些问题最终会得到解决，它的开发及应用将会带来更加广阔的前景。