小鼠实验方案

酵母提取物对小鼠肝损伤保护作用试验方案

酵母提取物抗氧化能力的测定

概述：

自由基是指是机体代谢的正常产物，在体内有很强的氧化反应能力，可以在细胞代谢的过程中不断地产生。大量的研究结果证明，自由基是衰老的决定因素。

在生命活动过程中产生的各种自由基中轻自由基的作用最强，进攻性也最强，几乎可以和所有的生物分子、有机物或无机物发生不同类型的化学反应。超氧阴离子不仅自身具有毒性，而且可以通过其他反应产生更多的氧自由基，进一步对生物体产生损伤作用。

试验拟采用DPPH自由基体系、超氧阴离子(O2-)自由基体系、羟自由基(HO-)体系以及还原力测定体系评价酵母提取物的抗氧化活性。

试验方法

1）DPPH 自由基清除试验

DPPH储备液配制：精密称取19.7 mg DPPH溶解于25 mL甲醇中，再吸取2.5 mL溶液，以甲醇补足体积至25 mL，得到200 µM DPPH母液，暗处保存备用。

药品及对照品储备液配制：酵母提取物采用甲醇溶解，得到终浓度为1 mM的母液。再将母液加甲醇稀释至一定浓度梯度，加3 mL于比色管中（对照组加入3 mL甲醇或水），再加入1 mL DPPH母液，剧烈震荡后，与暗处保存30 min，以甲醇做空白，测其517 nm吸光值。以Vc作为阳性对照，各组反应平行测定三次，DPPH自由基清除率按照下面公式计算：

×100

DPPH自由基清除率（%）=A0−A1

A0

式中A0代表对照组的吸光值；

A1代表加药组的吸光值。

2）超氧阴离子(O2-)自由基清除试验

采用NADH-PMS方法评估酵母提取物对超氧阴离子自由基的清除能力。试管中依次加入1 mL NBT (81µM)溶液，1 mL NADH (468µM )溶液，1 mL不同浓度的待测溶液，0.4 mL PMS (88µM)溶液，充分混匀，静置5 min，在560 nm处测其吸光值。用水代替待测溶液做阴性对照，水代替PMS做本底组对照，Vc做阳性对照。清除率计算:

清除率(%)=[1-((A a-A b)/A0] X 100%

式中A a为样品吸光值，A b为样品吸光值，A0为阴性对照值。

3）羟自由基(HO-)清除试验

本实验参照文献等提供的方法评估PEP对羟自由基的清除能力。反应液的配制:100 mL 的磷酸盐缓冲液(20 mM pH7.4)中加入EDTA, FeC13和DR (终浓度分别为0.1 mM, 0.1 mM和2.8 mM )。测定时，取反应液1.5 mL，依次加入0.1 mL VC (1 mM )、0.35 mLH2O2(20 mM)及1 mL不同浓度的样品溶液，37℃水浴。20 min后，加入1 mL TBA (1%)和3 mL TCA(2.8%)，90℃水浴，15 min后，532 nm处测定吸光值。D-Mannitol做阳性对照。清除率的计算:

清除率(%)=[1-((A a-A b)/A0] X 100%

式中A a为样品吸光值，A b为样品吸光值，A0为阴性对照值。

酵母提取物对小鼠肝损伤保护作用试验

四氯化碳是一种强有力的肝毒素，被广泛用于诱导肝脏损伤的实验动物，本身对肝细

胞没有毒性效应，但其受到肝微粒体酶活化成为CCL3.，以共价形式与蛋白质结合，导致蛋

白合成障碍，脂质分解代谢紊乱，引起肝细胞内甘油三酯蓄积，同时CCL3*能迅速与氧气结合转化为CCL3OO*，导致脂质过氧化，引起细胞膜变性甚至坏死。

ALT和AST主要存在于肝细胞内，当肝脏发生损伤、坏死或受到破坏时，就会引起谷

丙转氨酶和谷草转氨酶在血清中浓度会偏高，ALT和AST是迄今为止国内外应用最为广泛

的反映肝细胞损害的指标。TC和TG是临床血脂分析的重要指标，当肝细胞受损时二者的

含量将会升高。

丙二酸（MDA）在体内是自然生成的，是氧化应激的标志物，MDA增加的越多可以间

接反映机体细胞受到自由基攻击的程度越大。谷胱甘肽（GSH）是体内重要的抗氧化剂和

自由基清除剂，具有解毒和抗氧化能力，对肝脏有重要的保护作用，当肝细胞或者机体受

到损伤时组织和血液里的含量就会降低；超氧化物在超氧化物歧化酶（SOD）催化作用下

转化为氧气和过氧化氧，能清除超氧阴离子自由基，可见SOD具有使机体的超氧化物减少

的作用，进而达到保护细胞的作用;谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-P X）是机体内的一种重要的

可以促进过氧化物分解的酶，它可以将体内的过氧化物进行分解，从而减轻机体或者组织

受自由基或过氧化物带来的损害；在所有的机体内都存在着酶促反应体系和非酶促反应体

系两种反应类型，这两种反应类型当然也涉及到了机体抗氧化的反应类型。总抗氧化能力（T-AOC）反映了机体酶促反应体系和非酶促反应体系总的抗氧化水平的指标,当机体或者

组织受到伤害时就会使T-AOC的活性水平降低。当肝脏受到损伤时，GSH、SOD、GSH-P X和T-AOC含量的都会不同程度的降低。

试验动物：

昆明小鼠60只，雄性，体重18~22g。

试验试剂：

酵母提取物，联苯双酯配制成10mg/ml的溶液。四氯化碳、花生油。谷丙转氨酶（ALT），谷草转氨酶（AST），总胆固醇（TC），甘油三脂（TG）谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽转移酶（GSH-

P x），超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MDA），总抗氧化能力（T-AOC）。

ALT和AST主要存在于肝细胞内，当肝脏发生损伤、坏死或受到破坏时，会引起谷丙转氨酶和谷草转氨酶在血清中浓度会偏高，和是迄今为止国内外应用最为广泛的反映肝细胞损害的指标。和是临床血脂分析的重要指标，当肝细胞受损时二者的含量将会升高。

试验方法：

1.试验分组：

60只小鼠随机分为空白对照组、模型组、联苯双酯组和低、高、中酵母提取物量组，每组10只。

2.动物给药：

试验前让小鼠自由饮食和摄水，适应性喂养3天。联苯双酯（BP）组小鼠给药0.5ml(500mg/kg·bw)；高中低剂量实验组中给药分别为8 mg/kg·bw、5mg/kg·bw、2 mg/kg·bw；空白对照组和四氯化碳组给予等量的生理盐水，所有组别每天灌胃一次。所有组小鼠连续喂养21天后，第22天，除空白对照组外其余各组均腹腔注射0.8%CCL4油溶剂0.3ml，而空白对照组仅注射等量的花生油。2h后所有动物禁食，水供应充足。48h后对小鼠进行称重麻醉，实行颈椎脱位方式处死。眼球釆血，剥离小鼠肝脏用生理盐水清洗后称重，计算肝脏指数（肝脏指数=肝体质量/小鼠体质量）。离心后的血液样品储存于4°冰箱，小片肝脏冷藏在

-80℃冰箱，以供进一步分析。试验期间观察小鼠皮毛、活动性等，解剖期间观察肝脏颜色。