2.γ-氨基丁酸(GABA)

Chung等人用AQC柱前衍生，检测发芽谷 物中GABA含量，实验发现，发芽谷物在 氮气中储存可以提高其GABA含量，12小 时处理后浓度是处理前四倍，从3.7mg/L增 加到14.3mg/L。
1.高效液相法中各衍生试剂优缺点比较
衍生 邻苯二 试剂 甲醛 (0PA) 2,4-二硝基氟苯 （FDNB） 异硫氰酸苯酯 (PITC) 具有稳定、不 产生水解和不 形成多级衍生 物。 6-氨基喹啉基N-羟基琥珀酰 亚氨基甲酸酯 AQC衍生物非常 稳定，而且反 应后过剩的衍 生试剂以及副 产物不产生干 扰,无需除去。
毛细管电泳-电化学检测
该方法使用比较少。孔令瑶用亚硫酸钠替 代硫醇试剂使GABA与OPA反应，生成稳 定具有电化学活性的衍生物，然后采用毛 细管电泳-电化学检测(CE—ED)法测定发芽 黑米胚芽中GABA的含量。他以自制碳圆 盘电极为工作电极，以50mmol／L的硼砂硼酸缓冲液为运行缓冲液，采用电动进样， 检测池为阴极电泳槽。
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测 定 方 法
薄层色谱
纸电 纸层析 比色 氨基酸分析 泳法 法 法 仪测定
毛细 管电 泳-电 化学 检测
高效 液相 色谱 法
用一定波 长的光照 射在经薄 层层析后 的层析板 上，对具 有吸收或 能产生荧 原 光的层析 理 斑点进行 扫描，用 反射法或 透射法测 定吸收的 强度，以 检测其浓 度。
陈文琼等人用此方法，利用Venusil—AA氨 基酸分析柱(250mm ×4.6mm，5μm)，用 二元梯度洗脱，流动相A为0.05mol／L醋酸 钠溶液(pH=6．5)，流动相B为乙腈-水(80： 20)，检测波长为248nm，得到γ-氨基丁酸的 检测浓度在2.056～12.336μg/ L范围内与峰 面积积分值呈较好的线性关系。Barcina和 Kuo等人也用此方法检测奶酪和豆类中氨基 酸含量，发现有GABA存在。
2.ＧＡＢＡ测定方法比较
测定 薄层 纸电泳法 纸层 方法 色谱 析法 比色法 氨基酸 分析仪 测定 毛细管 高效液 电泳- 相色谱 电化学 法
优点 灵敏 无需昂贵 简单、 设备简单， 准确、 灵敏度 精确度 度高，试剂，普 有效 操作简便， 简便、 高、成 和灵敏 检测 通实验室 和费 经济，快 省时， 本低、 度高。 方便。即可实现。 用低 速、具有 稳定性 试剂用 廉的 良好的精 好，因 量少。 方法。 密度和准 此被大 确度。 量使用。
γ-氨基丁酸与6-氨基喹啉基-N-羟基 琥珀酰亚氨基甲酸酯（AQC）衍生
H N
O
O N
NH2 + CH2-(CH2)2-COOH
H N
H N CH2-(CH2)2-COOH
O + O N
O
O
O
样品衍生化：取10μl样品液至干净的样品管 底部，吸取7μl硼酸盐缓冲液(pH8.8)至样品管 中，短暂涡旋混合，再吸取20μl AQC衍生试 剂至样品管中，混匀15s,室温放置1min；用 石蜡膜封口，置55℃烘箱内加热l0min，取出 转移置样品管中，10μl进样。
氨基酸分析仪测定
方法：以日立835—30型氨基酸分析仪为例，先 按仪器说明配制缓冲溶液及茚三酮溶液，标准 GABA溶液用0.02mol／L盐酸配制成不同浓度， 测得峰面积，绘制标准曲线。把处理的样品按以 上方法峰面积，求出样品中GABA的含量。
张华和何轶通过此方法测得南瓜中GABA 含量为2.956%和沙棘果汁GABA含量为 13.4mg/100ml。Chen和Komatsuzaki也 采用氨基酸分析仪检测发酵牛奶中GABA 含量和发芽糙米经过浸泡和厌氧处理后 GABA含量，结果显示用乳酸菌发酵的牛 奶和发芽糙米处理后GABA含量为80.6mg/ 100g 和24.9 mg/100 g。
孟祥勇采用2，4—二硝基氟苯柱前衍生法 测定发芽前后糙米中GABA的含量，结果 显示：糙米中的γ-氨基丁酸由5.01 mg／ 100g提高到35.03mg／100g。
γ-氨基丁酸与异硫氰酸苯酯(PITC) 衍生
N=C=S +
NH2-CH2-CH2-CH2-COOH
NH-C=S
NH
CH2-CH2-CH2-COOH
比色法
方法：先做GABA标准曲线：取不同浓度的 GABA标准液0.4ml，加0.2mol／L(pH 9.0)硼 酸盐缓冲液0.6 mL，摇匀，加5%苯酚溶液2mL， 摇匀，加质量分数6%次氯酸钠溶液1mL，摇匀， 放人沸水浴加热5min，立即置冰浴中5min，待 溶液出现蓝绿色后，加入2.0mL60％酒精，进 行波谱扫描，在最大吸收峰处测定溶液的吸光 度，以吸光度为纵坐标，GABA的含量为横坐 标，绘制标准曲线。把处理的样品按以上方法 测吸光度，求出样品中GABA的含量。
纸层析法
方法：展开剂V(正丁醇)：V(醋酸)：V(水)=4：1： 3，茚三酮溶解于展开剂中，质量浓度为0.4g/L， 在展开过程中，茚三酮随着展开剂沿滤纸向上移 动。点样后的滤纸条在展开剂中展开、风干显色， 将与标准品位置一致的斑点剪下，用洗脱液[V(1 g／L硫酸铜)：V(体积分数75%乙醇)=2：38]洗 脱，520nm处比色测定。
带电 用一定 利用 的 的溶剂 苯酚 γ 系统展 和次 氨基 开，利 氯酸 丁酸 用不同 钠与 于纸 物质在 游离 上在 固定相 氨反 外电 中的分 应显 场作 配系数 色。 用下 不同， 定向 而使混 移动， 合样品 从而 达到分 达到 离的层 分离 析方法。 目的。
利用各种氨 基酸的两性 离子特性、 极性和分子 大小等性质 的不同，使 用阳离子交 换树脂进行 色谱分析， 采用不同pH 和离子强度 的缓冲溶液 依次进行洗 脱。
பைடு நூலகம் 高效液相色谱法
γ-氨基丁酸与邻苯二甲醛(OPA)衍生
γ-氨基丁酸与2，4-二硝基氟苯（FDNB） 衍生 γ-氨基丁酸与异硫氰酸苯酯(PITC)衍生 γ-氨基丁酸与6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰 亚氨基甲酸酯（AQC）衍生
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γ-氨基丁酸与邻苯二甲醛(OPA)衍生
SH-CH2-CH2-OH
陈海军用异硫氰酸苯酯柱前衍生，紫外检测发 酵液中GABA浓度，在254nm处有最大吸收峰。 杨胜远采用7%(V／V)乙酸水溶液对发酵醪进行 预处理，以异硫氰酸苯酯为衍生剂，用反相 C18柱为分离柱，柱温27℃，阶段洗脱，在 254nm下进行检测。结果表明，发酵醪中的 GABA获得了很好的分离，GABA在0～1.5 mmol／L内线性相关性好，其线性方程 为:y=14106．5713x-258.2493(r=0.9993)。
GABA γ -氨 与邻 基丁 苯二 酸与 甲醛 一些 反应， 化学 生成 物质 稳定 衍生 具有 反应， 电化 生成 学活 稳定 性的 的荧 衍生 光物 物。 质。
薄层色谱
方法：展开剂是正丁醇：醋酸：水=4：1：1。分 别吸取5μl γ-氨基丁酸标准品溶液和样品洗脱液， 点于自制的硅胶薄层板上， 以正丁醇：醋酸： 水体积比为4：1：1为展开剂展开，取出晾干， 用体积分数0.2％茚三酮乙醇溶液显色，105℃烘 数分钟，直至获最大斑点，用Camag TLC scanner 3 扫描仪扫描。扫描条件为：反射式双 波长锯齿扫描,扫描波长λS=515nm,参比波长 λR=680nm，狭缝50×0.45 mm。
γ-氨基丁酸与2，4-二硝基氟苯 （FDNB）衍生
样品衍生化及预处理：以1％FDNB的乙腈溶液作为衍 生剂，取配制好的标准GABA溶液或待测样品1mL置 于10mL棕色量瓶中，加入0.5mol／L NaHCO3 (pH=9.0)溶液1mL，再加入1％2，4-二硝基氟苯的乙 腈溶液1mL，置于60℃水浴中暗处加热1h后取出，冷 却，添加pH=7.0的磷酸盐缓冲液至刻度，混匀，过 0.45μm滤膜。不用时样品于4℃下避光保存。
表一 富含GABA植物
物料 谷物类 糙米 胚芽 处理后米胚芽 发芽糙米（处理后） 米糠 米糠水提取液 米糠水提取液酸水解液 根茎叶类 桑叶 茶鲜叶（CO2气体嫌气处理5h） 乌龙茶（先萎凋，后嫌气处理） 红茶（先萎凋，后嫌气处理） 贵州苦丁茶 鲜蕨 天 花 粉 原 料 栝楼根 川贵栝楼根 王瓜根 长猫瓜根 菠菜 土豆 红薯 山药 羽衣甘蓝 GABA含量 3.8mg/100g 25.4 mg/100g 350～400 mg/100g 40.00 mg/100g 10.90 mg/100g 0.125 mg/100ml 0.253 mg/100ml 226.0 mg/100g 180.2 mg/100g 245.9 mg/100g 176.5 mg/100g 7.130 mg/100g 235.2 mg/100g 0.200% 0.490% 0.860% 0.240% 414 nmol/g 166 nmol/g 137 nmol/g 129 nmol/g 122 nmol/g
葛菁萍利用邻苯二甲醛柱前衍生高效液相 色谱法定量测定短乳杆菌发酵液中γ-氨基丁 酸含量，利用C18色谱柱，以50mmol／L的 乙酸钠(pH6.8)-甲醇-四氢呋喃(A相，82： 17：1；B相，22：77：1，V/V)为流动相进 行梯度洗脱，可以检测到痕量γ-氨基丁酸 (2．2mg／100g)。
归纳有两种不同的衍生方法：
方法一： 样品衍生化：精密量取供试品贮备液适量(80～400μl)， 置1mL量瓶中，加异硫氰酸苯酯—乙腈溶液 (25μl:2mL)200μl，加三乙胺—乙腈溶液(1.4:8.6)稀释至 刻度，摇匀，放置1 h，转移至试管中，加正己烷1mL， 振摇，分取下层液体，滤过，取续滤液作为待测溶液。
纸电泳法
方法：取上清液用于点样于滤纸上，以标准GABA溶 液做对照，在电压300V、室温条件下电泳60min，电 泳缓冲液为吡啶-冰醋酸混合溶液[吡啶：冰醋酸：蒸 馏水(体积比)=2：2：121，pH4.7]。电泳完毕后取出 电泳纸，水平摆放，室温下自然晾干，再在80℃电烘 箱中风干。用喷雾法向电泳纸上均匀喷洒显色剂，于 电热恒温干燥箱中90℃烘10 min，即显出在有氨基酸 区域呈紫红斑点的层析图谱。将与GABA标准品位置 一致的斑点剪下，加4ml洗脱液[洗脱液V(0.1％硫酸铜 溶液):V(75％乙醇溶液)=1:19]洗脱90min，在520nm 波长处比色测定洗脱液的吸光度。
方法二： 衍生试剂：异硫氰酸苯酯(PITC)：甲醇：乙醇： 三乙胺：水= l：6：l：l：l(v：v：v：v：v)；需 新鲜配制。
样品衍生：取GABA标准液或样品液20μl 注入 玻璃试管中，冷冻干燥，然后加入干燥液10μl 【甲醇：1.0mol／L醋酸钠：三乙胺= 2：2：l (v：v：v)】，再一次冻干，再加入20μl衍生化 试剂，室温衍生20min后经冻干置冰箱4℃保存。 10μl进样。
γ-氨基丁酸（GABA）的分布 及测定方法
周青 2110805057 生物化工 导师：汪钊教授
目录
☻分布 ☻γ-氨基丁酸（GABA）含量的测定方法 薄层色谱 纸电泳法 纸层析法 比色法 氨基酸分析仪测定 毛细管电泳-电化学检测 高效液相色谱法 ☻归纳和总结
分布
在动物体内，GABA主要分布于神经组织中， 在哺乳动物的脑组织内分布最为集中，其含量 是单胺类含量的1000倍，而在外围器官中含量 很少。在植物体内，GABA是细胞自由氨基酸 库的重要组分，胞液中有几种构型，可形成类 似脯氨酸的环状结构。高等植物组织中GABA 含量通常在0.3～32.5μmol／g之间，超过许多 蛋白质类氨基酸的含量。
优点 衍生步 硝基苯与氨基结 骤简单、 合牢固，不易被 反应速 水解，故衍生物 度快、 较为稳定。 剩余试 剂不干 扰测定。 缺点 衍生物 FDNB有毒，衍生 不稳定， 化反应副产物二 需快速 硝基苯酚干扰保 进样。 留时间相近的 2,4—二硝基苯氨 基酸的分离与测 定。
PITC毒性大,且 — 需专门的衍生 装置在无水状 态下进行,还会 降低分析柱的 使用寿命。
CHO
+ SH-CH2-CH2-OH + NH2-CH2-CH2-CH2-COOH
CHO
H-CH2-CH2-CH2-COOH
衍生剂的配制：称取10mgOPA，加0.5ml甲 醇溶解后，加入2ml 0.4mol／L硼酸盐缓冲液 (pH9.4)和30μl 2-巯基乙醇，此衍生剂溶液可 保持2d。 样品衍生：取样品或标准溶液10μl，加入上述 溶液100μl， 混匀，反应1min后进样。