流式细胞仪检测外周血树突状细胞
树突状细胞实验报告
一、实验目的1. 了解树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）的基本特性及其在免疫调节中的作用。
2. 掌握DCs的分离、培养和鉴定方法。
3. 学习利用DCs进行免疫调节实验。
二、实验原理树突状细胞是机体免疫系统中重要的抗原提呈细胞，具有摄取、加工和呈递抗原的能力。
DCs在启动、调控和维持免疫应答中发挥着关键作用。
本实验通过分离、培养和鉴定DCs，探讨DCs在免疫调节中的作用。
三、实验材料1. 试剂：胎牛血清、RPMI 1640培养基、DMEM培养基、双抗、TNF-α、IL-4、抗鼠CD14抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG抗体等。
2. 仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、流式细胞仪等。
四、实验方法1. DCs分离与培养（1）取健康小鼠脾脏，置于DMEM培养基中，剪碎后用200目筛网过滤。
（2）将滤液加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2条件下培养。
（3）培养3天后，加入TNF-α和IL-4，继续培养至第7天。
2. DCs鉴定（1）收集培养的细胞，用抗鼠CD14抗体进行标记。
（2）用FITC标记的羊抗鼠IgG抗体进行二次染色。
（3）流式细胞仪检测细胞表面CD14的表达情况。
3. 免疫调节实验（1）将分离得到的DCs与抗原共同培养，观察DCs对抗原的摄取和呈递能力。
（2）将DCs与T细胞共同培养，观察DCs对T细胞的激活作用。
五、实验结果1. DCs分离与培养：培养7天后，观察到细胞形态呈树突状，符合DCs的形态特征。
2. DCs鉴定：流式细胞仪检测结果显示，细胞表面CD14的表达率为（95±3）%，说明成功分离出DCs。
3. 免疫调节实验：（1）DCs对抗原的摄取和呈递：在抗原刺激下，DCs能够摄取并呈递抗原，说明DCs具有抗原摄取和呈递能力。
（2）DCs对T细胞的激活作用：在DCs与T细胞共同培养条件下，观察到T细胞增殖，说明DCs具有激活T细胞的作用。
树突状细胞的体外培养及鉴定
【 关键 词】 外周 血 ； 核细 胞 ； 突状 细胞 ； 外扩增 单 树 体
【 中图分类号１ ３ ２ １ Ｒ ９．ｌ
【 文献标பைடு நூலகம்码】 Ａ
【 文章编号】０４ ６ ７ （０７ ０－ １３ ０ １０ － ８９２ ０ ）２ ０ － ３ ｌ
ＣＩ ＩＩ ＴＥ ＡＮＤ Ｉ Ｔ、 Ｄ ＤＥＮＴⅡ Ｄ ｏＦＤＥＮ ＲＩ Ｃ Ｄ ＴＩ ＣＥＬＬＳＩ Ｖ Ｔ Ｎ Ｉ ＲＯ
（． １河北 工程 学院 医学 院 ，河北 邯郸
０ ６２ ；２ 北 京大 学基 础医 学院 ） ５ ０９ ．
【 摘要】 目的： 建立树突状细胞 （ｅｄ ｉｃｃｌ ， ｓ体外培养的方法。 ｄｎ ｒ ｉ ｅ ｓＤＣ ） ｔ ｌ 方法： 从正常人外周血分离获得单
核细 胞 ， 入ｒ Ｇ 加 ｈ Ｍ—Ｃ Ｆｌ ０ Ｕ／ｎ 、ｈ Ｌ ４ ０ Ｕ／ 体 外培 养 。 培养 ７ 的细胞 ， Ｓ ０ ０ ｒｌｒ ｌ － ５ ０ ｍｌ 取 天 采用 免疫 细胞化 学方 法和流 式细胞仪 测定细胞表 型 ， 并对其 进行鉴 定。 结栗 ： 免疫细 胞化 学方 法显示 ，０／ ９ ￣以上 培养７ 的细胞表 ， ０ 天
Ｍ ｏ ｏ ｙ ｅ ｒ ｂ ａ ｎ ｄ ｆ ｏ ｎ ｒ ｌ ｕ ｎｐ ｒｐ ｅ ａ ｌ ｏ ｎ ｕ ｔ ａ ｅ ｎ ｖｔｏ ｗｉ ＧＭ － Ｆ １ ０ Ｕ／ ｎ ｃ ｔｓ ｗｅ ｅｏ ｔ ｉ ｅ ｍ ｏ ｍａ ｍａ ｅ ｈ ｒ ｌ ｏ ｄ ａ ｄｃ ｌ ｖ ｔｄ／ ｉ ｔ ｒ ｒ ｈ ｉ ｂ ｉ ｒ ｈ ｈ ＣＳ ０ ０
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ＶＯ ． ４ Ｎｏ． ２ ０ １２ ． ２ ０７
Ｊ ０ＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＥ Ｃ ＮＧＤＥ Ｍ Ｅ ＣＡＬ ＣＯＬ ＧＥ ＤＩ ＬＥ
树突状细胞培养方法
树突状细胞培养方法树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是一类免疫细胞，主要负责识别和激活T细胞，发挥着重要的免疫调节和抗肿瘤等作用。
为了进行树突状细胞的研究，科研人员需要对其进行体外培养。
本文将介绍常用的树突状细胞培养方法。
1.制备树突状细胞前驱细胞：树突状细胞前驱细胞主要存在于外周血和骨髓中。
首先，采集外周血或骨髓，并将其进行红细胞裂解。
然后，用PBS洗涤样品，离心沉淀细胞。
最后，将细胞进行培养。
2.培养基的选择：培养树突状细胞需要选择适宜的培养基。
目前常用的培养基有RPMI1640、DMEM等。
添加10-20%的胎牛血清（FBS）可以提供必要的生长因子和营养物质。
3.添加生长因子：在培养树突状细胞的过程中，可能需要添加一些生长因子来促进细胞的分化和增殖。
常见的生长因子包括GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）和IL-4（白细胞介素4）。
可以将这些生长因子添加到培养基中，以达到最佳生长条件。
4.细胞培养条件的控制：树突状细胞对培养条件非常敏感。
因此，需要对温度、湿度、CO2浓度等参数进行严格控制。
一般来说，将细胞培养在37摄氏度、5%CO2的培养箱中。
5.细胞的分离和传代：在树突状细胞培养过程中，细胞会不断增殖。
为了保证细胞的活力和稳定性，需要定期分离和传代细胞。
可以使用胰酶等消化酶将细胞从培养瓶中剥离，然后进行细胞计数并按照一定比例进行传代。
6.细胞质量的评估：在培养树突状细胞的过程中，需要对细胞质量进行评估。
可以通过使用流式细胞仪等设备来检测细胞表面标记物的表达情况，以及细胞活力、树突状突起的形态等指标来评估细胞的质量。
7.树突状细胞的激活：树突状细胞的主要功能是激活T细胞。
为了使树突状细胞具备充分的抗原递呈能力，可以使用多种促进细胞激活的方法，如脂多糖、TNF-α等。
总结：树突状细胞培养方法包括制备前驱细胞、培养基选择、生长因子添加、细胞培养条件控制、细胞分离和传代、细胞质量评估以及细胞的激活等步骤。
脑胶质瘤患者外周血DC细胞的检测及其临床意义
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｔ ｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｄ Ｃ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｉ ｎ ｐ ａ ｔ ｉ ｅ ｎ ｔ ｓ ｗ ｉ ｔ ｈ ｂ ｒ ａ ｉ ｎ ｇ ｌ ｉ ｏ ｍａ ａ ｎ ｄ ｅ ｘ ｐ ｌ ｏ ｒ ｅ ｉ ｔ ｓ ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ ｓ ｉ ｇ ｎ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ．
Ｔ ｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｄ Ｃ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｉ ｎ ｐ ａ ｔ ｉ ｅ ｎ ｔ ｓ ｔ Ｉ ｌ ｂ ｒ ａ ｉ ｎ ｇ ｌ ｉ ｏ ｍａ ａ ｎ ｄ ｉ ｓ ｔ ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ ｓ ｉ ｇ ｎ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ Ｗ ＡＮ Ｇ Ｗｅ ｆ ｉ ｅ ， ， Ｚ Ｈ Ａ ＮＧ Ｚ ｈ ｉ ｆ ｅ 嘭 ．
术后 ７ ｄ恢 复 到术 前 水 平 （ 尸 ＞ ０ ． ０ ５ ） 。 结论 胶 质瘤 患 者 中 存 在 Ｄ Ｃ细 胞 的低 表 达 ． 不 同分 级 之 间 Ｄ Ｃ细 胞 表 达 存 在 显 著 差 异 ．
手术治疗可以显著减低 Ｄ Ｃ细 胞 表 达 ． 为 胶 质 瘤 患 者 围手 术 期 免 疫 治 疗 的时 期 选 择 提 供 了一 定 的理 论突 状 细胞 ： 神 经 外 科
中图分类号 ： Ｒ ４ ４ ６ ． ８ ， Ｒ ７ ３ ９ ． ４ １
文献标 识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ６ ７ ４ — １ １ ２ ９ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ２ — ０ １ ９ ６ — ０ ３
健康人骨髓和外周血树突状细胞的分类和计数
文章编号(A rticle ID ):1009-2137(2009)05-1255-06#论著#健康人骨髓和外周血树突状细胞的分类和计数王东侠,林海荣,王亚哲,常艳,郝乐,刘艳荣北京大学人民医院、血液病研究所,北京100044摘要 本研究应用流式细胞仪采用两种四色抗体组合检测并计数国内健康个体骨髓和外周血树突状细胞DC 亚群。
检测35例健康骨髓中L i n -H LA-DR +CD11c hi BDCA 1+的mDC 和L i n -HLA-DR +CD 123hi BDCA 2+的p DC 数量,并与普遍采用的L i n -HLA-DR +CD11c h i 的mDC 和L i n -HLA-DR +CD123hi pDC 的三色设门方法进行比较。
结果表明:骨髓中DC 亚群的绝对计数和pDC 的相对计数均随年龄的增加而降低;男性DC 亚群的绝对计数值高于女性(p <0.05)。
三色和四色设门方法均显示健康个体骨髓和外周血DC 亚群的分布不同(p <0.05)。
外周血中mDC 含量较高,两种方法检测的mDC 与pDC 的比值分别为2.70和2.31;骨髓与外周血截然不同,骨髓中含有大量pDC ,mDC 与pDC 的比值分别为0.90和0.71。
三色和四色的流式分析方法显示具有很好的相关性(相对计数mDC r =0.86;pDC r =0.96,绝对计数mDC r =0.95;pDC r =0.98)。
两种方法检测的DC 亚群计数除在外周血p DC 检测无明显差异外,外周血中的mDC 和骨髓中mDC 与p DC 计数均明显不同(p <0.001),三色方法确定的值明显高于四色方法,因三色方法确定的mDC 与pDC 中分别存在一定比例的L i n -HLA-DR +CD11c hi BDCA 1-细胞和L i n -HLA-DR +CD123h i BDC A 2d i m /-细胞,在骨髓中这些细胞比例较高。
口腔癌患者外周血树突状细胞的体外培养及表型分析
ｆ ０ ｒ ７ ｄ ａ ｙ ｓ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ．Ｔ ｈ ｅ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｅ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｄ ｃ ｅ Ｈｓ Ｗ ｓ ａ ｏ ｂ ｓ ｅ ｒ ｖ ｅ ｄ ｂ ｙ ｌ ｉ ｇ ｈ ｔ ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｓ ｃ ｏ ｐ ｙ ａ ｎ ｄ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｎ ｉ ｃ ｍｉ ｃ ｏｓ ｒ ｃ ｏ ｐ ｙ ．Ｔ ｈ ｅ ｐ ｈ ｅ ｎ ｏ ｔ ｙ ｐ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ Ｃ Ｄ８ ３， Ｃ Ｄ１ ａ ， Ｃ Ｄ８ ６，ＣＤ ８ ０， ＨＬ Ａ－ ＤＲ ｗ ｅ ｒ ｅ ｎａ ａ ｌｙ ｓ ｉ ｚ ｅ ｄ ｂ ｙ ｌｏ ｆ ｗ ｃ ｙ ｔ ｏ ｍｅ ｔ ｒ ｙ ． Ｒｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ： Ｔ ｙ ｐ ｉ ｃ ｌ ａ ＤＣ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ｔ ｗ ｏ ｒｏ ｇ ｕ ｐ ｓ ａ ｆ ｔ ｅ ｒ ７ ｄ ａ ｙ ｓ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ．Ｔ ｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｒ ａ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｃ Ｄ ８ ３， ＣＤ１ ａ ｏ ｎ ＤＣ
【 摘要 】 目的： 研究 口腔癌患者外周血单核细胞来源 的树 突状 细胞 （ ｄ ｅ ｎ ｄ ｉ ｒ ｔ ｉ ｃ ｃ ｅ ｌ ｌ ， Ｄ Ｃ ） 形态 、 表型 ， 与正 常人
进行 比较并分 析其 Ｉ 临床 意义。方法 ： １ ５例 口腔癌患者 （ 实验组 ） 及 正常人 （ 对照 组 ） 外 周血单 核细 胞经 Ｇ Ｍ ．
Ｄ ｕ ａ ｎ Ｙ ｕ ｑ ｉ ｎ ，Ｃ ｈ ｅ ｎ ｇ Ｌ ｊ ｉ ｕ ｎ ，Ｇ ｕ ｏ Ｌ ａ ｎ ｔ ａ ｏ ，ｅ ｔ ａ １ ． ｅ Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｏ ｒ ａ ｌ Ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ Ｆ ｏ ｕ ｔ ｒ ｈ Ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ，
树突状细胞亚群检测
树突状细胞亚群检测操作程序一、适用范围：外周血或骨髓液中树突状细胞亚群检测。
二、实验原理：人外周血中树突状细胞主要是不成熟DC，有两个亚群，与血液中其它细胞相比，DC细胞有独特的免疫表型。
以此为依据，来检测外周血中树突状细胞的百分含量。
DC1不表达lin（CD19、CD20、CD56、CD14、CD3），高表达HLA-DR 和CD11c；DC2不表达lin（CD19、CD20、CD56、CD14、CD3），高表达HLA-DR和CD123。
利用四色流式细胞仪分析技术，检测出DC1与DC2的百分比。
三、主要试剂：1、Lineage Cocktail-FITC (美国BD Biosciences公司；CAT:340546)，2、Mouse IgG1-PE (美国BD Biosciences公司；CAT:349043)3、Mouse IgG1-APC (美国BD Biosciences公司；CAT:340442)4、CD123-PE(美国BD Biosciences公司；CAT:340545)5、CD11c-APC(美国BD Biosciences公司；CAT:340544)6、HLA-DR-PreCP(美国BD Biosciences公司；CAT:347364)四、实验操作：抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml；或新鲜肝1、标本采集：使用EDTA-K2素抗凝骨髓1.0ml。
2、染色和固定细胞：（1）标本管编号A，另取流式专用试管两只AT(测定)、AC（对照）。
（2） AT管加入Lineage Cocktail-FITC、HLA-DR-PreCP、CD123-PE、CD11c-APC各20ul。
AC管加入Lineage Cocktail-FITC、HLA-DR-PreCP、Mouse IgG1-PE和Mouse IgG1-APC各20ul。
（3） AT、AC管中加入全血或骨髓100ul，混均。
（4）置室温，避光孵育15min。
肿瘤患者外周血树突状细胞亚群的变化及意义
要 目的 探 讨肿 瘤 患者外 周血树 突状 细胞 亚群 的 变化及 临床 意 义。方法
采用 流式 细胞术检
测 ２ 例肿瘤 患者和 １ ３ ９例健康 人外周血 ｃ １ 、Ｃ １ Ｄ Ｃ １ Ｄ ３ ２ 的树 突状 细胞 亚群和淋 巴细胞 的数量 。结果 正常对 照组 外周血 Ｃ １ ｃ Ｄ Ｄ ＋ Ｃ占白细胞 比例为 Ｏ １ ％±Ｏ Ｏ ％ １ ． ９ ． ８ ，绝对数 为 （ ． ９ ３±３ ９ ×１ ／ ： ． ） 个 Ｌ ０ ６ Ｃ １ Ｄ 点 白细胞 比例 为 Ｏ １ ％± Ｏ Ｏ ％ Ｄ ３ ｃ ２ ． ５ ． ，绝对数 为 （ ． ７ ７ ５± ３ ５）×１ ／ 。肿瘤患者组 外周血 ． 个 Ｌ Ｏ
单 克隆抗体 各 １ ；每管加 Ｅ Ｔ 抗凝新鲜全血 ０ｕ ｌ ＤＡ １０Ｉｌ 振 荡混匀 ， ０ ， Ｊ 室温暗 处反应 １ｍ ｎ ５ ｉ；加入 ２ ｌ ｍ Ｆ Ｃ 溶血素 ，振荡混匀 ，室温 暗处反应 １ｍ ｎ ＡＳ Ｏ ｉ； ３０ 离心 ５ ｉ ，弃上清；振 荡混 匀，加入 ｉ ｌＰ Ｓ ０ｇ ｍｎ ｍ Ｂ 液；３ ０ 离心 ５ ｉ ，弃上清；振荡混匀 ，加入 １ ０ｇ ｍｎ ％ 细胞 染色方法如下：取两只 Ｔ ｕ Ｏ Ｎ 管 ，分别加 ｒ ＣＵＴ
流式细胞仪检测外周血树突状细胞
流式细胞仪检测外周血树突状细胞分析CD123+（抗IL-3受体α链）和CD11c+树突状细胞亚群概述树突状细胞（DC）的主要功能是吸收抗原，进行加工，并向T淋巴细胞呈递。
其它抗原呈递细胞也有此功能，如B淋巴细胞和单核细胞。
但是，与其它细胞不同的是，DC细胞具有诱导初发免疫反应的独特功能，例如，可以活化处女T细胞（Naive T cell）。
DC细胞存在于外周淋巴组织中，已在血液和非淋巴器官中发现了不同类型的DC细胞，并被认为是淋巴组织中细胞的前体。
由于血液和组织中DC细胞含量少，且缺乏特异的DC标记物，所以DC细胞的研究非常困难。
因此，关于DC细胞的了解主要来自于通过密度梯度离心、培养、和/或阴性选择富集后的DC细胞的研究。
这些过程利用了DC细胞的密度和黏附特征，和在一定细胞因子条件下的选择性生长，或缺乏淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的系列标记物的表达。
但是，这些方法中DC细胞的产率和纯度较低，且费时费力。
而且，这些操作可以影响细胞的功能，并且无法做DC细胞含量的定量分析。
最近的报告发现在活化DC细胞和血液或淋巴细胞分离培养的DC细胞表面CD83和CMRF-44高表达。
CD83和CMRF-44可以作为DC细胞的活化标志物，但在体内或未处理的细胞上没有特征性表达，或表达水平很低。
在对新鲜分离的DC细胞的研究中，发现IL-3Rα在淋巴器官的DC细胞上有特异表达。
从人类外周淋巴组织中分离的单个核细胞中主要是此类DC细胞。
IL-3Rα（CD123）抗体可以用来进行免疫磁珠分选，从外周淋巴组织制备的单个核细胞样本中，将CD123+ DC细胞进行200倍富集。
CD123抗体还可以用来做免疫组化分析，特异识别滤泡外T细胞富集区的CD123+ DC。
在外周血中也有CD123+ DC细胞，与以前所说的CD11c- DC细胞和CD33dimCD14-CD16- DC细胞是同一类细胞。
由于缺乏DC特异性标记物，目前仍然不清楚DC是否是自成一系的一类细胞。
不同诱导方法对人外周血树突状细胞体外成熟的影响
【 ｂｔ ｃ】 Ｏ ｊｃｖ Ｔ ｖｓｇｔ ｔ ｍ ｎｙｅｅ ｆ ｉｅ ｎ ｃｔ ｉ ｎｉｍ ｔ ｅ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂｅｔｅ ｏｉ ｅｉ ｅ ｈ ｉ ｕｉ ｆｃ ｏ ｄｆｅｔ ｙ ｋ ｅｏ ａ ｒ ｉ ｎ ｔａ ｅ ｍ ｔ ｆｔ ｆｒ ｏ ｎ ｍ ｕ
ｄ ｎ ｒｔ ｅｌ ｎ ｖｔ ． Ｍ ｅ ｈ ｄ Ｔ ｅ ｈ ｍａ ｎ ｃ ｔ — ｅ ｖ ｄ ｄ ｎ ｒ ｉ ｅｌ ｗｅ ｅ ｉ ｄ ｃ ｄ ｉ ｈ ｅ ｄ ｉ ｃ ｌ ｉ ｉ ｏ ｉ ｃ ｓ ｒ ｔ ｏ ｓ ｈ ｕ ｎ ｍｏ ｏ ｙｅ ｄ ｒ ｅ ｅ ｄ ｉ ｃ ｃ ｌ ｒ ｎ ｕ ｅ ｎ ｔ ｅ ｉ ｔ ｓ
ｅ ｄ ｃ ｔ ｃ ｉｉ ，Ｔ ｃ ｌ ｔ ｌ ｔｒ ｒ ｌ ｅ ａｉ ｎ ｃ ｐ ｃｔ ｎ ｏ ｙｉ ａ ｔ ｔ ｃ ｖｙ ｅｌ ｓｉ ａｏ ｙ ｐ ｏｉ ｒ ｔ ａ ａ ｉ ｓ ｍｕ ｆ ｏ ｙ，ａ ｄ Ｉ 一 ２ ４ ｒ ｄ ｃｉｎ ｎ Ｌ １ ｐ ０ ｐ ｏ ｕ ｔｏ ．Ｒｅ ｕ ｔ Ａｍｏ ｇ ｓｌ ｓ ｎ
・
不 同诱 导方法对人外 周血树 突状 细胞体 外 成 熟 的影 响
刘璐 李琳 伍 衡 闵军 王 捷 曾 育杰 褚 忠华
探讨 不 同诱 导方式对 于体外 培养 的树突状 细胞 （ｅｄｔ ｌ ，Ｃ 免疫刺 激 ｄｎｒｉｃ ｌ Ｄ ） ｉ ｅｓ ｃ
通过 ｒＧ Ｃ Ｆ和 Ｉ一 ｈ Ｍ． Ｓ Ｌ４体外诱 导 的人外周 血单核细胞来 源 的 Ｄ 分别用肿 瘤 Ｃ，
标 记 小 鼠 抗 人 Ｃ ８ 与 ＨＬ ． Ｄ３ ＡＤＲ、 异 硫 氰 酸 （ｕｒｃｉｉ ｔｉｃａａｅＦＴ ） ｌ ｆ ｏｅｅｎｓ ｈｏｙｎｔ，ＩＣ 标记 小 鼠抗 人 Ｃ ８ 、 ｏ Ｄ ６
树突状细胞亚群检测
树突状细胞亚群检测操作程序一、适用范围：外周血或骨髓液中树突状细胞亚群检测。
二、实验原理：人外周血中树突状细胞主要是不成熟DC，有两个亚群，与血液中其它细胞相比，DC细胞有独特的免疫表型。
以此为依据，来检测外周血中树突状细胞的百分含量。
DC1不表达lin（CD19、CD20、CD56、CD14、CD3），高表达HLA-DR 和CD11c；DC2不表达lin（CD19、CD20、CD56、CD14、CD3），高表达HLA-DR和CD123。
利用四色流式细胞仪分析技术，检测出DC1与DC2的百分比。
三、主要试剂：1、Lineage Cocktail-FITC (美国BD Biosciences公司；CAT:340546)，2、Mouse IgG1-PE (美国BD Biosciences公司；CAT:349043)3、Mouse IgG1-APC (美国BD Biosciences公司；CAT:340442)4、CD123-PE(美国BD Biosciences公司；CAT:340545)5、CD11c-APC(美国BD Biosciences公司；CAT:340544)6、HLA-DR-PreCP(美国BD Biosciences公司；CAT:347364)四、实验操作：抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml；或新鲜肝1、标本采集：使用EDTA-K2素抗凝骨髓1.0ml。
2、染色和固定细胞：（1）标本管编号A，另取流式专用试管两只AT(测定)、AC（对照）。
（2） AT管加入Lineage Cocktail-FITC、HLA-DR-PreCP、CD123-PE、CD11c-APC各20ul。
AC管加入Lineage Cocktail-FITC、HLA-DR-PreCP、Mouse IgG1-PE和Mouse IgG1-APC各20ul。
（3） AT、AC管中加入全血或骨髓100ul，混均。
（4）置室温，避光孵育15min。
人外周血富集白细胞层来源的树突状细胞的培养与鉴定
万方数据１１９６巴细胞分离液的１５ｍＬ试管中，用吸管取６ｍＬ稀释的细胞悬液，在分层液上ｌｃｍ处。
沿试管壁缓慢加入。
移至离心机中，水平室温，２０００ｒ／ｒａｉｎ，离心２０ｍｉｎ离心后管内由上至下分为血浆、单个核细胞、淋巴细胞分离液、红细胞４个带；吸取单个核细胞层，移入另一试管中，加３～４倍ＰＢＳ，混匀，以１０００ｒ／ｒａｉｎ，离心１０ｒａｉｎ，ＰＢＳ洗细胞２次；８００ｒ／ｒａｉｎ，离心５ｍｉｎ，ＰＢＳ洗细胞２次。
将离心收集后外周血单个核细胞放于２５ｃｍ２培养瓶内，加入含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基，于３７℃、５％ＣＯｚ浓度孵箱内培养静置２ｈ，可见分为黏附于瓶壁的细胞和非黏附细胞。
吸出非黏附细胞，冻存备用。
１．２．１．２ＤＣ细胞的诱导培养贴壁的黏附细胞加入含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基５ｍＬ，调整细胞浓度为２×１０６个／ｍＬ，加入细胞因子ｒｈＧＭ－ＣＳＦ及ｒｈｌＬ－４，使其终浓度为２００ｎｇ／ｍＬ及１００ｎｇ／ｍＬ．然后置３７＂Ｃ、５％Ｃ０２孵箱内培养，培养７２ｈ追加１次，培养６ｄ后加入细胞因子ＴＮＦ－ａ，以促进ＤＣ成熟。
１．２．２细胞的形态观察倒置显微镜下每天观察培养中的ＩＸ；的细胞数目、形状、外观、生长状况等。
１．２．３ＤＣ免疫表型检测采用直接免疫荧光染色法，在流式细胞仪上检测分析。
分别取第３天、第７天培养的ＤＣ．ＰＢＳ液，１０００ｒ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ离心洗涤１次，弃上清；ＰＢＳ重悬细胞，调整细胞浓度为１×１０６个／ｍＬ，加入ＥＰ管，每管Ｓ００肛Ｌ，然后分别加入２０／ｚＬ单克隆抗体ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ６３、ＣＤｌａ以及１０“Ｌ各单克隆抗体的同型阴性对照，常温避光保存３０ｒａｉｎ，用ＰＢＳ液洗涤两遍，洗去多余的抗体，流式细胞仪（ＢＤ，美国）检测。
１．２．４成熟ＤＣ的数量取成熟１３（２的混悬液１０／ｔＬ放置在倒置显微镜下计数。
按照公式：计数的个数（１０９Ｌ）Ｘ１０３×混悬液的体积（ｍＬ）＝成熟ＩＸ；的个数／每份白膜．１．３统计学方法所得数据取平均值，以ｊ士ｓ表示，采用ＳＰＳＳｌ０．０统计程序进行统计分析Ｉ均数的比较用配对ｔ检验分析，Ｐ＜０．０１为差异有统计学意义。
流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南
488nm的 激 发 光 源 激 发 ,最 大 发 射 波 长 分 别 为
525nm、 575nm、 670nm、
675nm和
613nm。
别 藻 青 蛋 白 (APC)的 激 发 光 源 为 630nm,最 大 发 射 波 长 为 660nm。
3.2
溶血素 使 用 与 仪 器 相 匹 配 的溶 血 素 (内 含 固定 液 ),并 严 格 按 照 使 用 说 明 和 注 意 事 项 进 行 操 作 。 如 果 使 用
FCSC Count StandardtM(Flow C~vt° metry Standards Corporaton)和
TruCountTM(Becton Ekkns° ω 等 。
4
标 本 采集 和 处理 生物 安 全 血 液 和体 液 标 本 中可 能存 在致 病 性 甚 至致 死 性 的活 体 病 原 微 生 物 ,所 有 标 本 都 应 当作 潜 在 传 染 源
3.1.2
单抗对 细胞 的反应 性
CD45表 达 于 所 有 白细 胞 ;CD3表 达 于 T淋 巴细 胞 ;CD4表 达 于 T辅 助 /诱 导 淋 巴细 胞 (CD4+T细 胞 )和 单 核 细 胞 ;CD8表 达 于 细 胞 毒 T细 胞 (CD8・ T)和 NK细 胞 ;CD19表 达 于 B淋 巴 细 胞 ;CD16表 达 于 NK细 胞 、 核 巨 噬 细 胞 、 细 胞 和 树 突 状 细 胞 等 ;CD56表 达 于 NK细 胞 和 细 胞 毒 T细 胞 。 单 粒
2
术语和定 义 下 列 术 语 和定 义适 用 于 本 文 件 。
2.1
分 化 抗 原 cIuster of differentiation,CD 活 成 不 同谱 系 细 胞 在 分 化 、 熟 、 化 过 程 中 ,出 现 或 消 失 的 细 胞 表 面 标 志 。 细 胞 表 面 标 志 通 常 用 单 克 隆抗 体 来 识 别 。每 个 抗 体 都 有 指 定 的 CD编 号 ,能 被 特 定 抗 体 识 别 的特 定 抗 原 通 常 具 有 相 同 的 编 号 ,例 ” “ ” “ 如 ,被 CD1抗 体 识 别 的抗 原 称 为 tlDl抗 原 。
树突状细胞流式标记方案
树突状细胞流式标记方案
树突状细胞是免疫系统中非常重要的细胞类型，它们能够启动和调控
免疫应答。
为了深入研究树突状细胞的功能，我们需要对其进行准确
的鉴定和流式标记。
以下是一个常用的树突状细胞流式标记方案：
1. 细胞表面标记
树突状细胞的细胞表面通常表达CD11c、CD11b、CD103和MHC-II 等标记物。
其中，CD11c是树突状细胞的常见标志，常与其他标记物
结合使用，比如CD11c+ CD8+代表胸腺型树突状细胞，CD11c+
CD11b+代表外周型树突状细胞。
2. 胞浆标记
树突状细胞具有特殊的细胞形态学特征，可以通过荧光染料或抗体进
行标记。
例如，一些标记可用来检测树突状细胞分泌细胞因子的能力，如IL-12、TNF-α和IL-6等。
3. 核标记
核标记用于鉴定树突状细胞的核型形态，常用的核标记包括DAPI、
Propidium iodide (PI)和Hoechst 33342等。
总结起来，树突状细胞流式标记方案需要对细胞表面标记、胞浆标记和核标记进行综合考虑，才能准确的鉴定和分离树突状细胞。
此外，由于树突状细胞具有很强的多样性，所以在流式标记时需要注意选择适当的标记物组合来进行分析。
树突状细胞的鉴定
一、流式细胞仪分离法【原理】根据待分离的免疫细胞膜表面抗原的不同，制备出相应的荧光标记抗体，分离前，首先将待分离细胞制成单细胞悬液，经相应的荧光标记抗体染色后，进入流式细胞仪。
此细胞仪以激光为光源，通过高速流动系统将样品中的细胞排列成行，一个一个地从流动室喷嘴处流出，形成细胞液柱。
液柱与高速聚焦的激光束垂直相交，细胞受到激光激发后产生散射光并发射荧光，由光电倍增管接收光信号并转化成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨出细胞的类型，并对各类型分别计数和统计。
同时，细胞根据其表面的电荷使液滴瞬间感应相应的带电性，然后在电场的偏转作用下进入不同的收集管，从而将各种免疫细胞分离。
用FACS(流式细胞仪)分离细胞准确快速，分选纯度高（为99%），不损伤细胞活性，可在无菌条件下进行，并可直接统计出各类细胞的相对含量。
【器材与试剂】1.抗CD11c、CD83的单克隆抗体。
2.FITC—羊抗鼠IgG。
3.正常小鼠IgG 。
4.细胞洗涤液(NaCl 8.47g，K2HPO4 4.11g，KH2PO4 1.36g，NaN3 0.1g，20ml，加蒸馏水至1000m1)。
5.红细胞裂解液(KHCO3 1.0g，NH4C1 8.3g，EDTA 37mg，加蒸馏水至100ml)。
6.固定液(25％戊二醛3.2ml，葡萄糖2.0g，加无血清上述细胞洗涤液至100m1)。
7.肝素抗凝血。
8.离心机、流式细胞仪等。
【方法】1.取肝素抗凝血0．4ml，分别加入4支小试管中（其中3支为待测管，1支为对照管）各0.1ml。
然后在各待测管中分别加入0.1ml抗CD11c、CD83的单克隆抗体(1：1000稀释)，对照组加入.正常小鼠IgG ，30℃孵育45min。
2.加入细胞洗涤液3ml，1000r／min，离心2min。
以洗去未结合的抗体，重复洗2次。
3.摇匀管底沉淀细胞。
加入0.1ml FITC-羊抗鼠IgG，30℃孵育45min。
4.加入红细胞裂解液3ml，见红细胞悬液变为真溶液时，立即以1000r／min离心2min。
流式细胞术原理及树突状细胞的检测.ppt
• FITC
488
525
绿色
• PE(RD1)
488
575
橙色
• ECD
488
620
橙红
• PeCy5
488
675
深红
• PI
488
620
橙红
用途
颜
免疫荧光
免疫荧光
免疫荧光
免疫荧光
DNA染色
滤片
• 带通滤片 BAND PASS (BP)
• 只允许某些波长的光通过
630 nm BandPass Filter
• 标本台
• 流动室(flow cell)
• 鞘液SHEATH：(ISOTON II, III) PBS
• 无颗粒，无荧光本底 • 无菌，稳定的pH
• 样本流SAMPLE 单细胞悬液5×105－1×106个/ml
• 放大部分
• 光电倍增管PMT HV • 放大电路 GAIN 增益
• 线性：LIN • 对数：LOG
基础研究
淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞 研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分 析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤 相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、 癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究
基本原理
• 光源
• 488nm兰绿色，15mW空冷，氩离子激光或633nm氦氖激光
• 统计：计算机
FLOW CELL
Fluorescence signals
Focused laser beam
Injector Tip
Sheath fluid
FLOW CYTOMETRY(FCM)
树突状细胞检测方法
树突状细胞检测方法
嘿，咱今儿就来聊聊树突状细胞检测方法这档子事儿。
你说这树突
状细胞啊，就像是身体里的小哨兵，可重要着呢！那怎么才能知道它
们是不是在好好工作呀？这就得靠检测方法啦。
先来说说流式细胞术吧。
这就好比是给树突状细胞来个大点名，通
过各种标记，能清楚地知道它们的数量啊、状态啥的。
你想想，这是
不是很神奇？就像在茫茫人海中一下子就能认出特定的那些人一样。
还有免疫组化呢，这就像是给树突状细胞拍个特写照片。
能让我们
在显微镜下清楚地看到它们的样子，是不是很厉害？这能帮助我们更
直观地了解它们的分布和特征呀。
再讲讲酶联免疫吸附试验，这就好像是个超级侦探，能检测出和树
突状细胞相关的各种分子，从而推断出它们的活动情况。
你说妙不妙？
咱平时做这些检测，不就是为了更好地了解身体里的这些小哨兵嘛！要是它们出了啥问题，咱不就麻烦啦？那我们不得赶紧想办法解决呀！要是没有这些检测方法，咱不就像盲人摸象，啥都不知道啦？
比如说，要是不知道树突状细胞的数量少了，那免疫系统可能就没
办法好好工作啦，各种病菌不就趁机捣乱啦？那我们不得生病呀！所
以说，这些检测方法可太重要啦，它们就像是我们了解身体内部情况
的眼睛呀！
那检测的时候可得仔细着点，就跟咱出门得好好打扮一样，不能马虎呀！要是检测错了，那可就糟糕啦。
你说这树突状细胞检测方法是不是很有意思？它们能帮我们揭开身体里的好多秘密呢！咱可得好好利用这些方法，让自己的身体健健康康的呀！这可不是开玩笑的，咱得重视起来呀！总之，树突状细胞检测方法是我们了解身体、保护身体的重要手段，我们可不能小瞧它们哟！。
过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞功能变化及黄芪的体外干预
介素１ 、白细胞介素１ 、白细胞介素１ 的水平， ０ ２ ８ 同时观察了黄芪对它们 的影响， 以进一步探讨树 突状 细胞在 过敏性紫癜发病机制中的作用并为 黄芪治疗过敏性紫癜提供理论基础 。
ｑｚ９ ｙ ｈ ８１ ６＠
１ ３ｃ ６ ．ｏｍ 中 图分 类 号 ： ３ ８ Ｒ １ 文 献 标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：６ ３ ８ ２ １ ７ －２ ５
ＣＤ ６（ ７２ ８ Ｂ － ）的表达和树突状细胞分泌白细胞
０ 引言
（０ ９０ —０ ５ —４ ２ ０ ） １０ １ ７０
Ｗ ．Ｒ Ｅ ．ｒ ＷＷ Ｃ Ｔ Ｒ ｏｇ
陈永兴
．
等．过敏性紫癜患ｎ钟雨血树突状细胞功能变化及黄甍的体镪ｆ预
青 岛大学 医学院
附属 医院儿 内科 ，
山 东 省 青 岛 市
２ ０ ６ ； 郑州市 ０６ ３
儿 童 医院， 河南省
郑 州市 ４ ０５ ５０３
陈永 兴 ★ ， 男 ， １７ ９ ５年 生 ，河 南 省 新 乡市人 ，
市 ２ ０ ６ ０ ６ ３
１ ，１ ２ ８水平 ，流式细胞仪检测树突状细胞表面 ＣＤ８ 、ＣＤ８ （ ７２ ３ ６ Ｂ — ）和 ＣＤ８ （ ７１ ０ Ｂ ． ）的表达率。 结果：过敏性紫癜患 急性期外周血中 Ｔ ｌ型细胞因子 Ｙ一 Ｌ ｈ 干扰素水平减少，Ｔ ２型细胞因子白细胞介素 ４水平增加， ｙ． ｈ 干扰 素／ 白细胞 介素 ４比值明显降低 。 过敏性紫癜 患Ｊ ＃ 周血单个核细胞经诱导培养 的树突状细胞表面 Ｃ ８ Ｌｔ ， Ｄ ６表达率较正常 对 照组明显升高 ，且两组 ＣＤ８ ６表达率与血浆 白细胞介素 ４水平 皆呈显著正相 关，与 Ｙ一 干扰素， 白细胞 介素 ４比值 皆呈显 著负相关 ；ＣＤ８ ０表达率 明显低于正常对 照组 ，且两组 ＣＤ８ ０表达率与血浆 ｙ一 干扰素水平及 Ｙ一 干扰素／ 白细胞介素 ４比值 均呈显著正相关 。过敏性紫癜患儿树突状细胞分泌 白细胞介素 １ ２水平低于 正常对照组 （ ＜ Ｏ０ Ｐ ．５），而 白细胞介素 １ Ｏ， １ ８水平均高于正常对照组 （ Ｐ＜Ｏ０ ），两组树突状 细胞分泌 白细胞介素 １ ．５ ２水平 与血浆 Ｙ． 干扰素水平 皆呈显著正相关（ Ｐ＜ ０ １ ，与 Ｙ・ ． ） ０ 干扰素／ 白细胞介素 ４比值 皆呈正相关（ Ｐ＜Ｏ０ ，Ｐ ．１ ＜０． ） 白细胞介 素 １ ｏ ； ５ ０分泌水平与其血浆 白细胞介素 ４ 水平皆呈显著正相关（ Ｐ均＜００ ） ．１，与 Ｙ一 干扰素／ 白细胞介素 比值皆呈负相关（ Ｐ＜００ ，Ｐ＜０ｏ ） ．１ ．５ ：白细胞介素 １ ８分泌水 平与其血浆白细胞介素 ４ 水平 皆呈显著正相关（ 户均＜ ．１， Ｙ 干扰素／ ００ ）与 ． 白细胞介 素４比值 皆呈负相关（ ＜００ ， ００ ） 户 ． Ｐ＜ ． 。 １ ５ 黄芪干预组树突状细胞表面 ＣＤ ３ ８ 、ＣＤ ６和 ＣＤ ０的表达率与对照组差异不显著 ，树突状细胞分泌 白细胞介素 １ ８ ８ ２水平高 于对照组 （ Ｐ＜００ ） ， 白细 胞 介 素 １ ， １ ．１ ０ ８水 平 均 低 于 对 照 组 （ Ｐ＜００ ， Ｐ＜００ ） 。 ．５ 。１ 结论：①过敏性紫癜患 Ｌ＇ Ｊ周血树突状细胞存在明显功能紊 乱，表现为 ＣＤ８ Ｉ ＂ ６表达率升高、ＣＤ ０降低，白细胞介素 １ ８ ２分 泌减少、 自细胞介素 １ 和 白细胞介素 １ ０ ８增加 ，上述变化与 Ｔ ｌ ｈ ｈ ／ ２失衡关系密切。②黄 芪主要是通过改变过敏性紫癜 Ｔ 患 儿 树 突 状 细胞 分 泌 细 胞 因子 的水 平 来 调 节 其 功 能 。 关键词：过敏性紫癜 ；树突状细胞； 白细胞介素 １ ；白细胞介素 １ ０ ２；白细胞介素 １ ；ＣＤ ６ ８ ８ ；ＣＤ８ ；黄芪 ０ 陈永兴，张秋业 ，王娟，卫海燕 ，董增义，张迎辉 ． 过敏性紫癜患儿外周血树突状 细胞功能变化及黄芪的体外干预 ［ ． Ｊ 中国组 】 织工程研究与临床康复 ，２ ０ ０ ９，１ （） ５ －６ ３１： ７１ ０ １ ［ｔ ：ｗｗｗ．ｒ ｒ ｒ ｈｔ：ｃ ．ｇｃ ｆ ｏ ｈｔ ／ ｐ／ ｃｔ ． ｇ ｔ ／ ｎｚ ｌｋ． ｍ】 ｅｏ ｐ／ ｃ
人外周血树突状细胞体外诱导培养及表型鉴定
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昆 明 医 学 院 学 报
２ １ ，（ １ ： １ ４ ０ ０ １ ） ２ —２
ＣＮ ３—１ ９ Ｒ ５ Ｏｌ ／
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｎ ｉｇ Ｍ ｅ ｉａ ｉｅ ｓ ｙ ｏ ｒ ａ ｆＫｕ ｍ ｎ ｄｃ ｌＵｎｖ ｒｉ ｔ
人外周 血树 突状细胞 体 外诱 导培 养及 表型 鉴定
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流式细胞仪检测外周血树突状细胞分析CD123+（抗IL-3受体α链）和CD11c+树突状细胞亚群概述树突状细胞（DC）的主要功能是吸收抗原，进行加工，并向T淋巴细胞呈递。
其它抗原呈递细胞也有此功能，如B淋巴细胞和单核细胞。
但是，与其它细胞不同的是，DC细胞具有诱导初发免疫反应的独特功能，例如，可以活化处女T细胞（Naive T cell）。
DC细胞存在于外周淋巴组织中，已在血液和非淋巴器官中发现了不同类型的DC细胞，并被认为是淋巴组织中细胞的前体。
由于血液和组织中DC细胞含量少，且缺乏特异的DC标记物，所以DC细胞的研究非常困难。
因此，关于DC细胞的了解主要来自于通过密度梯度离心、培养、和/或阴性选择富集后的DC细胞的研究。
这些过程利用了DC细胞的密度和黏附特征，和在一定细胞因子条件下的选择性生长，或缺乏淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的系列标记物的表达。
但是，这些方法中DC细胞的产率和纯度较低，且费时费力。
而且，这些操作可以影响细胞的功能，并且无法做DC细胞含量的定量分析。
最近的报告发现在活化DC细胞和血液或淋巴细胞分离培养的DC细胞表面CD83和CMRF-44高表达。
CD83和CMRF-44可以作为DC细胞的活化标志物，但在体内或未处理的细胞上没有特征性表达，或表达水平很低。
在对新鲜分离的DC细胞的研究中，发现IL-3Rα在淋巴器官的DC细胞上有特异表达。
从人类外周淋巴组织中分离的单个核细胞中主要是此类DC细胞。
IL-3Rα（CD123）抗体可以用来进行免疫磁珠分选，从外周淋巴组织制备的单个核细胞样本中，将CD123+ DC细胞进行200倍富集。
CD123抗体还可以用来做免疫组化分析，特异识别滤泡外T细胞富集区的CD123+ DC。
在外周血中也有CD123+ DC细胞，与以前所说的CD11c- DC细胞和CD33dimCD14-CD16- DC细胞是同一类细胞。
由于缺乏DC特异性标记物，目前仍然不清楚DC是否是自成一系的一类细胞。
DC细胞既可以由成熟的外周血单核细胞生成，也可以由未分离的CD34+干祖细胞经GM-CSF和TNF-α培养得到。
使用CD123抗体，发现有一群CD34+ DC 样幼稚细胞。
这群细胞与CD34+干祖细胞的区别是可以发育成Langerhan细胞样DC。
因此，根据CD123强染，可以识别出一类人类DC细胞，它是不同组织间DC细胞的连接桥梁。
在外周淋巴组织中还发现另一个DC亚群，与CD123+ DC不同的是，其表型为CD11c+HLA-DR+LINdim/-。
与CD123+ DC相反，这群DC细胞位于生发中心。
在血中也含有CD11c+HLA-DR+LINdim/- DC细胞，与CD33brightCD14dimCD16- DC细胞是同一类细胞。
由此可见，DC系统由多种细胞类型构成，发育途径不一。
但是，目前对这些细胞的功能和可能的特殊性、在生理或病理条件下如何受调控等方面仍缺乏了解。
CD123+ DC和CD11c+ DC细胞具有不同的表型，在淋巴器官中的位置也不同，提示它们可能有不同的功能。
近年来的研究主要集中在使用DC细胞进行抗肿瘤和抗感染治疗方面。
不同报道证实，这有可能抑制肿瘤生长。
使用这些新的DC标记物建立起来的检测系统，可以帮助对新鲜外周血新鲜中的两类不同的DC细胞进行定量检测，同时可以加以分离。
实验方法采用三色或四色流式细胞仪分析，检测速度快，样本用量少，可以用来辅助研究在病理和生理条件下，DC在免疫调控中作用。
检测原理和用具检测原理：本实验目的是从外周血中检测两种类型的DC细胞：CD123+ DC （Anti-IL-3Rα+）和CD11c+ DC。
CD11c和CD123并不是DC特异的标志物。
两类细胞均HLA-DR高表达，单核细胞、淋巴细胞和NK细胞的系列标记物弱表达。
因此使用单一荧光标记的LIN cocktail（LIN1）抗体将DC细胞区分出来。
LIN1抗体包括CD3、CD14、CD16、CD19、CD20和CD56。
另外，本实验还可以区分嗜碱粒细胞。
嗜碱粒细胞的表型是：LIN1-CD123+HLA-DR-。
使用HLA-DR可以区分嗜碱粒细胞和CD123+ DC细胞。
细胞来源：样本使用EDTA、ACD或肝素钠抗凝全血，或分离的外周血单个核细胞（PBMC）。
样本采集后24小时内检测。
试剂：1.检测DC细胞用的BDIS荧光标记的单克隆抗体。
四色分析：LIN1 FITC：货号340546，含有CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56 CD123 PE（Anti-IL-3Rα）：货号340545Anti-HLA-DR PerCP：货号347364CD11c APC：货号340544Mouse IgG1 PE：货号349043Mouse IgG2a APC：货号340473三色分析：LIN1 FITC：货号340546，含有CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56 CD123 PE（Anti-IL-3Rα）：货号340545CD11c PE：货号347637Anti-HLA-DR PerCP：货号347364Mouse IgG1 PE：货号349043Mouse IgG2a PE：货号3490532.FACS Lysing Solution（10X）：FACS溶血素，货号349202，用去离子水1：10稀释3.洗液：PBS缓冲液4.1X PBS配制的1%多聚甲醛设备用具：1.EDTA、ACD或肝素钠真空采血管2.12⨯75mm FALCON试管3.振荡混匀器4.FACS流式细胞仪5.离心机6.微量加样器全血样本荧光抗体染色步骤：1.按照下表在各管中加入适量抗体；FITC PE PerCP APC4-Color 四色分析Tube 1 LIN1 20uL CD123 5u（全血）Anti-HLA-DR 10uL CD11c 5uLTube 2 LIN1 20uL10uL（PBMC）Mouse IgG1 Anti-HLA-DR 10uL Mouse IgG2a3-Color 三色分析Tube 1Tube 2 Tube 3 Tube 4 LIN1 20uLLIN1 20uLLIN1 20uLLIN1 20uLCD123 5uL（全血）10uL（PBMC）Mouse IgG1CD11c 5uLMouse IgG2aAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uL2.每管加入100uL全血，振荡混匀，室温暗处反应15分钟；3.加入2mL FACS溶血剂，振荡混匀，室温暗处放置10分钟；4.300xg离心5分钟，弃上清；5.振荡混匀，加入1mL洗液；6.300xg离心5分钟，弃上清；7.振荡混匀，加入300uL 1%多聚甲醛；8.2-8︒C暗处保存，24小时内上机分析PBMC样本荧光抗体染色步骤：1.按照上表在各管中加入适量抗体；2.每管加入50uL全血，振荡混匀，暗处冰浴反应25分钟；3.轻轻混匀，加入1mL洗液；4.300xg离心5分钟，弃上清；5.轻轻混匀，加入300uL 1%多聚甲醛；6.2-8︒C暗处保存，24小时内上机分析数据获取：1.使用CaliBRITE微球，做FACSComp，调整PMT电压和荧光补偿，检查仪器灵敏度；2.上样：使用CELLQuest软件，获取50,000个细胞，用FSC设阈值，排除碎片干扰；3.使用CELLQuest软件分析结果数据分析：1.区分细胞和碎片：使用FSC/SSC点图，画R1，排除碎片和死细胞；2.找到LIN1弱阳性和阴性群体：使用Anti-HLA-DR/LIN1点图（G1=R1），画R2，圈定LIN1弱阳性和阴性细胞；3.区分外周血DC和嗜碱粒细胞：在四色分析中，管1区分DC细胞和嗜碱粒细胞，管2是同型对照。
在三色分析中，管1和管3区分DC细胞和嗜碱粒细胞，管2和管4是同型对照。
使用同型对照区分非特异染色在Gate List中定义G3=R1 AND R2。
使用Anti-HLA-DR/CD123点图和Anti-HLA-DR/CD11c点图（G3=R1 AND R2），图中只显示LIN1弱阳性和阴性细胞。
画R3，圈定嗜碱粒细胞（Anti-HLA-DR-/CD123+）；画R4，圈定CD123+ DC细胞（Anti-HLA-DR+/CD123+）；画R5，圈定CD11c+细胞（Anti-HLA-DR+/CD11c+）；4.在Gate List中定义各门：G4（嗜碱粒细胞）=R1 AND R2 AND R3，G5（CD123+ DC）=R1 AND R2 AND R4，G6（CD11c+ DC）=R1 AND R2 AND R5，G7=R1 AND R2 AND（R3 OR R4 OR R5）；5.确认细胞群的准确性：下图显示了四色分析全血样本时的CD123+ DC、CD11c+ DC和嗜碱粒细胞各群的位置。
6.分析各群细胞的百分含量：点击Anti-HLA-DR/LIN1（G1=R1）点图，做统计，得到各群细胞所占比例∙CD123+ DC% R1 AND R2 AND R4∙CD11c+ DC% R1 AND R2 AND R5∙嗜碱粒细胞% R1 AND R2 AND R3在三色分析时，由两个点图分别得到统计结果。
CD11c+ DC%由CD11c PE 点图得到，CD123+ DC%和嗜碱粒细胞%由CD123 PE点图得到。
分析结果：在外周血中，DC含量很低，因此，在流式细胞分析中，需要获取50,000个细胞。
下表总结了各细胞亚群的表型特征。