多肽抗原的设计与抗体制备第
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
可以用peptide companion 软件辅助判定多肽合成的难 易程度，但是由于该软件默认了最后四个氨基酸是容易合 成的，可是有时实际情况并不如此，因此依然需要综合考 虑
domains ，GTP binding sites 。 • 有些蛋白在成熟的过程中会切割掉一小段肽段。 • 如果选用MBS交联方法，需要在N端或C端加上C • 对于有些基因来说，可能含有不止一个转录异构体（transcript
variants ），这时就要在这些转录异构体的共有序列中寻找抗原多 肽
用peptide companion 软件判定 易于合成的14-16个氨基酸
可整理ppt
5
可整理ppt
6
可整理ppt
7
可整理ppt
8
可整理ppt
9
免疫原性肽选择的注意事项
• 避开信号肽，磷酸化，糖基化位点 • 避开很多蛋白所共有的相同的或相近的motif,例如zinc finger，SH2
2：利用合成肽制备抗体
AVIVA SYSTEMS BIOLOGY LIFESPAN BIOSCIENCES
3：利用纯化的天然蛋白
可整理ppt
4
免疫原性肽选择的基本程序
利用在线设计软件或DNAStar筛 选抗原性强的多肽序列
尽量使用N端或C端的序列
该序列经Blast后在人的其他蛋白中 同源性要低，最好在小鼠或大鼠中高 度保守
切割完以后，用乙醚沉淀什么都没有
可整理ppt
24
• 多肽两端的氨基酸对多肽溶解性的影响要远大于其中间序 列，因此要避免其两端有连续的两个疏水性氨基酸。
Ago2 SR0009 IVEHMVQHFKTQIF 极难溶
DGCR8 SR0004 LHILSKLQEEMKRL TNFRSF19 SR0303 WSLRSQDIQYNGSELS 不溶于甲醇
多肽抗原的设计与抗体制备
第二版
可整理ppt
1
• 多肽抗原的设计 • 多肽的固相合成和纯化 • 多肽的交联和免疫 • 抗多肽抗体的检测和功能学鉴定 • 抗体的纯化 • 怎样利用Internet 的免费资源寻找与抗体相关的
信息
可整理ppt
2
抗合成肽类抗体制备程序
免疫原性肽的选择
肽的合成、纯化与鉴定 载体蛋白的选择 连接剂的选择
• 合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得 到目标产物。
可整理ppt
17
可整理ppt
18
合成原料
• Fmoc-AA(prot)-Wang resin 提供肽链延伸反应的固相颗粒状介质 例如：Fmoc-His(Trt)-Wang resin
Prot：Boc,tBu,Trt,OtBu 侧链活性位点的保护基团
载体蛋白/肽连接物
ELISA筛选抗体血清反应性
免疫动物
McAb的制备
收集阳性血清
Western blot, Immunofluorescence assay 鉴定抗体的生物学功能
可整理ppt
阳性抗体的纯化
3
抗体制备常用的免疫原
1：表达纯化一段或全长的重组的带GST,Histag的融合蛋白
Abnova corporation
可整理ppt
20
标准合成程序
• Step solvent/operation volume mix time drain Rep
1
DMF
1 00:00:30 on
3
2 20%pipdine/DMF
1 00:07:00 on
2
3
DMF
1 00:00:30 on
6
4
Reagent(AA)
1 00:00:00 off
可整理ppt
10
利用Swiss-Prot数据库辅助设计
..\UniProtKB-Swiss-Prot entry P26992 [CNTFR_HUMAN] Ciliary neurotrophic factor receptor alpha.htm
可整理ppt
11
可整理ppt
12
可整理ppt
13
可整理ppt
14
可整理ppt
15
可整理ppt
16
多肽的固相合成
• 此法的基本过程是：基于Fmoc化学合成，将目标多肽的 C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连， 然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子保护性氨 基酸的羧基（已经活化）作用（用NMM,HBTU作偶联剂）形 成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。
• 避免多肽序列中连续3到4个疏水性的氨基酸。（Val-V，Leu-L，IleI，Met-M，Phe-F）
• 避免Asp-Pro序列
• 避免多肽序列中最后一个氨基酸是Pro。
PIWIL3
SR0015 FFLKHGSNFQNPPP
Caspase 2 SR0024 TDTVEHSLDNKDGP
Caspase 7 SR0032 DRVARHFESQSDDP
Fmoc: α-NH2保护基团：
ห้องสมุดไป่ตู้Boc:
Trt:
可整理ppt
19
• Fmoc-AA(Prot)-OH • Solvent 1: DMF • Solvent 2: 20%pipdine/DMF • Solvent 3: 0.4M NMM/ HBTU/DMF • Solvent 4: 50% ACN/DMF • Solvent 5: methylene chloride • Solvent 6: 94% TFA/2.5%EDT/1%Anisol/2.5%H2O
1 00:07:00 on
2
3
DMF
1 00:00:30 on
6
4 methylene chloride 1 00:00:30 on 6
5
Dry
1 00:10:00 on 1
6
TFA
2 02:00:00 on 1
7
TFA
1 00:00:30 on 1
8 methylene chloride 1 00:00:30 on 3
9
Dry
1 00:02:00 on 1
可整理ppt
22
可整理ppt
23
多肽合成的一般常识
• 固相多肽合成一般最多只能合成到20aa。为了保证合成的效率和纯度， 我们在设计多肽抗原时，一般设计14-16aa的多肽。
• 减少多肽序列中多个困难性氨基酸Cys, Met, Arg, or Trp的含量。
1
5 0.4M NMM/HBTU/DMF 1 00:40:00 on
1
6
DMF
1 00:00:30 on
3
可整理ppt
21
标准切割程序
• Step solvent/operation volume mix time drain Rep
1
DMF
1 00:00:30 on
3
2 20%pipdine/DMF
domains ，GTP binding sites 。 • 有些蛋白在成熟的过程中会切割掉一小段肽段。 • 如果选用MBS交联方法，需要在N端或C端加上C • 对于有些基因来说，可能含有不止一个转录异构体（transcript
variants ），这时就要在这些转录异构体的共有序列中寻找抗原多 肽
用peptide companion 软件判定 易于合成的14-16个氨基酸
可整理ppt
5
可整理ppt
6
可整理ppt
7
可整理ppt
8
可整理ppt
9
免疫原性肽选择的注意事项
• 避开信号肽，磷酸化，糖基化位点 • 避开很多蛋白所共有的相同的或相近的motif,例如zinc finger，SH2
2：利用合成肽制备抗体
AVIVA SYSTEMS BIOLOGY LIFESPAN BIOSCIENCES
3：利用纯化的天然蛋白
可整理ppt
4
免疫原性肽选择的基本程序
利用在线设计软件或DNAStar筛 选抗原性强的多肽序列
尽量使用N端或C端的序列
该序列经Blast后在人的其他蛋白中 同源性要低，最好在小鼠或大鼠中高 度保守
切割完以后，用乙醚沉淀什么都没有
可整理ppt
24
• 多肽两端的氨基酸对多肽溶解性的影响要远大于其中间序 列，因此要避免其两端有连续的两个疏水性氨基酸。
Ago2 SR0009 IVEHMVQHFKTQIF 极难溶
DGCR8 SR0004 LHILSKLQEEMKRL TNFRSF19 SR0303 WSLRSQDIQYNGSELS 不溶于甲醇
多肽抗原的设计与抗体制备
第二版
可整理ppt
1
• 多肽抗原的设计 • 多肽的固相合成和纯化 • 多肽的交联和免疫 • 抗多肽抗体的检测和功能学鉴定 • 抗体的纯化 • 怎样利用Internet 的免费资源寻找与抗体相关的
信息
可整理ppt
2
抗合成肽类抗体制备程序
免疫原性肽的选择
肽的合成、纯化与鉴定 载体蛋白的选择 连接剂的选择
• 合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得 到目标产物。
可整理ppt
17
可整理ppt
18
合成原料
• Fmoc-AA(prot)-Wang resin 提供肽链延伸反应的固相颗粒状介质 例如：Fmoc-His(Trt)-Wang resin
Prot：Boc,tBu,Trt,OtBu 侧链活性位点的保护基团
载体蛋白/肽连接物
ELISA筛选抗体血清反应性
免疫动物
McAb的制备
收集阳性血清
Western blot, Immunofluorescence assay 鉴定抗体的生物学功能
可整理ppt
阳性抗体的纯化
3
抗体制备常用的免疫原
1：表达纯化一段或全长的重组的带GST,Histag的融合蛋白
Abnova corporation
可整理ppt
20
标准合成程序
• Step solvent/operation volume mix time drain Rep
1
DMF
1 00:00:30 on
3
2 20%pipdine/DMF
1 00:07:00 on
2
3
DMF
1 00:00:30 on
6
4
Reagent(AA)
1 00:00:00 off
可整理ppt
10
利用Swiss-Prot数据库辅助设计
..\UniProtKB-Swiss-Prot entry P26992 [CNTFR_HUMAN] Ciliary neurotrophic factor receptor alpha.htm
可整理ppt
11
可整理ppt
12
可整理ppt
13
可整理ppt
14
可整理ppt
15
可整理ppt
16
多肽的固相合成
• 此法的基本过程是：基于Fmoc化学合成，将目标多肽的 C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连， 然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子保护性氨 基酸的羧基（已经活化）作用（用NMM,HBTU作偶联剂）形 成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。
• 避免多肽序列中连续3到4个疏水性的氨基酸。（Val-V，Leu-L，IleI，Met-M，Phe-F）
• 避免Asp-Pro序列
• 避免多肽序列中最后一个氨基酸是Pro。
PIWIL3
SR0015 FFLKHGSNFQNPPP
Caspase 2 SR0024 TDTVEHSLDNKDGP
Caspase 7 SR0032 DRVARHFESQSDDP
Fmoc: α-NH2保护基团：
ห้องสมุดไป่ตู้Boc:
Trt:
可整理ppt
19
• Fmoc-AA(Prot)-OH • Solvent 1: DMF • Solvent 2: 20%pipdine/DMF • Solvent 3: 0.4M NMM/ HBTU/DMF • Solvent 4: 50% ACN/DMF • Solvent 5: methylene chloride • Solvent 6: 94% TFA/2.5%EDT/1%Anisol/2.5%H2O
1 00:07:00 on
2
3
DMF
1 00:00:30 on
6
4 methylene chloride 1 00:00:30 on 6
5
Dry
1 00:10:00 on 1
6
TFA
2 02:00:00 on 1
7
TFA
1 00:00:30 on 1
8 methylene chloride 1 00:00:30 on 3
9
Dry
1 00:02:00 on 1
可整理ppt
22
可整理ppt
23
多肽合成的一般常识
• 固相多肽合成一般最多只能合成到20aa。为了保证合成的效率和纯度， 我们在设计多肽抗原时，一般设计14-16aa的多肽。
• 减少多肽序列中多个困难性氨基酸Cys, Met, Arg, or Trp的含量。
1
5 0.4M NMM/HBTU/DMF 1 00:40:00 on
1
6
DMF
1 00:00:30 on
3
可整理ppt
21
标准切割程序
• Step solvent/operation volume mix time drain Rep
1
DMF
1 00:00:30 on
3
2 20%pipdine/DMF