氧化葡萄糖酸杆菌老黄酶Go的酶学性质鉴定

氧化葡萄糖酸杆菌老黄酶 Ｇｏ 的酶学性质鉴定
（ 南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００）
摘㊀ 要：从氧化葡萄糖酸杆菌（ Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） Ｈ２４ 中克隆出老黄酶 Ｇｏ 的基因， 通过构建重组表达质粒， 在 大肠杆菌 ＢＬ２１ 中诱导表达可溶性的蛋白，使用离子交换柱（ ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦ） 对重组酶进行纯化，并对其酶学性质 老黄酶 Ｇｏ 有良好的有机溶剂耐受性，在体积分数 ２０％ 的乙酸丁酯中可以保持 ９０％ 左右的活性，但是金属离子对其 Ｇｏ 对柠檬醛的转化率有 ６０％，并且其对映体过量值（ ｅ������ ｅ． ） 可以达到 ９９％㊂ 关键词：老黄酶；不对称还原碳碳双键；氧化葡萄糖酸杆菌 Ｈ２４；酶学性质 进行表征㊂ 结果表明：老黄酶 Ｇｏ 的温度和 ｐＨ 耐受性都较好，在 ４０ ħ 条件下，１２ ｈ 后能保持 ４０％ 的活性；在 ｐＨ１０ 的条件下，１２ ｈ 后能保持 ４０％ 的活性；Ｇｏ 的底物谱十分广泛，对酰亚胺类㊁α，β 不饱和醛酮㊁萜类都有一定的活性㊂ 影响较大，除 Ｍｇ２＋ 和 Ｋ ＋ 外，所选的其他离子对 Ｇｏ 都有着不同程度的抑制作用㊂ 最后， 在催化性质的实验中发现， 中图分类号：Ｑ５５４㊀ ㊀ ㊀ ㊀ 文献标识码：Ａ㊀ ㊀ ㊀ ㊀ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１７）０１－００２０－０８
［１９－２０］
１９３３ 年，老黄酶首次从啤酒酵母中分离出来， ㊂ 老黄酶在自然界的分布十 分 广
［４，９－１１］
１������ ２㊀ 仪器和试剂
酶和 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶，宝生物工程（ 大连） 有限公司； 细菌基因组试剂盒㊁ 质粒小提试剂盒㊁ 胶回收试剂 南京金斯瑞生物科技有限公司㊂ 所用底物 （ 马来酰 亚胺㊁马来酸二甲酯㊁ 香芹酮㊁ 茶香酮㊁ 衣康酸㊁ 中康 酸㊁柠康酐㊁２ 环戊烯酮㊁２ 环己烯酮㊁３ 甲基 ２ 环戊烯酮㊁３ 甲基 ２ 环己烯酮㊁ 乙酰环己烯㊁ 薄荷 酮㊁α 甲基肉桂醛㊁２ 甲基 ２ 戊烯醛㊁反式 ２ 己 Ａｌａｄｄｉｎ 公司； 抗生素㊁ 考马 斯 亮 蓝㊁ 牛 血 清 白 蛋 白 （ ＢＳＡ） 及其余试剂，生工生物工程 （ 上海 ） 股份有限 Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４Ｒ 型 高 速 冷 冻 离 心 机， Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ １������ ３㊀ 老黄酶 Ｇｏ 基因在大肠杆菌中的克隆和表达 号 为 ＣＰ００３９２６������ １ ） 设 计 引 物㊂ 上 游 引 物： ５ᶄ ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＧＡＡＧＴＴＴＣＧＡＴＣＡＡＧＧ 游引 物：５ᶄ ＧＧＡＧＴＡＣ 公司㊂ 烯醛㊁１ 苯基 ２ 硝基丙烯㊁ 硝基苯㊁ 柠檬醛等 ） ， 公 司； ＰｏｗｅｒＷａｖｅ ＸＳ 酶 标 仪， ＢＩＯ⁃ＴＥＫ 公 司； 盒，天根生化科技（ 北京） 有限公司；ＰＣＲ 引物合成，
催化 Ｃ ������ ������Ｃ 双键的还原， 在医药和农药中间体的研 究上有很大的应 用 潜 力㊂ 例 如， 来 源 于 Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉ
［２６］
作为一种黄素依赖的氧化还原酶， 老黄酶可以 和 Ｚｙｍｏｍｏａｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ
［２６－２７］
㊂
用来生产（ Ｒ ） 或 （ Ｓ ） 型的香茅醛， 香茅醛是生产 Ｌ
上有着十分广阔的应用前景㊂ 然而， 目前已经被发 现的老黄酶数量有限， 而且现在国内外的研究也主 要集中在对已知老黄酶的改造研究上而非新酶的 发掘上㊂ 因此，挖掘出新的可用的老黄酶酶源是一 件亟待解决的事情㊂ 上进行 序 列 比 对 搜 索， 发 现 一 种 新 来 源 的 老 黄 酶 Ｇｏ， 并将其构建至大肠杆菌中进行异源表达， 进一 步对重组酶进行纯化和酶学性质的研究， 以期为老 黄酶的研究提供新的酶源，为其工业应用奠定基础㊂ 存在于氧化葡萄糖酸杆菌 Ｈ２４ 中的老黄酶 笔者以已知老黄酶 ＯＹＥ１ 为模板， 在 ＧｅｎＢａｎｋ
的老黄酶可以
薄荷醇的重要手性中间体； 最早的热稳定性老黄酶 ＹｑｊＭ 被发现可以用于催化茶香酮生产 （ Ｒ ） 型的左 旋二酮，（ Ｒ ） 左旋二酮是类胡萝卜素合成中一种关 键的手性中间体㊂ 老黄酶 ＭＲ 在吗啡和可卡因生产 麻醉剂的合成中起到了重要的作用
［２８］
根据 Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ Ｈ２４（ ＧｅｎＢａｎｋ 登录 ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＧＴＴＴＣＧＡＴＣＡＡ⁃ ３ᶄ， 下
各种限制性内切酶㊁Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ 聚合
目前为 止， 已 报 道 的 老 黄 酶 微 生 物 来 源 主 要 有
［９－１０］
中都有发现㊂ 到
［１２］
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ［１３－１５］ ㊁ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ［１６－１８］ ㊁ 和 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ 酮
３ᶄ， （ 上游㊁下游引物分别引入 ＮｃｏⅠ及
１㊀ 材料与方法
１������ １㊀ 菌株与质粒
购自中国普通微生物菌种保藏管理中心 （ ＣＧＭＣＣ） ㊂ 载体质粒 ｐＥＴ ２２ｂ（ ＋） 购自 Ｎｏｖａｇｅｎ 公司㊂ 克隆宿 主 Ｅ������ ｃｏｌｉ ＤＨ５α 以及表达宿主 Ｅ������ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ ＤＥ３） 为 笔者所在实验室保藏㊂
） ，女，湖北红安人，研究方向：基因工程与生物信息学；严㊀ 明（ 联系人） ，副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙａｎｍｉｎｇ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
㊀ 第１期
陈晶晶等：氧化葡萄糖酸杆菌老黄酶 Ｇｏ 的酶学性质鉴定
２１
且已经逐渐形成高效完善的合成途径 ［２－３］ ㊂ （ ＦＭＮ） 的酶
［４－８］
并且是最早被发现的含有黄素辅酶黄素单核苷酸 泛，在植物㊁细菌和低等真菌 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ
２０１７ 年 １ 月
第 １５ 卷第 １ 期
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
生㊀ 物㊀ 加㊀ 工㊀ 过㊀ 程
Ｖｏｌ������ １５ Ｎｏ������ １ Ｊａｎ． ２０１７
ｄｏｉ：１０������ ３９６９ ／ ｊ������ ｉｓｓｎ������ １６７２－３６７８������ ２０１７������ ０１������ ００４
ＣＨＥＮ Ｊｉｎｇｊｉｎｇ，ＳＨＥＮＧ Ｘｉｑｉａｎ，ＱＩＡＮ Ｓｈｕｗｅｎ，ＹＡＮ Ｍｉｎｇ，ＸＵ Ｌｉｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｇｏ，ａ ｎｏｖｅｌ ｏｌｄ ｙｅｌｌｏｗ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒｏｍ Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ Ｈ２４， ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ＢＬ２１（ＤＥ３）． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ （ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ４０％ ａｃｔｉｖｉｙ， ｐＨ １０ ｆｏｒ １２ ｈ），ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｉｔ ｈａｓ ａ ｇｒｅａｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ． Ａｌｓｏ，ｉｔ ｓｈｏｗｓ ｈｉｇｈ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏｗａｒｄ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ ａｎｄ ｍａｉｎｔａｉｎ ９０％ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ２０％ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ． ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ ｅｘｃｅｓｓ ｖａｌｕｅ （ ｅ������ ｅ． ＞９９％）． ｗｉｔｈ ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦ ｃｏｌｕｍｎ． Ｇｏ ｃａｎ ｒｅｄｕｃｅ ｖａｒｉｏｕｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｌｋｅｎｅｓ ｉｍｉｄｅｓ，α，β⁃ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｋｅｔｏｎｅｓ， ａｎｄ ｔｅｒｐｅｎｅ ａｎｄ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ （ ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ４０％ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ４０ ħ ｆｏｒ １２ ｈ） ａｎｄ ｐＨ Ｈｏｗｅｖｅｒ，Ｇｏ ｈａｓ ｌｏｗ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏｗａｒｄｓ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ． Ｔｅｓｔｅｄ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ａｌｌ ｅｘｉｓｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｓ ｔｏｗａｒｄ Ｇｏ
陈晶晶，盛茜茜，钱姝文，严㊀ 明，许㊀ 琳
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｌｄ ｙｅｌｌｏｗ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒｏｍ Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ Ｈ２４
（ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
老黄酶催化还原 Ｃ ������ ������Ｃ 双键的作用使其在工业
㊂
ＢａｍＨⅠ酶切位点，划线处为酶切位点 ） ㊂ 将扩增的 ＤＮＡ 片段与 ｐＥＴ ２２ｂ（ ＋ ） 载体同时进行相同的限 制性内切酶酶切， 用 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶连接并转化至 Ｅ������ ｃｏｌｉ ＤＨ５α 克隆载体， 挑取阳性克隆送至南京金 斯瑞生物科技有限公司进行测序㊂ 将正确测序的 Ｇｏ 基因转入表达载体 ＢＬ２１ （ ＤＥ３） 进行表达㊂ 挑取 重组菌单菌落，接种到含有 １００ ｍｇ ／ ｍＬ 氨苄青霉素 抗性的 ５ ｍＬ 液体培养基中， 在 ３７ ħ ㊁２００ ｒ ／ ｍｉｎ 的 恒温摇床中培养 １２ ｈ㊂ 将培养 １２ ｈ 的菌液以体积 分数 ２％ 的接种量接入含有 １００ ｍｇ ／ ｍＬ 氨苄青霉素 抗性的 １００ ｍＬ 自诱导液体培养基中， 在 ３０ ħ ㊁２００ ｒ ／ ｍｉｎ 的摇床中诱导培养 １５ ｈ㊂ 诱导结束后， 用高 速冷冻离心机收集菌体㊂ 用磷酸缓冲 （ ｐＨ ８������ ０） 清 洗菌体 １ 次，最后用 ５ ｍＬ 磷酸悬浮菌体㊂ 在冰上用 １０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下离心 １５ ｍｉｎ㊂ 将收集得到的上 １������ ４㊀ 老黄酶 Ｇｏ 的分离纯化 清液过膜后置于 ４ ħ 冰箱待用㊂ 超声细胞粉碎机破碎细胞， 破碎后的细胞在 ４ ħ ㊁
［１］
性中心的化合物，并且这些化合物通常都是有机合 成中的重要手性砌块， 已经成为使用最广泛的生产 手性化合物的合成方法之一㊂ 近年来， 生物催化的 方法被越来越多地应用到 Ｃ ������ ������Ｃ 双键的还原中， 并
收稿日期：２０１６－０４－２２
Leabharlann Baidu
基金项目：国家重点基础研究计划（９７３ 计划） （２０１１ＣＢＡ００８０４） 作者简介：陈晶晶（１９９０
氧化葡萄糖酸杆菌 （ Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ） Ｈ２４
８������ ０ 的 磷 酸 缓 冲 平 衡 柱 子， 用 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ 和 ２０
柱（Ｈｉ Ｔｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦ） 进行纯化㊂ 用 ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ㊁ｐＨ
将粗酶液使用 ＡＫＴＡ 蛋白纯化仪和阴离子交换
ｅｘｃｅｐｔ Ｍｇ２＋ ａｎｄ Ｋ ＋ ． Ｂｅｓｉｄｅｓ，Ｇｏ ｃａｎ ｃａｔａｌｙｚｅ ｃｉｔｒａｌ ｔｏ （ Ｓ ）⁃ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌ ｗｉｔｈ ６０％ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｕｔ ｈｉｇｈ Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ｏｌｄ ｙｅｌｌｏｗ ｅｎｚｙｍｅ； ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ Ｃ ������ Ｃ ｂｏｎｄ； Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ Ｈ２４； ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ㊀ ㊀ 在精细化学品㊁ 药物㊁ 农药中间体的研究领域， 生物催化法因为其高效率㊁ 高立体选择性和低成本 ㊂ 而 Ｃ ������ ������Ｃ 双 键的不对称还原因为其可以产生含有多至两个手 已经日益成为一种常用的合成途径
［４，９，２３］ ［２２］
㊁ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
㊁
㊁ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
［２３－２５］
［２１］
的活性烯烃， 底物谱十分广泛， 包括 α， β 不饱和醛 酯㊁内酯㊁酰亚胺等） ㊁羧酸
［２２］
， 老黄酶可以催化一系列 及各种衍生物 （ 包括
㊁硝基烯
［２４－２５］