氧化葡萄糖酸杆菌老黄酶Go的酶学性质鉴定
葡萄糖氧化酶特性、作用机理及其功能
葡萄糖氧化酶特性、作用机理及其功能葡萄糖氧化酶(GOD)是一种需氧脱氢酶，能专一地氧化β-D-葡萄糖成为葡萄糖酸和过氧化氢，在有过氧化氢酶存在的情况下，生成葡萄糖酸和水，并在此过程中消耗氧气。
经旋光测定，GOD反应的最初产物不是葡萄糖酸，而是中间产物δ-葡萄糖酸内酯，而后δ-葡萄糖酸内酯以非酶促反应自发水解为葡萄糖酸。
早在1904年人们就发现了GOD，但没有引起足够的重视。
1928年Muller首先从黑曲霉的无细胞提取液中发现GOD。
我国自1986年开始研究GOD的制备提纯工艺，1998年正式投入生产，1999年农业部将其定为12种允许使用的饲料酶制剂添加剂之一。
1 葡萄糖氧化酶(GOD)的特性高纯度葡萄糖氧化酶为淡黄色粉末，易溶于水，分子量为150KD 左右，最大光吸收波长为377nm和455nm。
葡萄糖氧化酶的作用温度为30℃～60℃，固体酶制剂在0℃下保存至少可稳定2年，在-15℃下可稳定8年。
葡萄糖氧化酶稳定的pH范围为4.0～8.0，具有很好的稳定性。
一般来说，酶反应受底物浓度的影响不大。
葡萄糖浓度在5%～20%，反应速度几乎不变。
2 葡萄糖氧化酶的作用机理葡萄糖氧化酶作为一种新型的绿色添加剂有其独特的作用方式。
与普通酶制剂不同，它并不是通过改善营养素的消化利用和减轻抗营养因子的方式来改善对动物生产性能的影响。
其方式可能是一方面通过与饲料中葡萄糖作用而产生的葡萄糖酸来发挥作用，另一方面，葡萄糖氧化酶在与葡萄糖作用过程中消耗氧气，使消化道更易形成厌氧环境，促进厌氧有益菌的增殖。
综合起来葡萄糖氧化酶通过在肠道中的作用可能起到酸化剂和益生菌的作用。
葡萄糖酸是一种有机酸，它能够降低肠道pH值，提高饲料的酸结合力，增殖有益菌，抑制有害菌，并且低的pH值可以促进肠道蠕动，提高营养物质的利用率。
G.Biage等（2006）通过体外和体内试验报道了葡萄糖酸在仔猪上的应用，体外试验显示，经过4h、8h、24h的发酵试验，盲肠液中的氨显著减少；发酵24h后，总脂肪酸、乙酸、丙酸、n-丁酸、乙酸丙酸比、乙酸+丁酸与丙酸比都极显著的增加。
9葡萄糖氧化酶解析
• 脱氧方法具体应用如下：
（1）干鲜食品脱氧
瓶装或罐装的干鲜食品贮藏时，因容器密 封性差，所以有必要除去氧。可以在容器中放 入含葡萄糖氧化酶及其作用底物葡萄糖的吸氧 保鲜袋，这样容器中的氧气透过薄膜进入袋中 就在葡萄糖氧化酶作用下与葡萄糖反应，从而 达到脱氧的目的。
（2）酒类脱氧 啤酒中含氧过高易引起啤酒的氧化，产生老
葡萄糖氧化酶—过氧化氢酶处理对蛋黄酱稳定性的影响
保藏期（月）
感官评定 对照 酶处理
颜色 对照 酶处理
氧化值（mmol/kg样品）
对照
酶处理
0
+
+
+
+
0.2
0.2
2
+
+
+
+
3
-
+
+
+
6.2
0.2
4
-
• 采用葡萄糖氧化酶脱糖后的蛋制品基本上不会发生褐变。 另外，脱糖处理后蛋清可保持原有色泽，且蛋腥味消失， 起泡性和起泡稳定性均有明显提高，凝胶强度也有所增 加。优良的起泡性和高凝胶性是蛋清的重要功能性质， 在食品工业上有广泛应用，因此葡萄糖氧化酶脱糖法还 有助于提高产品的实用价值。因此相对于其他脱糖方法 而言，这也是葡萄糖氧化酶法脱糖的优点之一。
– 另外，当葡萄糖氧化酶应用于葡萄酒脱氧时， 添加适量的葡萄糖可在一定程度上加快氧气 消除的速度。
– 白葡萄酒中加入葡萄糖氧化酶能够防止葡萄 酒发生酶褐变和口感、味觉的变化，还可以 防止色素的沉淀，延长保存期。
（3）饮料脱氧保鲜 果汁在深加工过程中若发生氧化作用，其
中的一些不饱和成分如不饱合脂肪酸和烯二醇 类物质将会分解，使果汁品质低下。尤其是Vc 等维生素类的物质的氧化会使营养大量流失。 添加葡萄糖1g/L，葡萄糖氧化酶20mg/L即可有 效防止氧化的发生。
葡萄糖氧化酶
(然2)后挑以取２步～骤３(1％)获2接.得1种的-量4橘消接青种霉除于孢二子肠级悬培道液养接病基种中于菌，斜3生面0～培存3养2基℃环，振境置荡于培，恒养温2减4箱ｈ少中；放沙大培门养氏，培菌养条等件为感：染28～32℃，2～5天；
葡萄糖氧化酶催化生成的葡萄糖酸，降低了胃肠内pH值，为乳酸菌生长制造了酸性环境。
葡萄糖氧化酶广泛应用于食品、饲料、医药等行业中， 起到了去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用。早在1904年人们 就发现了葡萄糖氧化酶，但由于当时对其商业价值认识不 足没有引起人们的足够注视。
直到1928年，Muller首先从黑曲霉的无细胞提取液中发现葡萄糖 氧化酶，并研究了其催化机理才正式将其命名为葡萄糖氧化酶，将其 归入脱氢酶类。此后Nakamatsu、Fiedurek、Rogalski等先后对此做了 大量研究工作并投入生产。中国从20世纪70年代开始成立了葡萄糖氧 化酶研究协作组，对其展开了系统研究工作。目前国外的葡萄糖氧化 酶生产厂家主要是德国的Boehringer和 的Toyobo。近年来国内外多 位学者对葡萄糖氧化酶的作用机理、酶学性质、酶固定化、基因克隆 表达等方面做了大量工作取得了明显进展。
因为啤酒中氧气的存在一方面会导致啤酒的色泽加深以及氧化变质，还会为微生物的成长提供便利条件，降低保存期。
并可解除霉菌及葡其毒萄素造糖成氧的肝化肿大酶、可胸腺以萎缩改、善巨噬肠细胞道受酸到的性毒害消和化免疫环抑制境。，催化葡萄糖生成
5m 将5
0L0、0C只的A1T日葡1龄. 萄爱拔糖益加酸(A，A)肉在鸡,肠随机道分为内2个发组挥,分别酸为对化照剂组和作试验用组，,每个创组造设4酸个重性复,环每个境重复，62降5只低鸡。胃
葡Cd萄T糖e Q氧中D化s能酶p有广H效泛值地应加用，速于激葡食萄品活糖、氧饲胃化料蛋酶、(医G白O药D等酶)与行，电业极中促表，面起进的到矿直了接去物电除子葡质转萄和移糖,、电维脱子氧生传、递素杀效菌率A等比、作无用QDD。的s C吸d Te收存在，时提并高约8倍;电子转移速 率常数(K且)为酸0. 性肠道环境可减少有害菌，减少腹泻；当葡萄糖氧化酶催化
氧化葡萄糖酸杆菌-杨雪鹏_博士论文
摘要
本研究室筛选到一株氧化葡萄糖酸杆菌 M5（Gluconobacter oxydans M5），该菌株能 高效氧化羟乙基胺 D-山梨醇生成羟乙基胺 L-山梨糖，产物是糖尿病手性药物米格列醇 的前提化合物，该生物催化组合化学合成技术成功开发出米格列醇合成新工艺。其中氧 化葡萄糖酸杆菌的生物转化是关键，然而迄今为止，该菌种相关酶的研究鲜有报道。本 课题详细研究了相关酶在细胞中的定位、组成、催化性质、基因及其催化关系，并分析 了该反应相关电子传递链的组成，从而揭示了氧化葡萄糖酸杆菌高效氧化多羟基醇及其 衍生物的机理。下面从四个方面简要介绍研究的主要内容。 第一，氧化葡萄糖酸杆菌 M5 羟乙基胺山梨醇脱氢酶在细胞中的定位、纯化、鉴定及其 催化性质的研究
The membrane fraction was confirmed to be mainly responsible for the oxidative reaction. The responsible dehydrogenase was solubilized, isolated from the membrane fraction, and purified to homogeneity by two steps of ionic-exchange chromatography on CM-Cellulose column and molecular sieve chromatography on Sephacryl HR400 column chromatography. The purified dehydrogenase was single subunit protein with apparent molecular weight of about 80 kDa by SDS-PAGE. This enzyme was confirmed to be a PQQ-dependent membrane-bound D-sorbitol dehydrogenase (mSLDH) by MALDI–TOF MS. The optimum pH and temperature for the enzyme were pH 6.0 and 30 °C. It showed a good stability at pH 5.0 and temperatures below 30 °C. PQQ was proved to be its cofactor by restoration of apo-enzyme with PQQ and Ca2+. The activity of the 1NSL dehydrogenase was significantly stimulated by Ca2+ Co2+, Ni2+, Mn2+ and Mg2+, while Cu2+, Fe3+, Zn2+ and EDTA inhibited the activity to different degrees. The substrate specificity was highly versatile, covering many polyols, amino derivatives of carbohydrates, and simple secondary alcohols. Second: The membrane-bound PQQ-dependent D-sorbitol dehydrogenase in Gluconobacter oxydans M5 acting as the primary source enzyme responsible for 1NSL oxidation and its electron transfer pathway
第十二章葡萄糖氧化酶ppt课件
H HO
HO
OH
HHO
H
OH H
OH
EFAD
H HO
HO
OH
HHO
H
OH
O+
δ -D-葡 萄 糖 酸 内 酯
E FADH2 O2
H HO
HO
H 2O
OH
OH
HH
H
COOH
H
OH OH
E FAD
+
H 2O 2
D-葡 萄 糖 酸
表7-14 葡萄糖氧化酶的底物特异性
水果罐头中，防止食品的氧化和容器的 氧化。（桃罐头变色！！）
（1）在啤酒生产中的应用
葡萄糖氧化酶的主要作用是： 除去啤酒中的溶解氧和瓶颈氧； 阻止啤酒的氧化变质过程。 因此，在防止老化味产生，延长啤酒保质期方面
有独特的功效。 经许多啤酒厂试用，啤酒中加入葡萄糖氧化酶后
可将含氧量降到10μg/L以下，啤酒稳定性高、 口味纯正、不产生沉淀、混浊等现象。
H
COOH
H
OH OH
D-葡 萄 糖 酸
四、性质
高纯度葡萄糖氧化酶为淡黄色粉末。 易溶于水，完全不溶于乙醚、氯仿、丁
醇、吡啶、甘油、乙二醇等有机溶剂。 50％丙酮、66％的甲醇能使其沉淀。
1. 葡萄糖氧化酶的催化特异性
它对β-D-吡喃葡萄糖表现出高度的专一性。 羟基处在β-位时酶的活力比处在α-位时高约160倍。
葡萄皮、葡萄埂和葡萄籽中含有 较高的多酚氧化酶和酚类物质， 会使白葡萄酒发生严重的褐变， 尤其是使用原料成熟度差或者霉 变的葡萄为原料酿制葡萄酒，问 题更严重。
如果在生产白葡萄酒时加入葡萄糖氧化 酶——过氧化氢酶，就能防止白葡萄酒 的褐变和口感、味觉的变化，还可以防止 色素的沉淀，延长保存期。。
《氧化葡萄糖酸杆菌》课件
氧化葡萄糖酸杆菌的生物学特性
菌群形态
氧化葡萄糖酸杆菌形成多样的 菌落形态，如小球形、条形和 分枝形等。
生长速度
这些细菌通常具有快速的生长 速度，且对多种培养基适应性 强。
新陈代谢
氧化葡萄糖酸杆菌通过氧化代 谢将葡萄糖转化为能量，并产 生有机酸作为副产物。
氧化葡萄糖酸杆菌的应用领域
1
食品工业
这些细菌在食品工业中被广泛应用，如酸奶和醋的发酵过程中，以及其他发酵食 品的制备中。
2
环境工程
氧化葡萄糖酸杆菌在废水处理和污染物降解中发挥着重要作用，有助于提高环境 质量。
3
药物研发
这些微生物的代谢产物对于药物研发具有潜在的应用价值，可用于合成抗生素和 其他药物。
氧化葡萄糖酸杆菌的研究进展
最近的研究表明，氧化葡萄糖酸杆菌在抗氧化应激和免疫调节方面具有重要作用。科学家们正在进一步 探索其机制和潜力。
《氧化葡萄糖酸杆菌》 PPT课件
探索《氧化葡萄糖酸杆菌》的精彩世界。在这个PPT课件中，我们将一起了 解这种微生物的细节，以及其在生物学和应用领域的意义。
绪论
欢迎来到《氧化葡萄糖酸杆菌》的探索之旅！在这个PPT课件中，我们将深入了解这种微生物，以及它 在生物学研究中的重要性。
氧化葡萄糖酸杆菌简介
展望与总结
通过深入了解氧化葡萄糖酸杆菌，我们能够更好地理解其在生物学和应用领域中的重要性，并为未来的 研究和应用提供新的启示。
定义
氧化葡萄糖酸杆菌（Oxidative Glucose Acid Bacteria）是一类广泛存在于自然界中的细菌。 它们以葡萄糖为能源，并进行氧化代谢。
分类
根据形态和生理特征，氧化葡萄糖酸杆菌可以分为多个亚属，如乳酸菌亚属和醋酸菌亚属。
葡萄糖氧化酶汇总.
2.1-2 保持肠道菌群生态平衡，提高机体免疫力 葡萄糖氧化酶催化生成的葡萄糖酸，降低了胃肠内pH值， 为乳酸菌生长制造了酸性环境。有益菌增殖形成微生物竞争优 势，避免肠道菌群在生态上比例失调、定位转移、血行感染， 具有营养作用，参与氨基酸代谢，合成维生素B1、B2、B6、 B12、叶酸及维生素K等，在一定程度上抑制大肠杆菌，控制 感染，排除腐败物质，提高巨噬细胞活性，提高机体免疫力。 2.1-3 解除肠道霉菌毒素中毒，解除饲料霉菌超标危害 葡萄糖氧化酶能增进肝脏中微粒体的氧化作用，对霉菌毒 素进行生物学转化，通过分裂霉菌毒素的功能性原子组，将毒 素降解为无毒代谢物，被机体迅速排出。并可解除霉菌及其毒 素造成的肝肿大、胸腺萎缩、巨噬细胞受到的毒害和免疫抑制。
2.2葡萄糖氧化酶开创一种全新的动物保护模式 我们知道，无论哪一种控制病原菌生长的防病措施，都有一个 防卫限度。当病菌数量多到足以突破某种防病措施的防卫限度时， 动物发病。此时，传统的使用药物防病保健放的方式就没有其他办 法了。葡萄糖氧化酶则不同，首先提升机体自身的防御功能，使防 卫限度提高，其次，即使病菌突破了葡萄糖氧化酶的防卫限度，导 致畜禽感染，它的其它功效还在继续尽力维护着机体健康。其一， 葡萄糖氧化酶改善消化吸收的功效还在持续发挥着作用，较好的保 持畜禽发病期间的采食，使畜禽有充足的营养抵抗疾病；其二，葡 萄糖氧化酶保持肠道菌群平衡的功效还在持续发挥作用，某些疾病 引起的腹泻不至于过分严重，使动物体质不至于快速下降；其三， 葡萄糖氧化酶抗氧化的功效还在持续发挥作用，较好的保持机体细 胞完整，使病菌侵害细胞的速度减缓、侵害程度减轻；其四，葡萄 糖氧化酶解除霉菌毒素的功效还在持续发挥作用，霉变饲料产生的 毒素不会对病弱畜禽造成更严重的危害。
直到1928年，Muller首先从黑曲霉的无细胞提取液中发现葡萄糖 氧化酶，并研究了其催化机理才正式将其命名为葡萄糖氧化酶，将其 归入脱氢酶类。此后Nakamatsu、Fiedurek、Rogalski等先后对此做了 大量研究工作并投入生产。中国从20世纪70年代开始成立了葡萄糖氧 化酶研究协作组，对其展开了系统研究工作。目前国外的葡萄糖氧化 酶生产厂家主要是德国的Boehringer和日本的Toyobo。近年来国内外 多位学者对葡萄糖氧化酶的作用机理、酶学性质、酶固定化、基因克 隆表达等方面做了大量工作取得了明显进展。
葡萄糖氧化酶PPT优秀课件
04
葡萄糖氧化酶的基因工程研究
葡萄糖氧化酶基因的克隆和表达
葡萄糖合适的宿主 细胞。
基因表达调控
通过调节基因表达的转录水平、翻译水平以及翻译后修饰等环节，实现对葡萄糖 氧化酶表达的调控。
葡萄糖氧化酶基因的改造和优化
01
02
葡萄糖氧化酶在医药工业中的应用
葡萄糖氧化酶可以用于检测血糖浓度，是一种重要的 生物传感器
葡萄糖氧化酶可以作为药物载体，将药物准确地输送 到病变部位，提高药物的疗效和降低副作用
葡萄糖氧化酶还可以用于治疗糖尿病等慢性疾病的药 物中，以帮助控制血糖水平
葡萄糖氧化酶可以用于制备抗菌药物，如葡萄糖氧化 酶与银离子结合形成的抗菌剂
葡萄糖氧化酶在人体内具有重要的生理功能，如维持血糖水 平、提供能量等。
葡萄糖氧化酶的结构和性质
葡萄糖氧化酶是由两个相同亚基组成的二聚体，每个亚基 包含一个FAD辅基。
葡萄糖氧化酶的活性与分子量、等电点、光谱性质等有关 。
葡萄糖氧化酶的作用和意义
葡萄糖氧化酶在人体内能够催 化葡萄糖的氧化，从而维持血
葡萄糖氧化酶ppt优秀课件
2023-10-27
目 录
• 葡萄糖氧化酶简介 • 葡萄糖氧化酶的生物合成 • 葡萄糖氧化酶的应用研究 • 葡萄糖氧化酶的基因工程研究 • 葡萄糖氧化酶的未来研究和展望
01
葡萄糖氧化酶简介
葡萄糖氧化酶的概述
葡萄糖氧化酶是一种氧化还原酶，能够催化葡萄糖与氧反应 ，生成葡萄糖酸和过氧化氢。
VS
详细描述
虽然我们已经对葡萄糖氧化酶的结构、性 质和功能有了一定的了解，但在其应用过 程中仍然存在一些问题，如酶的稳定性、 活性不足等，需要进一步研究和改进。
氧化葡萄糖酸杆菌的发酵实验报告
氧化葡萄糖酸杆菌的发酵实验报告
在细菌鉴定中，糖类发酵产酸是1项重要依据。
细菌对糖类的
利用有2种类型：一种是从糖类发酵产酸，不需要以分子氧作为最终受氢体，称发酵型产酸；另一种则以分子氧作为最终受氢体，称氧化型产酸。
前者包括的菌种类型为多数。
氧化型产酸量较少，所产生的酸常常被培养基中的蛋白胨分解时所产生的胺所中和，而不表现产酸。
为此，Hugh和Leifson提出一种含有低有机氮的培养基，用以鉴定细菌从糖类产酸是属氧化型产酸或发酵型产酸。
这一试验广泛用于细菌鉴定。
一般用葡萄糖作为糖类代表。
也可利用这一基础培养基来测定细菌从其他糖类或醇类产酸的能力。
接种：以18－24h的幼龄菌种，穿刺接种在上述培养基中，每
株菌接4管，其中2管用油封盖（凡士林：液体石蜡＝1：1混合后
灭菌），约加0.5－1厘米厚，以隔绝空气为闭管。
另2管不封油为
开管，同时还要有不接种的闭管作对照。
适温培养1、2、4、7天观
察结果。
结果观察：氧化型产酸——仅开管产酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部产碱（1－2d），后来才稍变酸。
发酵型产酸则开管及闭管均产酸，如产气，则在琼脂柱内产生气泡。
葡萄糖氧化酶
葡萄糖氧化酶一、酶的简介葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，简称GOD)能够在有氧气的条件下专一性催化β-D- 葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢,高纯度GOD的制剂为淡黄色粉末、易溶于水，完全不溶于乙醚、氯仿、甘油和乙二醇[1]。
50%丙酮、66%甲醇能使其沉淀。
它广泛地分布于动物、植物和微生物体内，但由于微生物具有生长繁殖速度快，来源广等特点使之成为葡萄糖氧化酶的主要来源，微生物中的主要生产菌株为黑曲霉和青霉。
葡萄糖氧化酶是用黑曲霉等发酵制得的一种需氧脱氢酶，对人体无毒、副作用，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等功能，它广泛应用于食品、饲料、医药等行业中，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用。
【2】二、菌种及培养基2.1 菌种：以黑曲霉H1-9b为菌种，在发酵罐中装入培养基2.2 发酵培养基(g/L)：蔗糖80、蛋白胨3、KH2PO4 2、MgSO4·7H2O 0.7、KCl 0.5、NaNO3 4，pH5.5；斜面培养基(g/L)：蔗糖30、NaNO32、K2HPO41、KCl 0.5、MgSO4 0.5、FeSO40.01、琼脂20，pH5.5【3】。
发酵条件为：26～29摄氏度，pH值自然，通风量0．3m3／(m3·min)，搅拌速度400r／min。
发酵液离心分离得菌丝体，经研磨(因葡萄糖氧化酶是一种胞内酶，提取时首先必须先研磨破壁)后过滤，得到含葡萄糖氧化酶的滤液即酶液。
[4]三、工艺流程葡萄糖氧化酶制备流程图原料预处理培养基配制灭菌无菌空气制备发酵产品的分离纯化菌种的制备和种子培养葡萄糖氧化酶下游工艺流程图3.1葡萄糖氧化酶的发酵3.1.1种子液培养在斜面培养基上接种黑曲霉H1-9b 孢子，28℃培养4 ～5 d 。
3.1.2摇瓶发酵250mL 锥形瓶中分装50mL 发酵培养基，121℃灭菌20min，接种黑曲霉H1-9a 孢子浓度为104个/mL，28℃、200r/min 摇床培养80h 即达产酶高峰。
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)试剂盒说明书
货号：QS1403 规格：50管/48样葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）试剂盒说明书可见分光光度法正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：GOD（EC 1.1.3.4）广泛存在于动物、和植物中，催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并产生H 2O2，是生物体中产生活性氧的代谢途径之一。
测定原理：GOD催化产生H2O2，过氧化物酶在有氧存在时催化H2O2分解产生的氧又将邻联茴香胺氧化生成有色物质，颜色深浅与葡萄糖氧化酶活性成线性关系。
自备实验用品及仪器：可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水试剂的组成和配制：提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体40 mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体8 mL×1瓶，4℃保存；试剂三：液体2 mL×1支，4℃保存；样品测定的准备：组织处理：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
血清（浆）：直接检测。
测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至500nm，蒸馏水调零。
2、GOD检测工作液的配制：用时将试剂二和试剂三转移至试剂一中，充分混匀，待用；用不完的试剂4℃可保存一周；3、测定前将GOD检测工作液在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。
4、在1mL玻璃比色皿中加入40μL样本和960μL工作液，立即混匀并计时，记录500nm下20s吸光值A1和1min20s后的吸光值A2。
计算ΔA＝A2-A1。
GOD活力单位的计算：1、血清（浆）GOD活力的计算单位定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1nmol 氧化型邻联茴香胺为一个酶活力单位。
GOD（nmol/min/mL）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=3333×ΔA2、动物组织GOD活力的计算（1）按蛋白浓度计算单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol 氧化型邻联茴香胺为一个酶活力单位。
葡萄糖氧化酶
3.葡萄糖氧化酶的生产方法
一.（１）葡萄糖氧化酶粗酶液的获得：①高含量的葡萄糖氧化酶发酵液 获取：挑取长满可产葡萄糖氧化酶点的青霉菌菌苔，在一级培养基中 30～32℃振荡培养24ｈ；然后以２～３％接种量 接种于二级培养基中， 30～32 ℃振荡培养24ｈ；最后以２～３％接种量接种于内有三级培养基 的发酵罐中，控制溶氧为 60 ％以上，ｐＨ保持在 6.0 ～ 7.0 之间，发酵 36～48ｈ即可得到酶活为7.0Ｕ以上的葡萄糖氧化酶发酵液；②发酵液离 心浓缩处理：对发酵液进行离心处理，8000ｒｐｍ，20ｍｉｎ，收取上 清液，微滤去除残留的微小颗粒及菌体，超滤浓缩，直至酶活达到 20Ｕ 以上的葡萄糖氧化酶发酵；（２）葡萄糖氧化酶的提纯及脱盐:４℃条件 下，向超滤浓缩酶 液体中缓缓加入硫酸铵固体颗粒，直至形成90％硫酸 铵溶液，盐析４～６ｈ，12000ｒ／ｍｉｎ离心得沉淀，用ｐＨ7.0的Ｔ ｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲溶液收取沉淀蛋白，加去离子水稀释８～ 10倍，超 滤脱盐浓缩处理；（３）形成葡萄糖氧化酶冻干成品：加入保护剂于－ 20℃条件下冷冻真空干燥48小时，即得到葡萄糖氧化，提高机体免疫力 葡萄糖氧化酶催化生成的葡萄糖酸，降低了胃肠内pH值， 为乳酸菌生长制造了酸性环境。有益菌增殖形成微生物竞争优 势，避免肠道菌群在生态上比例失调、定位转移、血行感染， 具有营养作用，参与氨基酸代谢，合成维生素B1、B2、B6、 B12、叶酸及维生素K等，在一定程度上抑制大肠杆菌，控制 感染，排除腐败物质，提高巨噬细胞活性，提高机体免疫力。 2.1-3 解除肠道霉菌毒素中毒，解除饲料霉菌超标危害 葡萄糖氧化酶能增进肝脏中微粒体的氧化作用，对霉菌毒 素进行生物学转化，通过分裂霉菌毒素的功能性原子组，将毒 素降解为无毒代谢物，被机体迅速排出。并可解除霉菌及其毒 素造成的肝肿大、胸腺萎缩、巨噬细胞受到的毒害和免疫抑制。
氧化葡萄糖酸杆菌的特性及应用
Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ较好地生长在含有酪蛋白胨或酵 母膏，含糖类或醇类等多羟基化合物的液体培养基 中。以ｎ甘露醇或ｎ山梨醇为碳源时，其生物量比 用其他碳源时大，在没有有机氮源而以无机氮源为 唯一氮源的完全培养基中可生长，但生物量较小。 Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ的生长还需要泛酸、甲酸和烟酸等作为 生长促进剂。在液体培养基中添加Ｌ一谷氨酸、Ｌ一谷 氨酰胺、酮戊二酸、Ｌ一组氨酸和Ｌ一脯氨酸等氨基酸 时，能够促进该菌的生长，低浓度的磷酸盐也能够促 进该菌的生长。碳源浓度太高抑制细胞生长，产物 积累到一定的程度也抑制其生长。大多数 Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ菌株能在ｐＨ为２．５的复合培养基内生 长，但不能在ｐＨ为４．０以下的合成培养基内生
磷酸途径进行代谢，合成细胞成分所需要的材料。
Ｗｕ Ｓｕ等∞１报道，在发酵罐中含ｎ山梨醇、酵 母膏和无机盐的液体培养基中培养Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ
２ 氧化葡萄糖酸杆菌的应用
时，生物量干细胞为５．２ ｇ／Ｌ。由此可见，
Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ细胞膜脱氢酶迅速不完全氧化底
Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ的生物量比一般细菌的生物量低得多，
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ；ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ；ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ；ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
氧化葡萄糖酸杆菌（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）是一种专性 好氧的革兰氏阴性菌，属于醋酸杆菌科［１］。位于其 细胞膜上与呼吸链相连的脱氢酶具有不完全氧化多 种多羟基化合物为相应产物的能力，已经引起广大 生化学者的广泛关注［２］。在工农业生产上，利用其 全细胞（生长细胞或静息细胞）作为酶原转化底物为 相应的产物已有广泛的应用，单位生物量的细胞膜 脱氢酶活力较高，但生物量较一般细菌小。为提高 该酶的生物量和酶活，笔者综述了氧化葡萄糖酸杆 菌的细胞结构及其酶系分布、生长特性、代谢途径、 细胞膜脱氢酶在工农业生产上等方面的应用，同时 对氧化葡萄糖酸杆菌的缺陷作了阐述并提出了今后 研究方向。
氧化葡萄糖酸杆菌中5-葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质分析
氧化葡萄糖酸杆菌中5-葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质分析李翎;许琳;魏淼;李艳;严明【摘要】根据NCBI上的报道的基因序列设计引物,以氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)H24的基因组为模板,获得5-葡萄糖酸脱氢酶(Ga5DH)基因,将其与表达载体pET-28a连接,构建重组质粒pET-28a-Ga5DH,并转化大肠杆菌Rosetta进行表达.SDS-PAGE检测结果显示,表达蛋白的分子大小为26.5 kD,纯化后酶活达7.83 U/mg.酶学性质分析表明,该酶的最适反应温度为40℃,最适pH为11.在pH 9-11的缓冲中保温8h,酶活力仍有80％以上的残余.该酶对多种有机溶剂具有良好的耐受性.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2014(000)009【总页数】7页(P157-163)【关键词】5-葡萄糖酸脱氢酶;氧化葡萄糖酸杆菌;表达;酶学性质【作者】李翎;许琳;魏淼;李艳;严明【作者单位】南京工业大学生物与制药工程学院,南京211816;南京工业大学生物与制药工程学院,南京211816;南京工业大学生物与制药工程学院,南京211816;南京工业大学生物与制药工程学院,南京211816;南京工业大学生物与制药工程学院,南京211816【正文语种】中文5-葡萄糖酸脱氢酶（Gluconate 5-dehydrogenase，Ga5DH、GNO，EC1.1.1.69）是一种辅酶依赖性的还原酶，属于短链脱氢酶SDR家族，可以催化D-葡萄糖酸与5-酮基-D-葡萄糖酸（5-KGA）之间的可逆氧化还原转化［1］，从而调节生物体内的碳源和还原力转化，以维持机体内的代谢平衡，在葡萄糖代谢中具有重要作用［2，3］。
这种D-葡萄糖酸的氧化反应大多数依赖于NADP+，极少能以NAD+作为辅酶。
对该反应过程的动力学研究表明，该酶对D-葡萄糖酸氧化的速度低于5-酮基-D-葡萄糖酸还原的速度，因而其生成的NADPH在各种生物合成过程中可作为氢供体［4］，在辅酶再生系统中具有一定的应用潜力。
氧化葡萄糖酸杆菌老黄酶Go的酶学性质鉴定
氧化葡萄糖酸杆菌老黄酶Go的酶学性质鉴定陈晶晶;盛茜茜;钱姝文;严明;许琳【期刊名称】《生物加工过程》【年(卷),期】2017(15)1【摘要】从氧化葡萄糖酸杆菌（ Gluconobacter oxydans） H24中克隆出老黄酶Go的基因，通过构建重组表达质粒，在大肠杆菌BL21中诱导表达可溶性的蛋白，使用离子交换柱（ HiTrap DEAE FF）对重组酶进行纯化，并对其酶学性质进行表征。
结果表明：老黄酶Go的温度和pH耐受性都较好，在40℃条件下，12 h后能保持40％的活性；在pH10的条件下，12 h后能保持40％的活性；Go的底物谱十分广泛，对酰亚胺类、α，β不饱和醛酮、萜类都有一定的活性。
老黄酶Go有良好的有机溶剂耐受性，在体积分数20％的乙酸丁酯中可以保持90％左右的活性，但是金属离子对其影响较大，除Mg2＋和K＋外，所选的其他离子对Go 都有着不同程度的抑制作用。
最后，在催化性质的实验中发现， Go对柠檬醛的转化率有60％，并且其对映体过量值（e�e．）可以达到99％。
%Go, a novel old yellow enzyme from Gluconobacter oxydans H24, was successfully cloned and overexpressed in BL21( DE3) . Then the recombinant protein was identified and characterized after purified with HiTrap DEAE FF column. Go can reduce various activated alkenes imides,α,β⁃unsaturated ketones, and terpene and exhibits high temperature ( retaining 40% catalytic activity, 40 ℃ for 12 h ) and pH stability (retaining 40% activiy, pH 10 for 12 h),indicating that it has a great potential for biocatalysis. Also,it shows high tolerance toward organic solvents and maintain 90% activity in 20%ethyl acetate. However,Go has low tolerance towards metal ions. Tested metal ions all existed inhibitions toward Go except Mg2+and K+. Besides,Go can catalyze citral to ( S)⁃citronellal with 60% conversion and but high enantiomeric excess value ( e�e.>99%) .【总页数】8页(P20-27)【作者】陈晶晶;盛茜茜;钱姝文;严明;许琳【作者单位】南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京 211800;南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京 211800;南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京 211800;南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京 211800;南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京 211800【正文语种】中文【中图分类】Q554【相关文献】1.氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003膜结合乙醇脱氢酶的纯化鉴定和性质研究 [J], 韦柳静;林金萍;杨雪鹏;魏东芝2.氧化葡萄糖酸杆菌中5-葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质分析 [J], 李翎;许琳;魏淼;李艳;严明3.产耐热β-半乳糖苷酶蜜源芽孢杆菌的鉴定及酶学性质 [J], 李云; 朱少华; 管政兵; 蔡宇杰; 廖祥儒4.低温碱性蛋白酶芽孢杆菌的筛选鉴定及酶学性质研究 [J], 石慧; 莫晨阳; 金喆昊5.一株产耐高温蛋白酶蜡样芽胞杆菌的分子鉴定和酶学性质研究 [J], 佘新松;邵建扬;孙春巧;方茹月;储雅琪;江治萍;代雨婷;柏晓辉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
god葡萄糖氧化酶的结构
god葡萄糖氧化酶的结构
来自世界上不同地方的专家和研究人员一直在努力研究和揭示葡萄糖氧化酶（GOD）的结构。
GOD是一种酶，能催化葡萄糖分子的氧化反应，将葡萄糖转化为葡萄糖酸。
目前已有一些研究关于GOD结构的发现。
大多数结构都是通过X射线晶体学和核磁共振技术获得的。
研究显示，GOD通常是由两个相同的多肽链组成，每个肽链包含约500个氨基酸残基。
两个肽链通过多个二硫键连接在一起。
这两个肽链形成了一个类似于梳子的结构，其中一个肽链被称为“α链”，另一个被称为“β链”。
GOD的结构中存在着一个较大的催化中心，可以与葡萄糖结合并催化氧化反应。
这个催化中心由多个氨基酸残基组成，其中一些氨基酸可以与葡萄糖结合，而其他氨基酸则参与催化反应过程。
此外，GOD的结构中还存在一些辅助结构，如金属离子结合位点和辅因子结合位点。
这些结构可以帮助GOD稳定其结构并提高催化效率。
需要注意的是，GOD的结构可能因来源不同而有所差异。
不同的物种和细胞系可能会产生略微不同的GOD结构。
因此，葡萄糖氧化酶的结构是一个复杂而多样化的领域，仍有更多的研究需要进行，以更全面地了解GOD的结构和功能。
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陈晶晶，盛茜茜，钱姝文，严㊀ 明，许㊀ 琳
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｌｄ ｙｅｌｌｏｗ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒｏｍ Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ Ｈ２４
（ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
ｅｘｃｅｐｔ Ｍｇ２＋ ａｎｄ Ｋ ＋ ． Ｂｅｓｉｄｅｓ，Ｇｏ ｃａｎ ｃａｔａｌｙｚｅ ｃｉｔｒａｌ ｔｏ （ Ｓ ）⁃ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌ ｗｉｔｈ ６０％ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｕｔ ｈｉｇｈ Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ｏｌｄ ｙｅｌｌｏｗ ｅｎｚｙｍｅ； ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ Ｃ ������ Ｃ ｂｏｎｄ； Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ Ｈ２４； ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ㊀ ㊀ 在精细化学品㊁ 药物㊁ 农药中间体的研究领域， 生物催化法因为其高效率㊁ 高立体选择性和低成本 ㊂ 而 Ｃ ������ ������Ｃ 双 键的不对称还原因为其可以产生含有多至两个手 已经日益成为一种常用的合成途径
氧化葡萄糖酸杆菌老黄酶 Ｇｏ 的酶学性质鉴定
（ 南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００）
摘㊀ 要：从氧化葡萄糖酸杆菌（ Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） Ｈ２４ 中克隆出老黄酶 Ｇｏ 的基因， 通过构建重组表达质粒， 在 大肠杆菌 ＢＬ２１ 中诱导表达可溶性的蛋白，使用离子交换柱（ ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦ） 对重组酶进行纯化，并对其酶学性质 老黄酶 Ｇｏ 有良好的有机溶剂耐受性，在体积分数 ２０％ 的乙酸丁酯中可以保持 ９０％ 左右的活性，但是金属离子对其 Ｇｏ 对柠檬醛的转化率有 ６０％，并且其对映体过量值（ ｅ������ ｅ． ） 可以达到 ９９％㊂ 关键词：老黄酶；不对称还原碳碳双键；氧化葡萄糖酸杆菌 Ｈ２４；酶学性质 进行表征㊂ 结果表明：老黄酶 Ｇｏ 的温度和 ｐＨ 耐受性都较好，在 ４０ ħ 条件下，１２ ｈ 后能保持 ４０％ 的活性；在 ｐＨ１０ 的条件下，１２ ｈ 后能保持 ４０％ 的活性；Ｇｏ 的底物谱十分广泛，对酰亚胺类㊁α，β 不饱和醛酮㊁萜类都有一定的活性㊂ 影响较大，除 Ｍｇ２＋ 和 Ｋ ＋ 外，所选的其他离子对 Ｇｏ 都有着不同程度的抑制作用㊂ 最后， 在催化性质的实验中发现， 中图分类号：Ｑ５５４㊀ ㊀ ㊀ ㊀ 文献标识码：Ａ㊀ ㊀ ㊀ ㊀ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１７）０１－００２０－０８
［１９－２０］
１９３３ 年，老黄酶首次从啤酒酵母中分离出来， ㊂ 老黄酶在自然界的分布十 分 广
［４，９－１１］
１������ ２㊀ 仪器和试剂
酶和 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶，宝生物工程（ 大连） 有限公司； 细菌基因组试剂盒㊁ 质粒小提试剂盒㊁ 胶回收试剂 南京金斯瑞生物科技有限公司㊂ 所用底物 （ 马来酰 亚胺㊁马来酸二甲酯㊁ 香芹酮㊁ 茶香酮㊁ 衣康酸㊁ 中康 酸㊁柠康酐㊁２ 环戊烯酮㊁２ 环己烯酮㊁３ 甲基 ２ 环戊烯酮㊁３ 甲基 ２ 环己烯酮㊁ 乙酰环己烯㊁ 薄荷 酮㊁α 甲基肉桂醛㊁２ 甲基 ２ 戊烯醛㊁反式 ２ 己 Ａｌａｄｄｉｎ 公司； 抗生素㊁ 考马 斯 亮 蓝㊁ 牛 血 清 白 蛋 白 （ ＢＳＡ） 及其余试剂，生工生物工程 （ 上海 ） 股份有限 Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４Ｒ 型 高 速 冷 冻 离 心 机， Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ １������ ３㊀ 老黄酶 Ｇｏ 基因在大肠杆菌中的克隆和表达 号 为 ＣＰ００３９２６������ １ ） 设 计 引 物㊂ 上 游 引 物： ５ᶄ ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＧＡＡＧＴＴＴＣＧＡＴＣＡＡＧＧ 游引 物：５ᶄ ＧＧＡＧＴＡＣ 公司㊂ 烯醛㊁１ 苯基 ２ 硝基丙烯㊁ 硝基苯㊁ 柠檬醛等 ） ， 公 司； ＰｏｗｅｒＷａｖｅ ＸＳ 酶 标 仪， ＢＩＯ⁃ＴＥＫ 公 司； 盒，天根生化科技（ 北京） 有限公司；ＰＣＲ 引物合成，
［４，９，２３］ ［２２］
㊁ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
㊁
㊁ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
［２３－２５］
［２１］
的活性烯烃， 底物谱十分广泛， 包括 α， β 不饱和醛 酯㊁内酯㊁酰亚胺等） ㊁羧酸
［２２］
， 老黄酶可以催化一系列 及各种衍生物 （ 包括
㊁硝基烯
［２４－２５］
氧化葡萄糖酸杆菌 （ Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ） Ｈ２４
８������ ０ 的 磷 酸 缓 冲 平 衡 柱 子， 用 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ 和 ２０
柱（Ｈｉ Ｔｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦ） 进行纯化㊂ 用 ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ㊁ｐＨ
将粗酶液使用 ＡＫＴＡ 蛋白纯化仪和阴离子交换
的老黄酶可以
薄荷醇的重要手性中间体； 最早的热稳定性老黄酶 ＹｑｊＭ 被发现可以用于催化茶香酮生产 （ Ｒ ） 型的左 旋二酮，（ Ｒ ） 左旋二酮是类胡萝卜素合成中一种关 键的手性中间体㊂ 老黄酶 ＭＲ 在吗啡和可卡因生产 麻醉剂的合成中起到了重要的作用
［２８］
根据 Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ Ｈ２４（ ＧｅｎＢａｎｋ 登录 ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＧＴＴＴＣＧＡＴＣＡＡ⁃ ３ᶄ， 下
ＣＨＥＮ Ｊｉｎｇｊｉｎｇ，ＳＨＥＮＧ Ｘｉｑｉａｎ，ＱＩＡＮ Ｓｈｕｗｅｎ，ＹＡＮ Ｍｉｎｇ，ＸＵ Ｌｉｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｇｏ，ａ ｎｏｖｅｌ ｏｌｄ ｙｅｌｌｏｗ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒｏｍ Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ Ｈ２４， ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ＢＬ２１（ＤＥ３）． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ （ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ４０％ ａｃｔｉｖｉｙ， ｐＨ １０ ｆｏｒ １２ ｈ），ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｉｔ ｈａｓ ａ ｇｒｅａｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ． Ａｌｓｏ，ｉｔ ｓｈｏｗｓ ｈｉｇｈ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏｗａｒｄ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ ａｎｄ ｍａｉｎｔａｉｎ ９０％ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ２０％ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ． ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ ｅｘｃｅｓｓ ｖａｌｕｅ （ ｅ������ ｅ． ＞９９％）． ｗｉｔｈ ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦ ｃｏｌｕｍｎ． Ｇｏ ｃａｎ ｒｅｄｕｃｅ ｖａｒｉｏｕｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｌｋｅｎｅｓ ｉｍｉｄｅｓ，α，β⁃ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｋｅｔｏｎｅｓ， ａｎｄ ｔｅｒｐｅｎｅ ａｎｄ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ （ ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ４０％ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ４０ ħ ｆｏｒ １２ ｈ） ａｎｄ ｐＨ Ｈｏｗｅｖｅｒ，Ｇｏ ｈａｓ ｌｏｗ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏｗａｒｄｓ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ． Ｔｅｓｔｅｄ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ａｌｌ ｅｘｉｓｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｓ ｔｏｗａｒｄ Ｇｏ
２０１７ 年 １ 月
第 １５ 卷第 １ 期
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
生㊀ 物㊀ 加㊀����� １ Ｊａｎ． ２０１７
ｄｏｉ：１０������ ３９６９ ／ ｊ������ ｉｓｓｎ������ １６７２－３６７８������ ２０１７������ ０１������ ００４
［１］
性中心的化合物，并且这些化合物通常都是有机合 成中的重要手性砌块， 已经成为使用最广泛的生产 手性化合物的合成方法之一㊂ 近年来， 生物催化的 方法被越来越多地应用到 Ｃ ������ ������Ｃ 双键的还原中， 并
收稿日期：２０１６－０４－２２
基金项目：国家重点基础研究计划（９７３ 计划） （２０１１ＣＢＡ００８０４） 作者简介：陈晶晶（１９９０
各种限制性内切酶㊁Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ 聚合
目前为 止， 已 报 道 的 老 黄 酶 微 生 物 来 源 主 要 有
［９－１０］
中都有发现㊂ 到
［１２］
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ［１３－１５］ ㊁ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ［１６－１８］ ㊁ 和 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ 酮
老黄酶催化还原 Ｃ ������ ������Ｃ 双键的作用使其在工业
㊂
ＢａｍＨⅠ酶切位点，划线处为酶切位点 ） ㊂ 将扩增的 ＤＮＡ 片段与 ｐＥＴ ２２ｂ（ ＋ ） 载体同时进行相同的限 制性内切酶酶切， 用 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶连接并转化至 Ｅ������ ｃｏｌｉ ＤＨ５α 克隆载体， 挑取阳性克隆送至南京金 斯瑞生物科技有限公司进行测序㊂ 将正确测序的 Ｇｏ 基因转入表达载体 ＢＬ２１ （ ＤＥ３） 进行表达㊂ 挑取 重组菌单菌落，接种到含有 １００ ｍｇ ／ ｍＬ 氨苄青霉素 抗性的 ５ ｍＬ 液体培养基中， 在 ３７ ħ ㊁２００ ｒ ／ ｍｉｎ 的 恒温摇床中培养 １２ ｈ㊂ 将培养 １２ ｈ 的菌液以体积 分数 ２％ 的接种量接入含有 １００ ｍｇ ／ ｍＬ 氨苄青霉素 抗性的 １００ ｍＬ 自诱导液体培养基中， 在 ３０ ħ ㊁２００ ｒ ／ ｍｉｎ 的摇床中诱导培养 １５ ｈ㊂ 诱导结束后， 用高 速冷冻离心机收集菌体㊂ 用磷酸缓冲 （ ｐＨ ８������ ０） 清 洗菌体 １ 次，最后用 ５ ｍＬ 磷酸悬浮菌体㊂ 在冰上用 １０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下离心 １５ ｍｉｎ㊂ 将收集得到的上 １������ ４㊀ 老黄酶 Ｇｏ 的分离纯化 清液过膜后置于 ４ ħ 冰箱待用㊂ 超声细胞粉碎机破碎细胞， 破碎后的细胞在 ４ ħ ㊁
） ，女，湖北红安人，研究方向：基因工程与生物信息学；严㊀ 明（ 联系人） ，副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙａｎｍｉｎｇ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ