实验一 微生物培养基的制备与灭菌知识讲解
最新1实验一培养基的制备和灭菌
1实验一培养基的制备和灭菌实验一培养基的制备和灭菌一、实验目的(一)熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。
(二)掌握培养基和无菌水的制备方法。
(三)掌握高压蒸汽灭菌技术。
二、基本原理培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质用人工方法配制而成的基质。
其中含有水分、碳水化合物、含氮化合物、无机盐及各种必要的维生素。
培养基可以为微生物的生长提供能源、组成菌体细胞的原料以及调节代谢活动。
由于不同微生物营养类型不同,对营养物质的要求也各不相同,因此,需要配制不同种类的培养基。
一般培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基,培养放线菌常用淀粉培养基,培养霉菌常用马铃薯培养基,培养酵母菌常用麦芽汁培养基(或麦芽糖、蛋白胨培养基)。
培养基除了要满足微生物生长所要求的各种营养物质外,还应保证微生物所需要的其他生活条件,如适宜的酸碱度,渗透压等,因此,根据不同种类微生物的要求,应将培养基调节到一定的 pH范围,如,细菌培养基中性偏碱、放线菌培养基偏碱、霉菌、酵母菌培养基偏酸。
根据研究的不同,可以将培养基制成固体、半固体和液体三种形式,固体培养基的成分与液体相同,仅在液体培养基中加入凝固剂作支持物,通常加入0.5~2.0 %的琼脂,半固体加入0.3~0.5 %琼脂作支持物,有时也可用明胶或硅胶作为凝固剂。
培养基的种类很多,它们的配方及配制方法虽各有差异,但一般培养基的配制程序却大致相同。
例如器皿的准备,培养基的配制与分装,棉塞的制作,培养基的灭菌,斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。
正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。
待水蒸气急剧地将锅内冷空气从排气阀中驱尽,关闭排气阀,继续加热,此时由于蒸汽不能溢出,而增加了灭菌锅内的压力,从而使沸点增高,得到高于100℃的温度。
导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
实验一 培养基的制备消毒灭菌
(2) 装放待灭菌物品:将已包扎好的物品放入内桶。盖上锅盖,以两
两对称方式同时旋紧螺栓,勿使漏气。
(3) 加热排气:接通热源,同时打开排气阀,待见有大量水汽排出时,
维持3---5min,锅内空气排尽,关上排气阀。另外一种排气方法:先将排气 阀关闭,待加热升温内压达到5磅时再打开排气阀,等到压力表指针回到零, 关闭排气阀。
培养基的作用:微生物分离、培养、增殖、保藏及鉴定。
培养基配制原则
◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆
选择适宜的营养物质 营养物质浓度及配比合适 控制pH条件 控制氧化还原电位
原料来源的选择
根据培养目的不同调配
灭菌处理
2 消毒和灭菌的原理
★ 消毒与灭菌是确保 微生物纯培养 (由一个菌体
生长繁殖的群体)的最基本的实验技术。
高 压 蒸 汽 灭 菌 锅
a 方法:一般121℃(1kg/cm2或15磅/英寸2) 20-30min。 b 适用:耐高温物品如培养基,无菌水,培养皿。 c 注意事项:灭菌开始排净冷空气;
灭菌终了,自然缓慢降压回零;
灭菌结束,趁热取出物品。
三 实验操作步骤
分组操作:分6组,5人1组。
◆ ◆ ◆
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(第1~2组做,每组600ml) 马铃薯糖琼脂培养基(第3~4组做,400ml) 高氏1号培养基(第5~6组做,200ml)
每组需要做的其它工作
(1)每组包1ml吸管5支(塞棉花)(示范) 。 (2)每组包培养皿2包(每包6个) (示范)。 (3)每组装9ml无菌水5管。 (4)每组装20ml无菌水2瓶(50ml三角瓶,内有玻璃珠)。
(5)装锅灭菌。
高压蒸汽灭菌
(1) 灭菌前的准备:将高压蒸汽灭菌锅的内桶取出,向外锅内加入适
培养基的配制和灭菌1
5、分装过程中注意不要将培养基沾在管(瓶)口上,以免沾污棉塞 而引起污染。
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• 生理生化用培养基
• 2.溶解
• 加入所需要的水量,搅拌,使其溶解。
• 3.调节pH值
• 用玻璃棒沾少许液体,测量pH值。用氢氧化钠和 盐酸调节pH。
• 4.过滤 用滤纸或多层纱布过滤,一般无特殊要求可省 去。
• 5.分装及包扎
• 根据不同的需要,可将制好的培养基分装入试 管内(用分装漏斗)或三角瓶内,管(瓶)口 塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。
培养基的种类繁多,根据培养基的成分、物理 性状不同,可分为天然培养基、合成培养基、半 合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液体 培养基
灭菌是指应用物理或化学的方法,杀灭物 体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢 子。灭菌方法很多,可分为加热、过滤、照 射和化学药品法等。
常用加热灭菌法: 1、干热灭菌:
(四)实验方法
培养基的制备过程 称量---溶解----调节pH值----过滤---分装及包扎----灭菌----灭菌后试管 摆放斜面
• 1.称量 按照培养基配方,准确称量各成份放于瓷缸中。
• 配方:牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g,琼 脂粉20.0g,自来水水1000ml,pH7.0。
用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌 2、湿热灭菌
⑴高压蒸汽灭菌法 ⑵间歇灭菌法 ⑶煮沸消毒法
(三)实验器材
• 1.药品和试剂:牛肉膏、蛋白胨、NaCl、5% NaOH溶液、5%盐酸溶液;生理生化培养基。
微生物实验培养基制备和灭菌课件
称量:按培养基配方比例依次准确地称 取所需药品逐一放入搪瓷杯中
溶化:在电炉上加热溶解。
注:琼脂要在沸水中溶解,用玻棒不断搅拌,直至 完全溶解(分装试管)。
• 高氏一号培养基(同上)
1个组:配1000ml,分装三角瓶(150ml/瓶)
• 马丁氏培养基(同上)
2个组:各配500ml,分装三角瓶(150ml/瓶)
实验安排( 4人/组)
一、器皿包扎和灭菌 (1)培养皿12只(6只1包) (2)1mL移液管6支 (3)干热灭菌(160 ℃ ,2h)
二、制备无菌水 (1)250mL三角瓶:内装玻璃珠和90mL水 (2)试管6支:分装9mL水/支 (3)牛皮纸包扎,高压蒸汽灭菌(121 ℃,20min)
• 一般采用0.103 MPa的蒸汽压力,此时温度是121.1℃,维 持15~20 min。当灭菌物品中有易破坏的成分,可采用 较低温度115℃(蒸汽压力0.075 MPa)下维持30 min左右.
手提式高压蒸汽灭菌锅
图示 手提式灭菌锅结构 1、安全阀;2、压力表;3、放气阀;4、软管;5、螺 栓6、灭菌桶;7、筛架;8、水
不同的微生物对培养基 pH要求不同,霉菌和酵母菌的 培养基 pH一般是偏酸性的,而细菌和放线菌的培养基 pH
一般为中性或微碱性。
实验器材
• 仪器或其他用具:搪瓷杯,试管,三角瓶,烧杯, 量筒,玻棒,电磁炉、培养基分装器,高压蒸汽 灭菌锅,精密pH试纸(pH 5.5~9.0),牛角匙, 棉花(或橡胶塞),牛皮纸,记号笔,纱布,棉 绳等。
培养基的制备与灭菌实验报告
培养基的制备与灭菌实验报告培养基的制备与灭菌实验报告引言:在微生物学研究中,培养基是不可或缺的工具。
培养基的制备和灭菌是保证实验结果准确性和可重复性的重要步骤。
本实验旨在探究培养基的制备方法和灭菌技术的应用。
一、培养基的制备1.1 选择合适的培养基成分培养基的成分根据微生物的需求而定。
常见的培养基成分包括碳源、氮源、无机盐、生长因子等。
在制备培养基时,需根据所研究的微生物特性选择合适的成分。
1.2 制备培养基的步骤制备培养基的步骤主要包括称量、溶解、调pH、加热消毒和装瓶。
首先,按照配方称取所需成分,并逐一溶解于适量的蒸馏水中。
随后,根据微生物的需求,调节溶液的pH值。
最后,将溶液装入试管或培养皿中,并加热消毒。
二、灭菌技术的应用2.1 灭菌的目的灭菌是指将培养基、培养器具和实验室环境中的微生物杀灭或去除的过程。
灭菌的目的是为了避免外来微生物的污染,确保实验结果的准确性。
2.2 常用的灭菌方法常用的灭菌方法包括高温灭菌、化学灭菌和紫外线灭菌。
高温灭菌是指将培养基或器具在高温条件下进行加热消毒,常用的方法有烘箱灭菌和压力灭菌。
化学灭菌则是通过使用化学物质如酒精、乙醛等来杀灭微生物。
紫外线灭菌则是利用紫外线的辐射杀灭微生物。
2.3 实验中的灭菌操作在实验中,常用的灭菌操作包括培养基灭菌、器具灭菌和工作台灭菌。
培养基灭菌是将制备好的培养基加热消毒,以杀灭其中的微生物。
器具灭菌则是通过高温、化学物质或紫外线对实验器具进行消毒。
工作台灭菌则是通过紫外线辐射对实验台面进行灭菌处理。
结论:培养基的制备和灭菌是微生物学研究中的重要环节。
正确的培养基制备和灭菌操作可以确保实验结果的准确性和可重复性。
通过本实验,我们学习了培养基的制备方法和常用的灭菌技术,为今后的微生物实验打下了基础。
参考文献:[1] 陈晓玲, 赵莉, 邱晓红, 等. 基础微生物学实验教程[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社, 2017.[2] 郭燕妮, 张晓红. 微生物学实验指导[M]. 北京: 高等教育出版社, 2019.。
微生物培养基的配制和灭菌 PPT课件
實驗程式18
(培養基和玻璃器材的滅菌方法)
思考題
固體培養基加瓊脂後加熱溶化時要注意哪些問 題? 培養基中加瓊脂的作用是什麼? 幹熱滅菌、高壓蒸汽滅菌和間歇滅菌的場合有 何不同? 如何檢查培養基滅菌是否徹底?
實驗程式16
(培養基和玻璃器材的滅菌方法)
實驗程式17
(培養基和玻璃器材的滅菌方法)
紫外線滅菌法: 一般30W燈管,9m3空間,距地面2m每次打開紫外線照射0.5h, 就使室內空氣滅菌。若照射紫外線時先噴灑石炭酸等化學消毒劑, 可增強滅菌效果。紫外線雖有較強的殺菌力,但穿透力弱,即使 一薄層玻璃或水層就能將大部分紫外線濾除,因此只適用於空氣 及表面殺菌。
實驗程序
培養基的配製 分離培養微生物常用器皿的準備 培養基和玻璃器材的滅菌方法
實 驗 程 序1
(培養基的配製)
培養基的種類 培養基的配製方法和步驟 三種培養基的配方及配製 無菌水的製備
實 驗 程 序2
(培養基的種類)
據組成成分可分為:
1.合成培養基:由各種純化學物質按一定比例配製而成。 2.半合成培養基:有一部分純化學物質和另一部分天然物質配製 而成。 3.天然培養基:利用天然來源的有機物配製而成。
實 驗 程 序9
(三種培養基的配方及配製)
澱粉瓊脂培養基(高氏一號Gause´1),用於分離 和培養放線菌,是一種合成培養基。配方如下:
可溶性澱粉
KNO3 K2HPO4 MgSO4• 7H2O NaCl FeSO4• 7H2O 瓊脂 自來水
培养基的制备与灭菌实验报告
培养基的制备与灭菌实验报告实验目的,掌握培养基的制备方法和灭菌技术,保证培养基无菌,为微生物实验提供良好的生长条件。
一、培养基的制备。
1.1 培养基的组成。
培养基是微生物生长和繁殖的营养物质,通常包括碳源、氮源、矿物质盐和生长因子等。
根据不同微生物的需求,培养基的组成也有所不同。
1.2 制备步骤。
(1)称取适量的葡萄糖、蛋白胨、氯化钠等原料;(2)加入适量的蒸馏水,搅拌均匀;(3)调节pH值,通常为7.0-7.2;(4)分装至试管或培养皿中,加入琼脂(如需要固体培养基);(5)高压蒸汽灭菌15分钟。
二、培养基的灭菌实验。
2.1 灭菌方法。
培养基的灭菌是为了保证培养基中无菌,通常采用高压蒸汽灭菌法。
在高压下,微生物及其孢子、病毒等能够被有效杀灭。
2.2 实验步骤。
(1)将制备好的培养基分装至试管或培养皿中;(2)密封好容器,放入高压灭菌锅中;(3)加水至适当高度,密封锅盖;(4)加热至121摄氏度,压力达到1.05kg/cm2后开始计时,持续15分钟;(5)关火,等待冷却后取出培养基。
实验结果,经过高压蒸汽灭菌处理后,培养基中无任何微生物生长。
证明培养基已达到无菌状态,可以用于微生物的培养和实验。
结论,通过本次实验,我们掌握了培养基的制备方法和灭菌技术,为后续的微生物实验提供了良好的条件。
同时,也加深了对无菌技术的理解和应用。
参考文献:[1] 陈华. 微生物学实验指导. 北京,高等教育出版社, 2015.[2] 王明. 实验室微生物学. 上海,上海科学技术出版社, 2018.以上为培养基的制备与灭菌实验报告。
(文档结束)。
微生物实验一培养基制作及灭菌
一、实验目的
1. 掌握微生物学实验中常用的玻璃器皿的包扎方 法与棉塞的制作 2.了解配制培养基的原理,并掌握配制培养基的 一般方法和步骤 3.了解加压蒸汽灭菌的原理,并掌握其具体操作 方法
二、实验原理
(1)微生物学常用的玻璃仪器
培养皿,试管,三角瓶(锥形瓶)、吸量管,(大小)
实验报告注意事项
1.上课前必须写好预习实验报告 2. 实验报告内容必须填写完整,如 实验课 程,实验时间,指导教师等 3. 本次实验结束后必须记录好原始记录,由 老师签完名后方可离开 4. 值日生打扫卫生 5.实验成绩占期末总评成绩的20%
下一个实验
实验二、细菌的简单染色和革兰氏染色
(2)培养基的分类
按物理状态分、按组成成分分、按用途分 配置培养基时注意的事项:pH(不能回调),T
(3)培养基的灭菌
培养基配置好后应立即灭菌,且不能再次灭菌 化学灭菌(甲醛,洁尔灭、升汞), 物理灭菌(干热,紫外线等、过滤除菌)、 湿热灭菌
干燥箱
细菌过滤器
用于滤过除菌的各式滤器
手提式灭菌锅
a.培养皿的包装每10套一包,用旧报纸包扎 (或放在特制铁皮圆筒里,加盖扣严)。 b.吸管的包装首先在吸管的上端塞上一小段 棉花,用长纸条包扎、打结。 c.玻璃涂布棒的包装方法同吸管的包装。 d. 三角瓶的包扎
2. 培养基的制备与分装
(1)三角瓶固体培养基的制备 a.称量按培养基配方比例依次准确地称取药品, 放入在瓷缸内。 (注意药品称量顺序) b. 加入定量的琼脂、水,煮沸,溶解 c.完全溶解后,补充水分,调pH值(不要调过 头) d.分装置三角瓶中,注意装液量 e. 加棉塞,包扎, 高压蒸汽灭菌,121℃,0.10Mpa,20min
实验培养基的配制、消毒与灭菌
擦洗,然后再开紫外灯照射,即可增强杀菌效 果,达到灭菌目的。
灭菌的试管培养基冷至50 ℃ 左右再搁置, 以防斜面上冷凝水太多。 斜面长度不超过试管总长的一半。
将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养 24-48小时,以检查灭菌是否彻底。
实验任务
每组按要求配制培养基 趁热将培养基分装至 6把试管( 6×7支 ,不超过 管高 1/5 );剩余的培养基装入锥形瓶中(每瓶 约150 mL ) 对试管、锥形瓶进行包装,贴上标签(培养基名 称、配制时间、组别) 高压蒸汽灭菌(121 ℃,灭菌20min)
用来培养酵母菌
黄豆芽: 蔗糖(葡萄糖): 琼脂: 水: pH: 10 0 g 50 g 20 g 1000 mL 自然
称取新鲜黄豆芽100 g,放入烧杯中加水煮沸约30 min, 用纱布过滤。滤液中加入糖和琼脂,溶化后补足水至 1000 mL,最后灭菌。
麦氏(Meclary)培养基的制备
培养基中多种无机盐可能相互作用而产生沉淀。 因此,在混合培养基成分时,一般是按配方的 顺序依次溶解各成分,甚至有时还需要将二种 或多种成分分别灭菌,使用时再按比例混合。
对于微量成分,可先配制成高浓度的储备液, 按比例换算后再加入。 琼脂溶化过程中,要控制火力并不断搅拌,以 免沸腾溢出或琼脂糊底烧焦。
作业
实验报告 思考题1:培养基配置好后,为什么必须立即灭菌? 如何检查灭菌后的培养基是否为无菌的?
思考题2:如果需要配制一种含有某抗生素的固体培 养基,其中抗生素的终质量浓度(或工作浓度)为 50ug/mL,你将如何操作?(提示:抗生素在高温下 易失效)
下一次实验:微生物分离培养
可溶性淀粉: KNO3: NaCl: K2HPO4· 3H2O: MgSO4· 7H2O: FeSO4· 7H2O: 琼脂: 水: pH: 20 g 1 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.01 g 20 g 1000 mL 7.2~7.4
微生物实验一、培养基的配制与灭菌
培养基的配制与灭菌一、实验目的1. 了解一般培养基配制原理,掌握培养基常规配制程序。
2. 了解培养基配制过程各环节的要求和注意事项,掌握实验室各种灭菌技术及玻璃器皿的包装方法。
二、基本原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料,主要含有微生物生长繁殖所必需的碳源、氮源、无机盐、生长因子及水分,并要求具有适宜的pH值、合适的渗透压等。
由于微生物具有不同的营养类型,对营养物质的要求各不相同,加之实验和研究的目的不同,所以培养基的种类很多,使用的原料各有差异,但一般配制程序却大致相同。
三、实验材料1. 器皿及材料天平、称量纸、钥匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、橡胶塞、试管架、三角瓶、移液管、洗耳球、培养皿、玻璃棒、烧杯、剪刀、酒精灯、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、电炉、灭菌锅等。
2. 药品试剂蛋白胨、牛肉膏、NaCl、琼脂、水、1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液。
四、实验流程称药品→溶解→调pH值→加琼脂融化(补水,固体培养基用)→过滤(可省略)→分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板→无菌检查。
五、操作步骤1. 称量药品根据培养基配方依次准确称取各种药品,放入适当大小的烧杯中,琼脂不要加入。
蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速。
2. 溶解用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中,在放有石棉网的电炉上小火加热,并用玻棒搅拌,以防液体溢出。
待各种药品完全溶解后,停止加热,补足水分。
(如果配方中有淀粉,则先将淀粉用少量冷水调成糊状,并在火上加热搅拌,然后加足水分及其它原料,待完全溶化后,补足水分。
)3. 调节pH用1mol/L NaOH或1mol/L HC1溶液调至所需pH。
注意pH值不要调过头,以免回调,否则会影响培养基内各离子浓度。
4. 溶化琼脂琼脂加入后,置电炉上一边搅拌一边加热,直至琼脂完全溶化后才能停止搅拌,并补足水分(水需预热)。
注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
5. 过滤分装有时需用滤纸或纱布趁热过滤,以利于观察结果。
实验一培养基的配制与灭菌技术一、目的要求1掌握配制培养基的...
实验一培养基的配制与灭菌技术一、目的要求1 掌握配制培养基的一般方法和步骤。
2 学习高压灭菌锅的操作方法。
二、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基,它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。
其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源,磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源,而NACL提供无机盐。
在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。
琼脂在常用浓度下96℃时溶化,一般实际应用时在下面垫以石棉网煮沸溶化,以免琼脂烧焦。
琼脂在40℃时凝固,通常不被微生物分解利用。
由于这种培养基多用于培养细菌,因此,要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性,以利于细菌的生长繁殖。
高氏1号培养基是分离和培养放线菌的合成培养基,是由可溶性淀粉作碳源,KNO3作氮源,NaCl,K2HPO4.3H2O,MgSO4.7H2O,FeSO4.7H2O为微生物提供钠、钾、磷、镁、硫等离子。
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。
待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽,然后关闭排气阀,继续加热,此时由于蒸汽不能溢出,而增加了灭菌器内的压力,从而使沸点增高,得到高于100℃的温度,导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,其原因有三:一是湿热中细菌菌体吸收水分,蛋白质较易凝固;二是湿热的穿透力比干热大;三是湿热的蒸汽有潜热存在,这种潜热,能迅速提高被灭菌物体的温度,从而增加灭菌效力。
灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。
通常为15磅/英寸2(121.3℃)灭菌15—20分钟;不耐高压的培养基则可采用流通蒸汽灭菌或间歇灭菌。
含糖培养基用112.6℃(8磅/英寸2)灭菌15分钟。
紫外线灭菌是用紫外线灯进行的,紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成,从而抑制了DNA的复制;由于辐射能使空气中的氧电离成[O]再使O2氧化生成臭氧O3或使水H2O氧化生成过氧化氢H2O2,O3和H2O2均有杀菌作用。
实验一 培养基的配制和消毒灭菌(精编课件).ppt
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四、 消毒和灭菌 化学药品灭菌法 物理灭菌法
五、 附录: 棉塞的制作方法 方法1:过程及图解 方法2: 过程及图解
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2. 配制过程和方法(以牛肉膏蛋白胨培养基为例): 称取 药品 → 加热溶解 → 调pH值 → 过滤 →分装 →加棉 塞 → 包扎 → 灭菌 → 摆斜面 → 无菌检察
3. 其他培养基的配制: 高氏1号培养基,察氏培养基,马丁氏等培养基的配
制方法见教材附录 注意药品加入的次序避免起沉淀反应,避免药品
结块,以及配备储备液等等。
马铃薯培养基的配置:
马铃薯:20g
蔗糖: 2g
蛋白胨:0.4g
水
100ml
PH
自然
方法:马铃薯去皮,削成片、煮沸30分钟、 纱布过滤、加糖和蛋白胨琼脂、补足水分、 121度、灭菌30分钟。
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六、 实验报告
1. 记录你所配制培养基的名称、数量、图解配制过程 及注意事项
2. 记录高压蒸汽灭菌的操作过程和注意事项 3.准备灭菌用的物品:无菌试管6只、无菌培养皿11套、 无菌移液管6只(1ml)、6只(5ml或10ml) 4.无菌水200-300ml
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实验内容: ① 配制牛肉膏蛋白胨培养基200ml,分装到5 只试管做斜面; ② 剩余的培养基倒入三角瓶中,统一灭菌 ③ 制作棉塞5只; 作业与思考:
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实验一微生物培养基的制备与灭菌(8课时)
一、目的要求
1、学习配制微生物培养基的一般方法和步骤。
2、掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。
二、基本原理
正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。
由于微生物种类及代谢类型的多样性,因而用于培养微生物的培养基的种类也很多,它们的配方及配制方法虽各有差异,但一般培养基的配制程序却大致相同,例如器皿的准备,培养基的配制与分装,棉塞的制作,培养基的灭菌,斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。
三、实验材料
1、药品:牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂粉、1mol/L的NaOH和1mol/L HCl溶液。
2、仪器及玻璃器皿:电子天平、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、酒精灯、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿和玻璃棒等。
3、其他物品:药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、报纸、线绳和注射器等。
四、操作步骤
(一)玻璃器皿的洗涤
玻璃器皿在使用前必须用洗涤剂洗刷干净,然后用自来水冲净,置于烘箱中烘干后备用。
(二)牛肉膏蛋白胨培养基的配制
1、培养基配制
(1)称量:按培养基配方计算出各成分的用量,然后用电子天平进行准确称量后倒入一烧杯中。
注意:称量药品时,一定要用称量纸而不能用滤纸。
称药品用的药匙不要混用,称完药品应及时盖紧瓶盖。
(2)溶解:用量筒称量所需体积的水(根据实验需要可用自来水或蒸馏水),倒
入烧杯中,用玻璃棒搅动溶解即可。
(3)调pH:一般用pH试纸测定培养基的pH,可用1mol/L NaOH或1mol/L HCl 溶液进行调节。
调节pH时,应逐滴加入NaOH或HCI溶液,防止局部过酸或过碱,破坏培养基中成分。
边加边搅拌,并不时用PH试纸测试,直至达到所需pH为止。
注意:pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
2、制备液体培养基
(1)用量筒准确量取20ml培养基,倒入100ml三角瓶中,塞好棉塞,用报纸包好瓶口并用棉线包扎好,灭菌。
注意:倒溶液时不要把瓶口沾湿。
包扎时不要把瓶子弄倒而把棉塞弄湿。
3、制备固体培养基
(1)平板培养基
A、用量筒准确量取100ml培养基,倒入250ml三角瓶中,加入2g琼脂粉,塞好棉塞,用报纸包好瓶口并用棉线包扎好,灭菌。
B、将洗净烘干的培养皿用报纸包扎好,灭菌。
C、在超净工作台中,将装在三角瓶中已灭菌的琼脂培养基冷至50℃左右倾入无菌培养皿中。
温度过高时,皿盖上的冷凝水太多;温度低于50℃,培养基易于凝固而无法制作平板。
平板的制作应在火旁进行,左手拿培养皿,右手拿三角瓶的底部,左手同时用小指和手掌将棉塞打开,灼烧瓶口,用左手大拇指将培养皿盖打开,倾入10-15ml培养基,迅速盖好皿盖,置于桌上,轻轻旋转平皿,使培养基均匀分布于整个平皿中,冷凝后即成平板。
(2)斜面培养基
A、用量筒量取100ml培养基,倒入一个烧杯中,加入2g琼脂粉,置于石棉网上加热,用玻璃棒搅动溶解至琼脂粉溶解。
B、将洗净烘干的试管放置在试管架上,用注射器将融化琼脂粉的培养基倒入试管至试管高度的1/4处。
注意:不要将试管口弄脏。
C、待培养基冷却凝固后,塞上棉塞,以2支或4支为一组,用报纸将试管口包扎好,灭菌。
D、灭菌后,趁热将试管口端搁在一根长木条上,并调整斜度,便斜面的长度不
超过试管总长的1/2。
10.无菌检查将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24~48h,无菌生长即可使用,或贮存于冰箱或清洁的橱内,备用。
(三)培养基的灭菌
培养基经分装包扎后,应立即按配制方法规定的灭菌条件进行进行高压蒸汽灭菌。
(四)培养基的灭菌检查
灭菌后的培养基,一般需进行无菌检查。
最好取出1-2管(瓶),置于37℃温箱中培养1-2天,确定无菌后方可使用。
五、实验内容
1、根据要求清洗各种玻璃器皿,并进行烘干和包扎。
2、根据要求配制微生物培养基。
3、掌握用高压蒸汽灭菌锅对培养基灭菌。
4、掌握液体培养基、平板培养基和斜面培养基的制备。
六、实验报告
1、记录本实验配制培养基的名称、数量,并图解说明其配制过程,指明要点。
2、记录所做培养基的无菌检查结果。
七、实验思考题
1、为什么微生物实验室所用的三角瓶口或试管口都要塞上棉塞才能使用?能否用木塞或棉皮塞代替?
2、配制培养基时为什么要调节pH?
3、高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低、时间短?
4、高压蒸汽灭菌的原理是什么?是否只要压力表上的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温度?为什么?
5、培养基配制完成后,为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?
6、请设计实验对饮料进行无菌检查。
附录高压蒸汽灭菌技术
一、目的要求
了解消毒和灭菌的原理,并掌握各种灭菌方法的操作步骤。
二、实验材料
上述配制的培养基,包扎的培养皿、试管,高压蒸汽灭菌锅,注射器,镊子,玻璃涂棒。
三、基本原理
在微生物实验中,需要进行纯培养,不能有任何杂菌污染,因此必须对所用器材、培养基和工作场所进行灭菌和消毒。
灭菌是指杀死一定环境中的所有微生物,包括微生物的营养体、芽孢和孢子。
实验室常用的灭菌方法包括直接灼烧、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、煮沸灭菌等方法。
这些方法的基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质凝固变性,从而达到灭菌的目的。
四、操作步骤
高压蒸汽灭菌是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内,在一定的压力下保持15-30分钟进行灭菌。
此法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌,也可用于玻璃器皿的灭菌。
将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅夹套间的水沸腾而产生蒸汽。
待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中排尽,然后关闭排气阀,继续加热,此时由于蒸汽不能溢出,而增加了灭菌锅内的压力,从而使沸点增高,获得高于100℃的温度,导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在相同的温度下,湿热灭菌的效果好于干热灭菌。
有三点原因:1、在湿热灭菌中菌体吸收水分,蛋白质容易凝固变性,蛋白质随着含水量的增加,所需凝固温度降低;2、湿热灭菌中蒸汽的穿透力比干燥空气大;3、蒸汽在被灭菌物体表面凝结,释放出大量的汽化潜热,能迅速提高灭菌物体表面的温度,从而增加灭菌效力。
实验室常用的灭菌锅有非自控手提式高压蒸汽灭菌锅和自控式灭菌锅,其结构和工作原理是相同的。
本实验介绍的是半自控高压蒸汽灭菌锅,自控式灭菌锅的使用可参考厂家说明书。
具体操作步骤如下:
1、加水:首先将内层锅取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面没过加热蛇管,与三角搁架相平为宜。
切勿忘记检查水位,加水量过少,灭菌锅会发生烧干引起炸裂事故。
2、装料:放回内层锅,并装入待灭菌的物品。
注意不要装得太挤,以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。
装有培养基的容器放置时要防止液体溢出,三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触,以免冷凝水淋湿包扎的纸而透入棉塞。
3、加盖:将盖上与排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽内,摆正锅盖,对齐螺口,然后以对称方式同时旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气,并打开排气阀。
4、排气:打开电源加热灭菌锅,将水煮沸,使锅内的冷空气和水蒸汽一起从排气孔中排出。
一般认为当排出的气流很强并有嘘声时,表明锅内的空气已排尽,沸腾后约需3分钟。
5、升压:冷空气完全排尽后,关闭排气阀,继续加热,锅内压力开始上升。
6、保压:当压力表指针达到所需压力时,控制电源,开始计时并维持压力至所需的时间。
如本实验中采用0.1Mpa,121.5℃,20分钟灭菌。
注意:灭菌的主要因素是温度而不是压力,因此锅内的冷空气必须完全排尽后,才能关闭排气阀,维持所需压力。
7、降压:达到灭菌所需的时间后,切断电源,让灭菌锅温度自然下降,当压力表的压力降至“0”后,方可打开排气阀,排尽余下的蒸汽,旋松螺栓,打开锅盖,取出灭菌物品。
压力一定要降到“0”后,才能打开排气阀,开盖取物。
否则就会因锅内压力突然下降,使容器内的培养基或试剂由于内外压力不平衡而冲出容器口,造成瓶口被污染,甚至灼伤操作者。
8、无菌检查:将已灭菌的培养基放入37℃恒温培养箱培养24h,无杂菌生长后即可使用。