λ噬菌体载体的类型

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(四)质粒DNA的生物学特性
(1)寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制。 (2)稳定性：每种质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。 (3)同源性：不同质粒之间可能存在一定的同源区。 (4)重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质 粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与 染色体之间的重组。 (5)不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿 主细胞中。该不相容性的分子基础主要是由于它们在复制功能 之间的相互干扰造成的。
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载体的种类：
1. 克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆， 建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可； 2. 表达载体（ expression vector ）：能使目的基因在宿 主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要 有强启动子； 3. 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细 胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
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β-半乳糖苷酶筛选系统：
载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段，这一区 段编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿 主细胞所编码的β-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补(α互补)。故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码lacZ的质粒可同时 合成该酶的两种片段，该菌在其生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3吲哚-β-半乳糖苷)的培养基上生长，将形成蓝色茵落。将一连 串克隆位点克隆入β-半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源DNA插 入质粒的多克隆位点后可使β-半乳糖苷酶的氨基端片段灭活， 从而破坏了α-互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白 色菌落。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子从 空载体中筛选出来。
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(四)质粒DNA的生物学特性
(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性 的质粒带有一套与传递有关的基因。 (7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法 将其去除。 (8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质 合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋 白质合成的严格控制。 (9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的 抗性等。
第九章
基因工程载体及其选用
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载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能 的DNA大分子称之为载体（vector）。
作为一个理想的载体，应具备以下条件：
（1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制 子和启动子，使插入基因复制和表达； （ 2 ）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的， 这样可将多个外源DNA片段插入其中； （3）具有容易检测的筛选标记； （ 4 ）载体 DNA 的分子量适当，可容纳较大的外源 DNA 片段， 又可在受体细胞内扩增较多的拷贝； （ 5 ）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传 代而不易丢失。
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(五)质粒的命名原则
1976年提出一种质粒命名的原则，用小写字母p 代表质粒，在p字母后面用两个大写字母代表发 现这一质粒的作者或实验室名称。如pUC118, 字母p代表质粒，UC是构建该质粒的研究人员的 姓名，118代表构建的一系列质粒的编号。
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二、组建理想质粒载体必须具备的条件
(一)质粒拷贝数较高 质粒拷贝数是指生长在标准的培养基条件下， 每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
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(二)分子量较小
低分子量的质粒如下优点
•通常拷贝数较高 •克隆时所预期的基因表达产物的数量较大 •限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制 酶切点，便于制作酶切图谱。 •外源DNA容量较大， •容易转化，当质粒大于15kb时，将成为转化效率的制 约因素。 •遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。
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(三)带有可供选择的标记
常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨卞 青霉素抗性(Ampr)、卡那霉素抗性(Kanr)、四 环素抗性(Tetr)等，而且希望各抗性基因内有 若干单一的限制酶切点。 在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该 抗性基因失活、宿主菌变为对该抗生素敏感的 菌株，这样较易检查到克隆是否成功。
3பைடு நூலகம்
第一节
质 粒
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一、质粒的一般特性
(一) 质粒的分布、大小、数目 质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于 某些真核细胞（酵母的2μ环状质粒）。 质粒DNA分子量范围为1—200×106Da。 一个细胞内的质粒数量变化也很大，有1至几个 的，也有几十个的，甚至有数百个。这取决于质粒
的复制类型。如果质粒的复制是严紧型的，每个细胞只有1个至 几个质拉；如果质粒的复制是松弛型的，每个细胞中质粒有10200拷贝数。
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(二)质粒DNA的构型
三种不同的构型：
当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之 为共价闭合环形DNA(cccDNA)，这样的DNA通常呈现超 螺旋的SC构型； 如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结 构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环 DNA(ocDNA)。 若质粒DNA的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称 为L构型。
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单链切割
连接
线性DNA （L型） 开环DNA （oc型）
单链切割
连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
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(三)质粒DNA的理化性质
质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。
能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。
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根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复 制控制的质粒(stringent plasmid)；
松弛型
高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达 10-60份拷贝，这类质粒被称为“松弛型” 复制控制的质粒(relaxed plasmid)。