λ噬菌体载体的类型
λ噬菌体载体名词解释
λ噬菌体载体是一种广泛应用于分子生物学和基因工程领域的载体，用于将外源DNA序列引入细菌细胞中。
噬菌体是一种寄生性病毒，可以感染细菌并在其内部复制。
而λ噬菌体是其中最为常见和常用的一种。
λ噬菌体载体通常由数万个碱基对的环状DNA组成，其中包含了多个重要的功能区域。
其中，最重要的功能区域是Origins of Replication（ORI），即复制起始点，负责引导DNA的复制。
此外，载体还包含了选择性标记基因，如抗生素抗性基因，以便在细菌培养基中筛选带有该载体的细菌。
λ噬菌体载体还含有多个限制内切酶切位点，这些切位点可以用于将外源DNA序列插入到载体的特定位置上。
通过将外源DNA与载体进行限制性内切酶切割，然后使用DNA连接酶进行连接，可以将外源DNA序列插入到载体的DNA链上。
这一过程称为重组。
一旦重组完成，λ噬菌体载体可以通过转化的方式引入到宿主细菌中。
转化是指将外源DNA 导入到细菌细胞中的过程。
一旦载体进入到细菌细胞中，它会在细菌细胞内部复制，并产生大量的噬菌体颗粒。
这些噬菌体颗粒可以感染其他细菌细胞，并将携带的外源DNA序列传递给它们。
λ噬菌体载体在分子生物学和基因工程研究中具有广泛的应用。
它可以用于构建基因文库，即将外源DNA序列插入到载体上，并通过转化的方式导入到细菌细胞中。
这样，研究人员就可以通过筛选和分析细菌细胞中的载体来获得感兴趣的外源DNA序列。
此外，λ噬菌体载体还可以用于基因表达，即将外源DNA序列插入到载体的表达位点上，以便在细菌细胞中大量产生特定的蛋白质。
总之，λ噬菌体载体是一种在分子生物学和基因工程领域中被广泛使用的载体。
它具有多个重要的功能区域，可以用于将外源DNA序列引入到细菌细胞中，并在其中进行复制和表达。
通过利用λ噬菌体载体，研究人员可以进行基因库构建、基因表达和其他相关研究，为生物技术的发展提供了重要的工具和平台。
第一章1-6噬菌体载体2
3、λ噬菌体载体的优缺点：•优点：包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高。
•缺点：λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。
•用途：λ噬菌体载体比质粒载体能插入的DNA长得多，常用于构建cDNA文库或基因组文库。
第一章分子克隆的工具酶和载体•第八节噬菌体载体•一、λ噬菌体•（一）λ噬菌体•（二）λ噬菌体载体的改造•（三）λ噬菌体载体举例（三）λ噬菌体载体举例•Lambda gt10•Lambda gt11•EMBL3和EMBL4Lambda gt10概述：•Lambda gt10是一种插入载体。
•在噬菌体阻遏基因cI内有单一的EcoRⅠ克隆位点。
用于插入小的cDNA片段(约6kb)，构建cDNA文库或基因文库。
•该载体克隆效率很高。
•在构建cDNA文库时，利用Oligo(dT)或随机引物合成的cDNA经过EcoRⅠadaptors或Linkers修饰后，就可以和λgt10连接起来。
•克隆到λgt10的噬菌体，可用核酸探针进行筛选。
Lambda gt10map宿主：•建议用C600 and C600hf1作受体菌。
筛选：•如果有外源DNA插入，cI基因失活，该噬菌体进入裂解生长途径，在培养皿形成噬菌斑。
反之，若无插入，cI基因表达，噬菌体进入溶原生长途径，不形成噬菌斑。
•核酸探针杂交。
Insertional cloning•Insertional cloning into the cI gene of thelambda -gt10 cDNA cloning vector (DNA inserts of ~1-5 kb) can be selected in hfl (highfrequency of lysogeny ) mutant strains of E. coli. In hflA strains of E. coli, expression of the lambda cII gene is elevated, resulting in transcriptional induction of the lambda cI repressor gene which promotes lysogeny . Disruption of the lambda cI codingsequence by DNA insertion into the unique EcoRI site of the lambda gt10 cDNA cloningvector, blocks the lysogenic pathway leading to cell lysis and plaque formation.Lambda gt11•λgt 载体系列：是插入型载体。
大肠杆菌的λ-噬菌体
•功能区：裂解相关S和R，复制相关O和P
3、感染周期（溶菌循环）
•λDNA复制早期：一个ori ，双向复制 •晚期：滚环复制--多个λDNA分子形成线状多联体
尾巴上的微丝可以把噬菌 体的DNA注入细菌内。
噬菌体或病毒的DNA能被开发
成为基因工程的有用载体，因为：
1.高效率的感染性能使外源基
因高效导入受体细胞；
2.自主复制繁殖性能使外源基
因在受体细胞中高效扩增。
大肠杆菌的λ-噬菌体
（一） λ-噬菌体的生物学特性 1、由外壳包装蛋白和λ-DNA组成 2、 λ-DNA的物理图谱
必须携带标记基因
经改造后只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点,长度 为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入 片段最大为14kb.
取代型载体（substitution vector）
具有成对的克隆位点,空载的载体DNA只26kb，不能被包 装，无法进入受体细胞中去,不需要标记基因.
应用：
（1）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需 基因
（2）线状双链DNA，两端各有一个12bp的互补单链 （粘性末端，cohesive-end site），称λcos site ，粘性末端粘连接变成环状DNA。
λco基因大致分为3个区：
cI基因：编码阻遏蛋白，是感染了λ噬菌体的寄主细胞进 入溶源化的必要条件。cI基因失活或缺失的λ噬菌体无法 使寄主细胞发生溶源化效应。
DNA重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。
λ噬菌体DNA的整合与删除：
载体
基因工程的载体载体的特征：在寄主细胞中能够自主复制；有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点插入外源基因片段；在基因组中有遗传标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征；载体分子较小，以便体外基因操作；对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件；载体的类型⏹质粒⏹噬菌体⏹其他载体(如:酵母人工染色体、细菌人工染色体、植物Ti质粒、动物病毒)质粒(plasmid): 多数情况下,质粒是存在于细菌染色体外的小的双链闭合环状DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞⏹并不是所有的质粒都是环状分子, 在多种细菌中都发现有线性质粒⏹质粒广泛存在于原核生物中, 其大小从相对分子量小于1X106 到大于200X106质粒的形态1) cccDNA—双链闭合环状DNA2) ocDNA—开环DNA3) cDNA—线形DNA（L型）在DNA促旋酶（gyrase）作用下成负超螺旋构型, 在拓扑异构酶I的作用下解旋。
溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）也有解旋作用溴化乙锭插入DNA超螺旋的作用随着插入的溴化乙锭数目增加,双螺旋解旋,导致超螺旋减少直至产生环状分子的开放形式. 进一步的插入在双螺旋中引入了过多的螺旋,导致反义的超螺旋(注意B和D处的螺旋方向). 为了清楚起见,只表示了双螺旋的一条单链质粒DNA的复制类型⏹严紧型质粒这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。
所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝⏹松弛型质粒这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。
如较早的质粒pBR322即属于严紧型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数穿梭载体（shuttle vector) 可以在两种生物体内复制的载体分子质粒的命名规则⏹小写字母p表示质粒（plasmid)⏹p后面的两个大写字母表示发现或者构建该质粒的作者或者实验室名称⏹数字表示编号⏹例：pBR322、pET21、pGEM-T质粒的宿主范围⏹质粒只编码少数几个其自身复制所需要的蛋白质,甚至在许多情况下只编码其中一个蛋白质⏹所有其他复制所需的蛋白,包括DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶等都是由宿主细胞提供的⏹质粒所编码的复制蛋白质定位在ori 附近，因此只有ori 周围的一小部分区域是复制所必需的⏹因此，把质粒的其他部分删除掉，把外源序列加到质粒上，复制仍然可以继续进行⏹质粒的宿主范围是由它的ori 决定的质粒的不相容性⏹在没有选择压力的情况下，两种质粒不能共存于同一个宿主细胞内⏹如果质粒拥有相同的复制调控机制，它们就不相容显性质粒和隐蔽质粒⏹显性质粒(表达型质粒)----除了携带与本身复制和转移有关的基因外, 还携带一些其他的基因, 宿主细胞由于含有这样的质粒而呈现出新的性状, 这样的质粒称为显性质粒⏹隐蔽质粒----无异常性状表现出来克隆载体例：pBR322、pUC18、pUC19、pGEM-T表达载体例：pET-21、pGEX⏹质粒DNA的制备碱裂解法、煮沸法、层析柱过滤法碱裂解法原理：在高pH的碱性条件下，染色体DNA和蛋白质变性，质粒DNA由于其超螺旋共价闭合环状结构，尽管其DNA的大部分氢键也断裂，但是双链DNA仍然不会分离，当恢复到中性时，染色体DNA复性，并聚集形成不可溶的网架。
λ噬菌体载体大学生物学
重
性
组
λ噬菌体的裂解生长状态
裂解周期
λ噬菌体的溶原状态
野生型λ噬菌体的缺陷
野生型的λ噬菌体的基因组大而且复杂，不适于直接作 为基因克隆的载体。
lλ噬菌体基因组中含有基因克隆常用的限制性核酸内 切酶的多个识别位点
l由于λ噬菌体外壳只能接纳一定长度的DNA分子，要想 获得具有感染力的噬菌体颗粒，其DNA长度应控制在λDNA的75% ～105%的范围内，即野生型λ-DNA可装载的外 源DNA片段不大于2.5kb
l重组λ-DNA分子的筛选 较为方便，提取简便
谢谢
可以编码至少30个基因
黏性 末端
头 部 蛋 白
尾 部 蛋 白
整 合 、 重 组
调 控A 免合 疫成 性
DN 晚 期
调裂 控解
裂解生长非必要区
黏性 末端
λ噬菌体的结构示意图 在噬菌体颗粒内，基因组DNA呈现线性，其两端的 5′末端各带有12个碱基的互补单链（黏性末端）。
GGGCGGCGACCT
12bp的cos位点
λ噬菌体载体的主要类型
l取代型载体具有成对的克隆位点，在这两个位点 之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所置 换。
λ噬菌体载体的主要类型
以λEMBL3和 λEMBL4为代表。
EMBL3载体 左臂（20kb）
中间可替代区（14kb）右臂（9kb）
EMBL4载体 左臂（20kb）
SalⅠ BamHⅠ EcoRⅠ
EcoRⅠ BamHⅠ SalⅠ
中间可替代区（14kb）右臂（9kb）
EcoRⅠ BamHⅠ SalⅠ
SalⅠ BamHⅠ EcoRⅠ
λ噬菌体载体的优点
lλ-噬菌体载体在体外包装成噬菌体颗粒后，可以高 效转染大肠杆菌，感染宿主细胞的效率几乎可达 100%，而质粒DNA的转化率只有千分之一
分子生物学第十章
限制酶的发现
大肠杆菌的限制 — 修饰系统中，该系统由两种酶组成： 限制酶（分解和识别DNA的酶） 修饰酶（改变碱基结构，免遭限制酶分解）
甲基化修饰Am/Cm 两种酶作用于同一DNA的相同部位
（一）限制酶的命名
（1）以该菌株的属名的第一个字母及种名的头两个字母组 成三个斜体字母的略语表示 （2）同一种细菌若有不同菌株，则在属名种名后再加上株 名 （3）若一个菌株中有几种酶时，以罗马字加以区分 （4）同一属细菌种名头两个字母完全相同，其中一个菌的 酶可改用词头后的另一个字母来代替
• 一种质粒在一个细胞内存在的数目，称为质粒的拷贝数 • 质粒拷贝数由复制类型决定，并因此分为两类 1.严紧型质粒 复制与宿主染色体同步，拷贝数较少，1-3 个/细胞 2· 松弛型质粒 复制与宿主染色体不同步，可以单独复制，
拷贝数较多， 10-500个/细胞 • 在重组DNA技术中，为了提高目的DNA的扩增效率或目的基 因的表达效率，常采用松弛型质粒作为载体
个氨基酸
• ④多克隆位点，位于lacZ'编码区内 • ⑤大肠杆菌乳糖操纵子的调节基因lacI
pUC系列载体都是成对构建的。它们在结构上基本一致，只 是多克隆位点所含限制位点的排列顺序相反
2· 特点 和pBR322相比 • ①分子量更小，拷贝数更高，不用氯霉素处理就 可以在每个细胞内扩增500-700个拷贝 • ②所含的LacZ′适合于用α-互补和蓝白筛选技术
(二) pBR322载体
有两个抗药性基因，每 个抗性基因中均含有单克 隆位点，外源DNA插入后
使相应的抗性基因失活，
宿主细胞失去相应的抗药 性，不能在含相应抗生素 的培养基中生长，这一现 象称为插入失活。
质粒pBR322的抗性基因筛选示意图
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
λDNA+噬菌体载体
λDNAλDNA,就是λ噬菌体中的DNA，但是λDNA也分很多种情况的，有正常的，有突变的，还有整合了宿主染色体的。
λDNA是一种溶原性的染色体序列，可以整合到宿主的染色体组上，也可以脱离下来，他的整合和脱离所产生的失误可产生宿主的基因重组现象，所以可以用于局限转导，是一种基因转化的载体。
柯斯质粒载体目录一.柯斯质粒载体的来源二．柯斯质粒载体的特点三．柯斯克隆四．柯斯克隆的优点一.柯斯质粒载体的来源1978年由collins和hohn改建的一种新型大肠杆菌克隆载体，用正常的质粒与噬菌体λ的cos位点构成。
“cosmld”一词是由英文“cos site-carrying plasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点（cos）的质粒。
所谓柯斯质粒，乃是一类由人工构建的含有λ DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
诸如右图所示的柯斯质粒载体pHC79，就是由λ DNΑ片段和pBR322质粒DNA联合组成的。
一般长度4~6kb。
含有Amp和Tet选择标记基因。
其上的cos位点可识别噬菌体外壳蛋白。
凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度上相当于噬菌体的基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。
因此，插入柯斯质粒载体的外源DNA片段的长度可大于40kb，从而大大增加了载体的携带能力。
二．柯斯质粒载体的特点柯斯载体的特点大体上可归纳成如下四个方面：第一，具有λ噬菌体的特性。
柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。
第二，具有质粒载体的持性。
柯斯质粒载体具有质粒复制子，因此在寄主细胞内能够像质粒DNA一样进行复制，并且在氯霉素作用下，同样也会获得进一步的扩增。
此外，柯斯质粒载体通常也都具有抗菌素抗性基因，可供作重组体分子表型选择标记。
第三，具有高容量的克隆能力。
柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和COS位点等三个组成部分，其分子量较小，一般只有5～7kb左右。
λ噬菌体载体
λ噬菌体载体λ噬菌体，一种大肠杆菌双链RNA噬菌体。
是一种中等大小的温和噬菌体。
迄今已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为λ噬菌体的非必要的基因。
一．λ噬菌体的分子生物学概述（1）λ噬菌体基因组的结构在λ噬菌体线性双链 DNA分子的两端，各有一条由12个核劳酸组成的彼此完全互补的5′单链突出序列，即通常所说的粘性末端。
注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。
随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5′-P和3′-OH基团封闭起来，并进一步超盘旋化。
这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos 位点（略语cos，系英语cohesive-end site的缩写，即粘性末端位点之意）（如图）。
在环化的状态下，λ噬菌体DNA分子的长度为48 502碱基对。
（2）λ噬菌体DNA的复制在λ噬菌体感染的早期，环形的λ DNA分子按θ形式从双向进行复制。
到了感染的晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了，合成出了由一系列线性排列的人基因组oxA组成的长多连体分子。
（3）λ噬菌体DNA的整合与删除λ噬菌体基因组的整合作用，是通过它的附着位点att，同大肠杆菌染色体DNA的局部同源位点之间的重组反应实现的。
整合作用需要int基因的表达，它是一种可逆的过程。
的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。
λ噬菌体的删除，需要噬菌体xis基因和bio基因的协同作用才能实现。
（4）λ噬菌体DNA的转录与转译在溶菌周期，λ噬菌体DN A的转录是在三个时期，即早期、中期和晚期发生的。
大体的情况是，早期基因转录确立起溶菌周期；中期基因转录的结果导致DNA进行复制和重组；晚期基因的转录最终使DNA被包装为成熟的噬菌体颗粒。
λ噬菌体的综述
生命科学学院病毒生物学λ噬菌体综述摘要：噬菌体是一类温和噬菌体，它们感染大肠杆菌后能进行溶菌性生长(Lytic growth)和溶源性生长(Lysogenic growth)。
其溶源特性对基因重组与遗传工程研究有很大帮助。
本文就λ噬菌体的基因组结构、溶关键词：λ噬菌体溶原性溶菌性基因克隆引言：大肠杆菌噬菌体λ为长尾噬菌体科，是一类中等大小的大肠杆菌病毒，其基因组为双链线状DNA，由48502对碱基组成，分子量3.2×107 ，约50个基因，特点是相关基因成簇排列，形成若干个操纵子。
基因组两端为粘性末端，中间有相当长的DNA片段是裂解生长非必需的，这就为其作为外源基因的克隆载体提供了方便。
λ噬菌体由头和尾构成，其基因组组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。
感染时吸附位点为细胞壁。
属温和性感染；感染的DNA环化并整合于宿主基因组中。
以θ环双向复制，然后通过滚环机制单向复制。
用于感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。
1、The discovery of bacteriophage lambda1951年J. Lederberg的妻子Esther Lederberg第一个证明了 J. Lederberg和Tatum用来杂交的K-12中有原噬菌体，并命名为λ，经10年的研究搞清了溶原化的实质。
从此之后，λ噬菌体被广泛用于模式物种；1962年Esther Lederberg的同事并且还是她最好的朋友Allan Campbell首次发现了λDNA整合到细菌DN A的机制；之后由λ噬菌体改造后的载体广泛的用于基因工程。
2、The characteristics of bacteriophage lambda2.1、结构特点：λ为大肠杆菌温和性噬菌体，属长尾噬菌体科，头壳为直径约50nm的二十面体，其内包裹一长线状双链DNA分子（46500bp），因分子两端各有一含12个核苷酸的黏性末端，故又可黏合成环状分子。
三四章分子克隆载体---题目_完_
第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors）一、名词解析二、填空题1.基因工程中有三种主要类型的载体、和。
2.就克隆一个基因来说，最简单的质粒载体也必须包括三个部分和、。
另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子质量。
3.如果两个质粒不能稳定的存在已同一个宿主细胞中，则属于群，这是因为他们的所致。
4.pBR 322是一种改造型质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来源于，它的氨苄青霉素抗性基因来源于。
5.Puc18质粒是目前使用较为广泛的载体。
pUC系列的载体是通过和两种质粒改造而来。
它的复制子来源于，Amp抗性基因则是来源于。
6.当λ噬菌体DNA进入宿主细胞以后是靠宿主细胞的和形成封闭的环状的DNA分子的。
7.λ噬菌体是感染大肠杆菌的噬菌体。
8.α-互补是指 lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的阴性的突变体之间实现互补。
9.溶源化的频率和与有关。
10.噬菌体DNA通过其上唯一的整合位点与宿主染色体DNA上的唯一整合位点发生重组，从而整合到染色体中。
11.通过分析大量缺陷型λ噬菌体的 DNA ，发现 J 基因与 Cro 基因之间的 DNA 被或替换后，不影响λ噬菌体裂解生长。
12.对野生型大肠杆菌来说，向溶源和裂解方向的转变是由和决定的。
13.代表性λ噬菌体载体有和14.粘粒的组成包括________，________，________。
15.柯斯质粒(Cosmid)载体：一种由________和_______cos尾巴构建的复合载体。
16.pcos1 EMBL 是设计用于筛选体内重组的重组粘粒文库，通过同源重组过程达到筛选目标克隆的目的。
该载体的复制起点来源于__________质粒，含_________和_________抗性基因。
17.酵母人工染色体由酵母染色体的__________、__________和__________等功能性DNA序列组成。
λ噬菌体载体的类型
基因工程载体及其选用
1
载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能 的DNA大分子称之为载体（vector）。
作为一个理想的载体，应具备以下条件：
（1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制 子和启动子，使插入基因复制和表达； （ 2 ）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的， 这样可将多个外源DNA片段插入其中； （3）具有容易检测的筛选标记； （ 4 ）载体 DNA 的分子量适当，可容纳较大的外源 DNA 片段， 又可在受体细胞内扩增较多的拷贝； （ 5 ）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传 代而不易丢失。
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三、常用的质粒载体
(一)克隆载体 pSC101质粒载体是第一个成功用于克隆真核DNA 的大肠杆菌质粒载体。 pBR322是用人工方法构建的符合理想质粒载体 条件的好载体，一度曾得到广泛的应用。 下面着重介绍目前常用的克隆质粒载体pUC系列 和pGEM系列。
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质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
19
(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点
单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地 供带有不同末端的外源基因插入。目前常用载 体上的多克隆位点(MCS)即具有该功能。
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(五)具有复制起始点(origin, ori)
这是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，也是决定 质粒拷贝数的重要元件．可使繁殖后的细胞维持一定 数量的质粒拷贝数。 例如含ColE1或pMB1复制起始点的质粒即为松弛型质粒。 在一般情况下，一个质粒只含有一个复制起始点，构 成一个独立的复制子。穿梭质粒含有两个复制子，一 个是原核生物复制子、另一为真核生物复制子，以确 保其在两类细胞中均能得到扩增。
第五章 噬菌体载体和柯斯载体
本章主要内容
噬菌体一般特性 λ噬菌体 柯斯质粒 M13噬菌体 1、M13噬菌体特性及基因组结构 2、M13噬菌体载体类型及特点 噬菌粒
比较
第一节 噬菌体的一般生物学特性
（Bacteriophage，phage）
• 噬菌体可以在脱离寄主 细胞的状态下保持生命， 但一旦脱离了寄主细胞， 就不能生长和复制 • 利用寄主的核糖体、蛋 白质合成因子、氨基酸 和产能体系，进行生长 和繁殖
Charon 40
LA 19.2
短片段 重复替换区
MCS MCS
RA 9.6
•λNM781
在λNM781替换型载体中，可取代的EcoRⅠ片段， 编码有一个supE基因（大肠杆菌突变体tRNA基 因），这种λNM781噬菌体感染细胞后，寄主细 胞lacZ基因的琥珀突变被抑制，因此能在X-gal琼 脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。
2、替换型载体（取代型载体）
具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的 λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。 可以克隆较大分子量的外源DNA，克隆高等真核 生物DNA
（一）插入式载体
• λ噬菌体载体相对于质粒载体来活
的细菌 溶源化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之
形成溶源性细菌的过程
整合：噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞 染色体DNA中
原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或 非整合的噬菌体
超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一 次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。
2、溶源周期的主要特征
λ噬菌体和P1噬菌体 λ噬菌体的特征： (1) 噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 (2) 经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于
Charon 4A Lac 5
植物基因工程中的λ噬菌体载体
•右臂：长约10kb，控 制溶菌和溶原生长最重 要的调控基因和序列、 以及λDNA复制起始均 在这区域内。
➢ 基因组长约50kb ，至少包括61个基因，除少数例外，大多数编码基因均是按功能的相似 性成簇排列。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生 长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。 植物基因工程中的λ噬菌体载体
植物基因工程中的λ噬菌体载体
λ早使用的载体 系统，其主要优点是插入片段的装载容量大，适合于 全长的eDNA克隆，不仅质量高、代表性好，而且重组 噬菌体颗粒的感染活性在替换或插入某些标志基因，如上述的可 供蓝白筛选lacZ’序列和多克隆位点等。
• 建立重组λDNA分子的体外包装系统。
• 与一般的质粒载体不同, 噬菌体转染前需要利用噬菌体外 壳蛋白和噬菌体DNA加工酶组成的混合物(包装抽提物
• )在体外将连接好的DNA线性分子包装成噬菌体颗粒
植物基因工程中的λ噬菌体载体
植物基因工程中的λ噬菌 体载体
2020/11/20
植物基因工程中的λ噬菌体载体
载体（vector）是把一个有用的目的DNA片段通过重 组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工 具。 植物基因工程技术中尤为重要的是载体，不同目的 基因需要采用不同的载体。 组成植物基因工程载体系统常见的几种载体有：
右臂，填充片断的存在会影响连接效率， 必须纯化左臂和右臂。
植物基因工程中的λ噬菌体载体
（3）外源片断与载体的连接 • 通过载体的粘性末端，将载体连接成多联
体，以利于将两个cos位点之间的片断装入 噬菌体颗粒
植物基因工程中的λ噬菌体载体
（4）重组噬菌体的体外包装，形成有感染力 的噬菌体颗粒
噬菌体载体和柯斯载体
•λ 噬 菌 体 分 子 量 31×106dal，中等大 小的温和噬菌体，目 前已经定位61个基因， 其中一半参与了生命 周期，为必要基因； 余下的为非必要基因。
溶菌阶段(复制和释放)来自溶源阶段(整合寄主染色体)
一、λ噬菌体的分子生物学概述 λ phage
1、基因组结构 （1）cos位点 • 线性双链DNA分子两端各有一条12nt组成的 彼此完全互补的5’突出单链 • 注入宿主后，粘性末端互补形成双链区，成 为cos位点。
四、噬菌体的溶源生命周期
溶源生长周期：是指在感染过程中没有产 生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整 合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一 个组成部分。
现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源 周期
1、概念 温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进
入溶源生命周期。 溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组
有 些 噬 菌 体 的 DNA 碱 基 不 是 由 标 准 的 A/T/C/G组成的。 Example：
T4噬菌体DNA没有C碱基，取代的是5-羟甲基胞
嘧啶（HMC）；SP01噬菌体DNA中没有T碱基， 取代的是5-羟甲基尿嘧啶（HMU）。
二、噬菌体的感染性 噬菌斑形成
噬菌体
感染高浓度细菌
在未发生第一次裂解 前涂布平板
一、 噬菌体的结构和其核酸类型 结构：无尾部结构的二十面体型、
具尾部结构的二十面体型、 线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性DNA、
双链环形DNA、 单链环形DNA、 单链线形DNA、 单链RNA。
不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是 比较大的。大分子量的噬菌体生命周期比较 复杂；对寄主的依赖性较低
五、重组噬菌体的分离
载体2
在酵母细胞中常用的载体的共同特点
• 这些载体，它们共同的特点是：（1）能在大肠杆 菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样可使外 源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增； （2）含有在酵母中便于选择的遗传标记。这些标 记一般能和大肠杆菌相应的突变体互补，如 Leu2+、His+、Ura3+、Trpl+等。有些还携带用 于大肠杆菌的抗菌素抗性标记；（3）含有合适的 限制酶切位点，以便外源基因的插入。共有三种 类型的载体，如图3-19 。
插入型载体
• 在λimm434区有EcoRI单一酶切位点便于外源DNA 插入的称为插入型载体。 λ gt10（CI) λgt11(LacZ) • 若 CI插入外源基因 溶菌 透明噬斑 • 若 不插入外源基因 溶源 混浊斑 • 若LacZ插入基因 IPTG/X-gal平板有白斑 • 若LacZ无插入基因 IPTG/X-gal平板有蓝斑
附加体型载体（YEP）
• YEP型载体一般由大肠杆菌质粒、2µm质粒以及 酵母染色体的选择标记构成。2µm质粒含有自主 复制起始区（Ori）和STB区,STB序列能够使质粒 在供体细胞中维持稳定。利用2µm质粒，人们已 经构建出许多YEP型载体。YEP型载体PYF92 （如图3-21）就是由酵母的2µm质粒、pBR322质 粒和酵母的His3+(组氨酸)基因构成的。YEP型载 体对酵母具有很高的转化活性，一般为103-105转 化子/微克DNA。比YRP型载体更稳定，拷贝数也 高（25-100个/细胞），是基因克隆中的常用载体。
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（二）λ噬菌体的类型 插入型载体 替换型载体 ( 三 ) λ噬菌体载体的应用 1.转染作用 转染：由宿主细胞捕获噬菌体或病毒DNA的过程。 转导：以噬菌体为媒介转移遗传物质的过程。 转化：质粒等外源DNA引入细胞的过程。 2. λ DNA的体外包装
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根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复 制控制的质粒(stringent plasmid)；
松弛型
高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达 10-60份拷贝，这类质粒被称为“松弛型” 复制控制的质粒(relaxed plasmid)。
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单链切割
连接
线性DNA （L型） 开环DNA （oc型）
单链切割
连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
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(三)质粒DNA的理化性质
质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。
能溶于水，பைடு நூலகம்溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。
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β-半乳糖苷酶筛选系统：
载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段，这一区 段编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿 主细胞所编码的β-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补(α互补)。故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码lacZ的质粒可同时 合成该酶的两种片段，该菌在其生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3吲哚-β-半乳糖苷)的培养基上生长，将形成蓝色茵落。将一连 串克隆位点克隆入β-半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源DNA插 入质粒的多克隆位点后可使β-半乳糖苷酶的氨基端片段灭活， 从而破坏了α-互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白 色菌落。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子从 空载体中筛选出来。
的复制类型。如果质粒的复制是严紧型的，每个细胞只有1个至 几个质拉；如果质粒的复制是松弛型的，每个细胞中质粒有10200拷贝数。
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(二)质粒DNA的构型
三种不同的构型：
当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之 为共价闭合环形DNA(cccDNA)，这样的DNA通常呈现超 螺旋的SC构型； 如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结 构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环 DNA(ocDNA)。 若质粒DNA的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称 为L构型。
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(四)质粒DNA的生物学特性
(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性 的质粒带有一套与传递有关的基因。 (7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法 将其去除。 (8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质 合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋 白质合成的严格控制。 (9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的 抗性等。
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(三)带有可供选择的标记
常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨卞 青霉素抗性(Ampr)、卡那霉素抗性(Kanr)、四 环素抗性(Tetr)等，而且希望各抗性基因内有 若干单一的限制酶切点。 在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该 抗性基因失活、宿主菌变为对该抗生素敏感的 菌株，这样较易检查到克隆是否成功。
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(五)质粒的命名原则
1976年提出一种质粒命名的原则，用小写字母p 代表质粒，在p字母后面用两个大写字母代表发 现这一质粒的作者或实验室名称。如pUC118, 字母p代表质粒，UC是构建该质粒的研究人员的 姓名，118代表构建的一系列质粒的编号。
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二、组建理想质粒载体必须具备的条件
(一)质粒拷贝数较高 质粒拷贝数是指生长在标准的培养基条件下， 每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
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第一节
质 粒
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一、质粒的一般特性
(一) 质粒的分布、大小、数目 质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于 某些真核细胞（酵母的2μ环状质粒）。 质粒DNA分子量范围为1—200×106Da。 一个细胞内的质粒数量变化也很大，有1至几个 的，也有几十个的，甚至有数百个。这取决于质粒
第九章
基因工程载体及其选用
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载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能 的DNA大分子称之为载体（vector）。
作为一个理想的载体，应具备以下条件：
（1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制 子和启动子，使插入基因复制和表达； （ 2 ）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的， 这样可将多个外源DNA片段插入其中； （3）具有容易检测的筛选标记； （ 4 ）载体 DNA 的分子量适当，可容纳较大的外源 DNA 片段， 又可在受体细胞内扩增较多的拷贝； （ 5 ）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传 代而不易丢失。
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载体的种类：
1. 克隆载体（cloning vecto 表达载体（ expression vector ）：能使目的基因在宿 主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要 有强启动子； 3. 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细 胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
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(四)质粒DNA的生物学特性
(1)寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制。 (2)稳定性：每种质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。 (3)同源性：不同质粒之间可能存在一定的同源区。 (4)重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质 粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与 染色体之间的重组。 (5)不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿 主细胞中。该不相容性的分子基础主要是由于它们在复制功能 之间的相互干扰造成的。
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(二)分子量较小
低分子量的质粒如下优点
•通常拷贝数较高 •克隆时所预期的基因表达产物的数量较大 •限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制 酶切点，便于制作酶切图谱。 •外源DNA容量较大， •容易转化，当质粒大于15kb时，将成为转化效率的制 约因素。 •遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。