柠檬酸发酵过程说明
柠檬酸发酵的原理
柠檬酸发酵的原理柠檬酸是一种有机酸，化学式为C6H8O7。
它常见于柠檬、橙、柚子等柑橘类水果中，具有酸味和鲜味。
柠檬酸的发酵是指通过微生物在适宜环境条件下对柠檬酸底物进行代谢分解，产生新的化合物、气体或能量的过程。
柠檬酸发酵的过程可以分为两个阶段：引入柠檬酸菌和发酵反应。
首先，柠檬酸发酵的关键是引入柠檬酸菌。
柠檬酸菌是一类嗜酸性细菌，它们广泛存在于自然界中，常见于各种水果、土壤、植物等环境中。
这些细菌具有代谢柠檬酸的能力，并能分解柠檬酸为其他代谢产物。
在适宜的生长条件下，柠檬酸菌会在培养基中生长和繁殖。
柠檬酸菌需要一定的温度、pH值以及营养物质供应，如碳源、氮源、矿物盐等。
这些条件对于维持菌体生长和代谢活性都非常重要。
当柠檬酸菌引入培养基后，它们会开始与柠檬酸底物进行代谢，进而引发柠檬酸的发酵。
柠檬酸发酵可产生以下代谢产物。
首先，柠檬酸菌代谢柠檬酸的初始酶是柠檬酸酶，将柠檬酸分解为顺式-脱氢异柠檬酸。
柠檬酸酶存在于柠檬酸菌的细胞内。
随后，顺式-脱氢异柠檬酸经过酶促反应被还原为'顺式'脱氢酶异柠檬酸，再被脱氢酶反应转化为柠檬酸。
接下来，由于柠檬酸发酵过程中柠檬酸的分解和合成是相互竞争的，此时代谢产物多取决于柠檬酸菌生长条件的调节。
在有氧条件下（即有足够的氧气供应），柠檬酸将被完全代谢为二氧化碳和水，释放能量。
此时发酵的产物主要是气体，如二氧化碳。
这种情况下，柠檬酸发酵可以在其它微生物中应用。
然而，当在缺氧条件下进行柠檬酸发酵时（如在发酵罐中），由于氧气供应不足，柠檬酸菌会进一步代谢柠檬酸。
在此情况下，发酵的产物主要是有机酸，如乳酸、丙酸等。
这种发酵过程称为无氧呼吸。
结合柠檬酸菌自身特点和提供的环境条件，可以选择调控发酵过程中柠檬酸的转化路径，实现不同发酵产品的生产。
总结起来，柠檬酸发酵的原理是通过引入柠檬酸菌并在适宜条件下提供营养物质，利用柠檬酸菌的代谢能力，将柠檬酸转化为新的化合物。
柠檬酸发酵工艺
下补水接种。 • 严格无菌操作。
• 5.补水接种 • 避免淀粉回生，并且减少染菌几率。
• 6.装盘进室
• 曲醅疏松，不可压实，厚度6~7cm，高温 天气5cm左右
（五）发酵规程
• 1.薄层发酵法 • 品温30~35℃左右 • 发酵终点由酸度决定，48h后每12h测一次，
五、溶解氧的控制
产酸速率与溶氧分压成正比。 菌体生长中，有呼吸作用， 在对数生长期需氧量达到最高峰 进入产酸期后，氧的消耗降低 到一个较低的水平
溶解氧浓度的控制
• 2.置换法发酵
• 采用低糖而营养较丰富的培养液先培养菌 盖，菌盖形成后再更换发酵培养基一次或 数次。
• 培养液糖浓度50g/L，室温34~36℃、培养 液32~34 ℃，第二天室温32~34 ℃，一般 接种40h可形成紧实菌盖，排掉培养液，补 充发酵培养基（第一次置换），室温降至 30~32℃，发酵48~60h在排去发酵液，进 行第二次置换，以此循环。
• 优点：
• （1）发酵体系是均一的液体，传热传质良好，不 存在死区；
• （2）设备占地面积小，生产规模大；
• （3）发酵速率高，采用预培菌丝球接种只需 50~70h；
• (4)产算率高，产柠檬酸几乎接近理论产率，菌体 生成量少；
• （5）发酵设备密闭，杂菌污染可能性小，管理方 便；
• （6）完全机械化操作，并可以实现自动控制，劳 动强度低，劳动生产率高；
• （7）发酵副产物少，有利于产品提取，所得产品 质量高。
（一）黑曲霉柠檬酸深层发酵条件控制
一、营养要求
• 根据柠檬酸发酵机制，黑曲霉能够大量积累柠檬酸的条件， 提供高浓度的葡萄糖和充足的氧，对磷、锰、铁、锌等无机 盐物质处于低水平。
柠檬酸发酵机制
柠檬酸发酵机制柠檬酸生产分发酵和提取两部分。
发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。
固态发酵是以薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的农副产品为原料，配好培养基后，在常压下蒸煮，冷却至接种温度，接入种曲，装入曲盘，在一定温度和湿度条件下发酵。
采用固态发酵生产柠檬酸，设备简单，操作容易。
液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。
发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。
深层发酵生产柠檬酸的主体设备是发酵罐。
微生物在这个密闭容器内繁殖与发酵。
现多采用通用发酵罐。
它的主要部件包括罐体、搅拌器、冷却装置、空气分布装置、消泡器，轴封及其他附属装置。
发酵罐径高比例一般是1:2.5，应能承受一定的压力，并有良好的密封性。
除通用式发酵罐外，还可采用带升式发酵罐、塔式发酵罐和喷射自吸式发酵罐等。
为了得到产柠檬酸的优良菌种，通常是从不同地区采集的土壤或从腐烂的水果中分离筛选，然后通过物理和化学方法进行菌种选育。
例如薯干粉深层发酵柠檬酸的菌种就是通过不断变异和选育得到的。
菌种适合在高浓度下发酵，产酸水平较高。
柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温度、通风量及pH值等条件。
一般认为，黑曲霉适合在28～30℃时产酸。
温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。
微生物生成柠檬酸要求低pH，最适pH为2～4，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。
柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量。
通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。
随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。
采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60%饱和度对产酸有利。
柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下降。
柠檬酸发酵机理
通过调整发酵温度和pH值，找到最适 宜的发酵条件，以提高柠檬酸的产量 和降低能耗。
产物的分离与纯化技术改进
分离技术
采用新型的分离技术，如超滤、纳滤、反渗透等，实现柠檬酸的高效分离和纯 化，降低分离成本。
纯化技术
采用结晶、离子交换、吸附等纯化技术，进一步提高柠檬酸的纯度，满足不同 应用需求。
细菌
某些细菌如柠檬酸杆菌、 氧化杆菌等也可以进行柠 檬酸发酵。
微生物的代谢途径
葡萄糖代谢
微生物将葡萄糖通过糖酵解途径 转化为丙酮酸，这是柠檬酸发酵 的起始步骤。
丙酮酸代谢
丙酮酸在丙酮酸羧化酶的作用下 转化为草酰乙酸，再经过三羧酸 循环转化为柠檬酸。
乙酰CoA的合成
在柠檬酸发酵过程中，乙酰CoA 是重要的中间代谢产物，可以用 于合成脂肪酸等物质。
厌氧发酵
微生物在厌氧条件下，将葡萄糖或其他糖类转化 为丙酮酸，再经过一系列反应生成柠檬酸。
3
好氧发酵
微生物在好氧条件下，通过糖酵解途径将葡萄糖 转化为丙酮酸，再经过氧化脱羧等反应生成柠檬 酸。
柠檬酸发酵的分类
黑曲霉发酵
黑曲霉在好氧条件下进行发酵，通过糖酵解途径将葡萄糖转化为 丙酮酸，再经过氧化脱羧等反应生成柠檬酸。
产物提取与精制
过滤分离
将发酵液进行过滤，分 离出菌体和未消耗的原
料。
离子交换
利用离子交换剂吸附柠 檬酸离子，与其他离子 进行交换，实现柠檬酸
的分离。
浓缩结晶
将分离出的柠檬酸溶液 进行浓缩和冷却，促使
柠檬酸结晶析出。
干燥与包装
将结晶的柠檬酸进行干 燥和包装，得到符合标
准的柠檬酸产品。
05 柠檬酸发酵的优化与改进
柠檬酸发酵及产物提取
综合实验：柠檬酸发酵及产物提取（一）柠檬酸发酵一、实验原理柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羟生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。
但就柠檬酸产生菌而言，由于其乌头酸流水作业事酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式：2 C6H12O6 +3 O2→2 C6H8O7 +4 H2O国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。
二、实验器材（一）材料1．菌种：黑曲霉2．蔗糖、硫酸铵等（二）主要仪器设备1．旋转式摇床、超净工作台、15L发酵罐等三、操作步骤1．种子培养基制备：马铃薯培养基配方:(1000ml)马铃薯（去皮）200g葡萄糖（或蔗糖）20g琼脂15~25g水1000ml自然pH2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。
3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。
4．发酵培养基制备：蔗糖15%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁7水0.025%。
5. 上罐灭菌（操作同实验一）5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的5%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、500转条件下发酵4天。
6.分别在0,24,48,72,96小时测定一下参数。
四、实验结果1．对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。
2．测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。
3．计算柠檬酸发酵的转化率，即每100克葡萄糖经转化所能生成的柠檬酸克数，柠檬酸酵的理论转化率按下列反应计算应为106.7%。
柠檬酸发酵工艺
（1）凝聚
发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层
的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。
阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：
Al3+ >Fe3+ >H+ >Ca2+ >Mg2+ >K+ >Na+ >Li+
常用的凝聚剂电解质有：
硫酸铝 Al2(SO4)3•18H2O（明矾）； 氯化铝 AlCl3•6H2O; 三氯化铁 FeCl3; 硫酸亚铁 FeSO4· 7H2O ； 石灰；ZnSO4；MgCO3
存在一定的毒性（微毒），特别是阳离子型聚丙 烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。
医药和食品工业：聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），聚苯乙烯 类衍生物，无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、聚合铁盐等）， 天然有机高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨 胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等）。
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当然，聚丙烯酰胺在食物中的含量远远高于化妆品中的 含量，人体对于丙烯酰胺的摄入也多来自饮食。
（3）混凝
凝聚和絮凝统称为混凝。
对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型 高分子絮凝剂，同时具有降低胶粒双电层电位和产生 吸附桥架的双重机理
4.加入助滤剂
一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量 的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过 滤阻力。 常用的助滤剂有： 硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等， 最常用的是硅藻土（特点：质轻、多孔、高强、耐磨、绝缘、绝热、吸附、 稳定 ）。
絮凝——在胶体或悬浮体内加入极少量的可溶性高分子化合 物，使水或液体中悬浮微粒集聚变大，或形成絮团，从而加快 粒子的聚沉，达到固-液分离的目的。 凝聚——指在电解质作用下，胶体和分散系双电层压缩、ζ电 位破坏、电性中和而脱稳，并聚集为絮状颗粒的过程。 凝聚过程就是胶粒聚集成较大颗粒的过程。 聚沉——胶体的微粒在一定条件下发生聚集的现象。向胶体 中加入盐时，其中的阳离子或阴离子能中和分散质微粒所带的 电荷，从而使分散质聚集成较大的微粒，在重力作用下形成沉 淀析出。这种胶体形成沉淀析出的现象称为胶体的聚沉。
柠檬酸制备
柠檬酸制备
柠檬酸是一种重要的有机弱酸，广泛应用于食品、医药和化工等领域。
其制备过程主要包括以下几个步骤：
1. 原料准备：以薯干粉为主要原料，这是我国80%以上柠檬酸生产的基础原料。
2. 调制浆料：将薯干粉调制成浓度为18%～22%的浆料，以适合发酵过程的需要。
3. 灭菌发酵：将调制好的浆料送入已经经过蒸汽灭菌（0.2MPa，40～60分钟）的发酵罐中，进行黑曲霉深层发酵。
4. 中和处理：发酵结束后，使用碳酸钙对发酵液进行中和处理，以得到柠檬酸钙。
5. 酸解精制：通过硫酸酸解将柠檬酸钙转化为柠檬酸，然后进行精制，以去除杂质。
6. 浓缩结晶：将精制后的柠檬酸溶液进行浓缩，随后通过结晶过程得到柠檬酸晶体。
7. 干燥包装：最后将结晶出的柠檬酸进行干燥处理，并包装储存。
总的来说，整个制备过程需要严格控制各个环节的条件，以确保产品质量和生产效率。
柠檬酸作为一种无色晶体，无臭，易溶于水，其溶液显酸性。
在生物化学中，它是柠檬酸循环（三羧酸循环）的中间体，这一循环发生在所有需氧生物的新陈代谢中。
因此，柠檬酸不仅是工业上的重要化学品，也是生命科学中的关键物质。
柠檬酸发酵的原理及工艺流程
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柠檬酸 工艺流程图
柠檬酸工艺流程图柠檬酸是一种常见的酸味食品添加剂，也常用于制备柠檬饮料、调味料以及药物。
下面是柠檬酸的工艺流程图。
柠檬酸的制备主要有两种方法，一种是通过微生物发酵，另一种是通过化学合成。
在这里，我们将介绍微生物发酵方法。
1. 选材和预处理首先，我们需要选择适当的原料，通常是柠檬或其他柑橘类水果。
将柑橘类水果洗净、去皮、挤汁，得到柠檬汁。
2. 发酵液的配制将得到的柠檬汁加入培养基中，培养基中含有适当的碳源和氮源，以及其他必需的营养物质。
将培养基搅拌均匀。
3. 发酵罐的准备将培养基倒入发酵罐中，注意不要超过一定的液位。
发酵罐内通入适量的空气或氧气，保证微生物的正常生长和酸化反应。
4. 发酵过程添加发酵菌种，通常是柠檬酸菌或酵母菌，使其在一定的温度、pH和氧气条件下进行发酵。
发酵过程中，微生物会将柠檬汁中的糖分解为柠檬酸和二氧化碳。
5. 酸化反应发酵完成后，将发酵液倒入反应罐中，调整pH值为适当的范围。
然后，通过加热和搅拌，将反应温度提高到一定的范围，促使柠檬酸的析出。
6. 结晶和分离将发酵产生的柠檬酸溶液冷却，并持续搅拌，使得柠檬酸结晶出来。
通过离心或过滤，将结晶的柠檬酸与溶液分离。
7. 干燥和粉碎将分离得到的柠檬酸晶体放入干燥箱中，进行干燥，去除多余的水分。
然后，将干燥后的柠檬酸晶体粉碎，使其成为细小的颗粒。
8. 包装和质检最后，将粉碎好的柠檬酸颗粒装入包装袋中，并进行质量检查。
确保产品符合食品安全标准，并符合相关的质量指标。
这就是柠檬酸的工艺流程图。
通过适当的选材和预处理，发酵液的配制，发酵过程和酸化反应，接着进行结晶和分离，最后进行干燥和粉碎，得到最终的柠檬酸产品。
这一系列的工艺步骤确保了柠檬酸的高纯度和质量，可以广泛应用于食品和药物制备中。
代谢控制发酵-第六章 代谢控制发酵实例
(2) 选育渗漏缺陷型突变株 苯丙氨酸和酪氨酸双营养缺陷(或预苯酸缺陷)使得菌株生长
缓慢，因此可选育预苯酸渗漏缺陷型突变株 渗漏缺陷型是一种不完全营养缺陷型，它不会产生过量的末
端产物，因而可以避开反馈调节 但它又能合成微量的末端产物，用来进行生物合成 在培养这种突变体时，可不必在培养基中添加相应的物质，
弱化子
p 解除反馈调节，增强色氨酸合成途径代谢流(通) 解除色氨酸抑制作用：
(1) 选育色氨酸结构类似物(5-氟色氨酸、5-甲基色氨酸) 抗性突变株
变构，失活
酶
色氨酸
问题：诱变后存活的微生物 包括正向突变(想要的)、负 向突变(不想要的)，怎么把 正向突变的筛选出来？
5-氟色氨酸 5-甲基色氨酸
四、青霉素发酵
生物合成途径
四、青霉素发酵
代谢调节
碳分解代谢产物的影响
Ø 青霉素的生物合成受碳分解代谢产物阻遏，如ACV合成 酶，IPN合成酶，酰基转移酶就被阻遏
Ø 葡萄糖可以刺激菌体生长，使作为赖氨酸和青霉素合 成中间体的α-氨基己二酸转向合成赖氨酸，抑制青霉 素的合成
Ø 葡萄糖降低青霉素生物合成的速率和得率还由于葡萄 糖与6-APA之间形成复合物，从而减少了可用于合成青 霉素的中间产物。
Ø 选育单氟乙酸、三氟乙酸敏感突变株 抑制乌头酸梅和异柠檬酸脱氢酶活性。若菌体对药品 敏感，说明该突变株的乌头酸酶和异柠檬酸酶活力低或 含量少
Ø 选育强化CO2固定反应的突变株 氟丙酮酸敏感、天冬氨酸缺陷、羧化酶基因克隆
Ø 强化柠檬合成酶
一、柠檬酸发酵
发酵控制
Ø 控制Mn2+和NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制，使EMP 畅通无阻
柠檬酸的发酵生产与提取
一、柠檬酸发酵的生产
柠檬酸发酵生产分深层发酵法、固体发酵法和液体表面发 酵法。深层发酵法是柠檬酸发酵生产的主要方法。国内以 淀粉质粗原料为培养基，发酵产酸一般为 11%~13% ，最 高达 15%，发酵周期为50~70h。国外以淀粉水解糖为原 料，产酸达19%，发酵周期为5d以上。
二、深层发酵法生产柠檬酸工艺流程
三、发酵设备
柠檬酸深层发酵一般都采用不锈钢机械搅拌通气 发酵罐，容积大部分为100～200 m3，也有250～ 400m3，国外的发酵罐容积为400～600 m3。采 用二挡搅拌，为了减小对丝状菌丝的剪切作用， 多用箭叶式搅拌器。近年来国内大型柠檬酸发酵 罐采用喷环装置，它是在罐的底部安装一个气液 型喷射混合搅拌装置和环流反应器以增加气—液 混合并可减少一组以上搅拌叶，能明显起到省电 节能的作用。
四、钙离子交ห้องสมุดไป่ตู้提取柠檬酸工艺流程
Thank you
柠檬酸发酵的原理
柠檬酸发酵的原理
柠檬酸发酵是一种微生物发酵过程，利用某些特定菌种的代谢途径，将特定底物转化为柠檬酸。
该过程的原理涉及以下几个方面：
1. 底物选择：柠檬酸发酵的底物通常选择糖类物质，如蔗糖、葡萄糖等。
这些底物能够被发酵菌种代谢利用，产生有机酸。
2. 菌种选择：柠檬酸发酵常用的菌种是柠檬酸杆菌（Aspergillus niger）和柠檬酸假单胞菌（Yarrowia lipolytica）等。
这些菌种具有良好的柠檬酸合成能力。
3. 代谢途径：柠檬酸发酵的代谢途径主要包括三个关键步骤：
- 糖类底物酵解：底物被菌种内的酵解酶作用下分解为各种代谢物，如丙酮酸和乳酸等。
- 柠檬酸产生：丙酮酸在菌种内经过一系列酶催化反应，被转化为柠檬酸。
柠檬酸亦可通过川崎循环途径合成。
- 转运和排泄：合成的柠檬酸会通过菌体内部的膜通道或转运蛋白被转运至菌体外，最终被释放出来。
4. 发酵条件：柠檬酸发酵的条件包括温度、pH值、底物浓度和氧气供应等。
适宜的发酵条件能够提高菌种的活性和产酸效率。
综上所述，柠檬酸发酵利用特定菌种的代谢途径，将糖类底物转化为柠檬酸。
这一过程涉及底物的酵解、柠檬酸的合成以及其转运和排泄等关键步骤。
发酵条件的调控对于柠檬酸发酵过程的效果具有重要影响。
柠檬酸的生产工艺
柠檬酸的生产工艺柠檬酸是一种广泛应用于食品、饮料、化妆品等领域的有机酸，具有酸味和清香的特点。
以下是柠檬酸的生产工艺的简要介绍。
柠檬酸的主要生产工艺包括传统工艺和现代工艺两种。
传统工艺:传统工艺主要以柠檬或柠檬皮为原料进行发酵生产。
具体工艺流程如下：1. 预处理: 将柠檬或柠檬皮去皮、去籽，然后切碎或研磨成泥状。
2. 发酵: 将柠檬泥放入发酵罐中，加入一定比例的细砂糖和水，并加入适量的发酵剂，如酵母、酒石酸盐等，进行发酵。
发酵温度一般控制在30-35摄氏度，发酵时间约为2-3天。
3. 分离: 发酵后的混合物经过滤去除固体残渣，得到柠檬酸浸提液。
4. 浓缩: 柠檬酸浸提液经过真空蒸发或浓缩器浓缩，使其浓度达到一定程度。
5. 结晶: 浓缩液经过冷却结晶或结晶沉淀等方式，获得柠檬酸晶体。
6. 过滤: 将柠檬酸晶体进行过滤、洗涤和干燥，得到纯净的柠檬酸成品。
现代工艺:现代柠檬酸生产工艺主要采用微生物发酵生产。
具体工艺流程如下：1. 选种培养: 选用高产柠檬酸的微生物，如亚洲真菌、微生物菌株等进行培养和选种。
2. 培养基制备: 通过混合培养基原料，如糖、酵母粉、蛋白胨、盐等，制备培养基。
3. 发酵: 将选好的微生物种子培养液接入发酵罐中，加入培养基和适量的营养物质，如氮源、磷源、微量元素等，进行发酵。
发酵温度和时间一般根据菌株的要求进行控制。
4. 分离: 将发酵液经过滤或离心分离，得到柠檬酸发酵液。
5. 浓缩: 将发酵液经过真空蒸发或浓缩器浓缩，使其浓度达到一定程度。
6. 结晶: 浓缩液经过冷却结晶或结晶沉淀等方式，获得柠檬酸晶体。
7. 过滤: 将柠檬酸晶体进行过滤、洗涤和干燥，得到纯净的柠檬酸成品。
以上是柠檬酸生产的主要工艺流程，不同生产厂家可能会有一些细微的差异和改进。
现代工艺相对于传统工艺而言更加高效、可控性更强，并且可以实现大规模连续生产，提高了生产效率和产品质量。
实验三 柠檬酸发酵实验附录
图1 柠檬酸生物合成途径1. 柠檬酸鉴别1．取少量试样，用直火炽灼，即缓慢分解，但不发生焦糖臭。
2．试样溶液用4.3％氢氧化钠溶液调至中性，加硫酸汞溶液加热至沸。
再加1滴0.1N高锰酸钾溶液，振摇，紫色即消退，并产生白色沉淀。
3．试样溶液用4.3％氢氧化钠溶液调至中性，加过量的7.5％氯化钙溶液，冷时无变化，煮沸，即发生白色颗粒状沉淀。
在一部分中加4.3％氢氧化钠溶液，沉淀不溶解，另一部分中加24％盐酸，则溶解。
4．试样溶液用4.3％氢氧化钠溶液调至中性，加过量的0.1N硝酸银溶液，即发生白色沉淀。
白色沉淀能在硝酸或40％氨溶液中溶解。
取氨溶液于试管中，在水浴上加热至60～70℃，管壁不显银镜。
2. 柠檬酸含量测定1、NaOH标准溶液的标定NaOH易吸收水分及空气中的二氧化碳，因此，不能用直接法配制标准溶液。
需要先配成近似的浓度的溶液再标定，标定使用邻苯二甲酸氢钾为基准物进行标定。
以酚酞为指示剂，当滴定终点呈浅红色，半分钟内不退色，反应如下：KHC8H4O4+NaOH=KNaC8H4O4+ H2O2、柠檬酸的测定原理：根据酸碱中和原理，用碱标准溶液滴定试样液中的酸时，以酚酞为指示剂。
当滴定至终点溶液呈浅红色，且30s不褪色时，根据滴定时消耗的标准NaOH溶液的体积，可算出试样中的总酸度。
其反应式为：HOOCCH2C(OH)(COOH)CH2COOH+3NaOH———NaOOCCH2C(OH)(COONa)CH2COONa+3H2 O三、实验用品榨汁机、小刀、碱式滴定管、试剂瓶、锥形瓶、移液管、量筒/烧杯、容量瓶、胶头滴管、洗耳球、洗瓶、水浴锅、铁架台、电子天平、玻璃棒、滤纸、0.1000mol/LNaOH溶液、邻苯二甲酸氢钾、酚酞指示剂、柠檬式样、蒸馏水、四、实验步骤1、0.1000mol/LNaOH标准溶液的配制和标定（1）称取固体NaOH约2.0 g放置在烧杯中，先加入100 mL蒸馏水将其溶解，再转移至试剂瓶中加水稀释至500ml，混匀，待标定。
《柠檬酸发酵机制》课件
厌氧条件
微好氧条件
在微好氧条件下，微生物通过好氧糖 酵解途径将葡萄糖转化为丙酮酸，再 经过一系列生物化学反应生成柠檬酸 。
在厌氧条件下，微生物通过糖酵解途 径将葡萄糖转化为丙酮酸，再经过一 系列生物化学反应生成柠檬酸。
柠檬酸发酵的原理
01
糖酵解途径
在厌氧条件下，微生物通过糖酵解途径将葡萄糖转化为丙酮酸的过程。
医药行业
用于生产抗生素、解热镇痛药等。
其他领域
如环保、化妆品等。
柠檬酸发酵的发展趋势
高效发酵技术
环保生产
通过优化发酵工艺和提高菌种性能，提高 柠檬酸产率。
减少柠檬酸生产过程中的环境污染，实现 绿色生产。
生物工程技术的应用
市场需求变化
利用基因工程和代谢工程手段，改良菌种 性能，提高发酵效率。
随着人们对健康和环保意识的提高，对天 然、健康的食品添加剂需求增加，柠檬酸 作为天然食品添加剂的市场前景广阔。
实验操作步骤与注意事项
菌种接种与培养
按照规定的操作步骤，将菌种接种到培 养基中，控制好温度、湿度、pH等培 养条件。
取样与检测
在发酵过程中按规定时间间隔取样， 检测柠檬酸含量等指标，记录数据。
发酵罐操作
启动发酵罐，控制好罐内压力、温度 、溶氧等参数，确保发酵过程顺利进 行。
异常情况处理
如发现异常情况，如菌种退化、发酵 异常等，应及时采取措施处理，并记 录实验过程。
营养物质的消耗
随着菌体生长和产物生成，发 酵液中的营养物质如葡萄糖逐 渐被消耗。
代谢产物的积累
在适宜的条件下，柠檬酸等代 谢产物在发酵液中积累。
发酵过程控制的方法和策略
温度控制
保持适宜的发酵温度，有利于菌体生 长和产物生成。
实验七_黑曲霉发酵柠檬酸
实验步骤
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ种获得
孢子悬液制备
取约5mL无菌水至黑曲霉平板上，用灭菌 滴管轻轻刮下孢子，振荡数下制成孢子悬 液。
液体深层发酵
取约4mL孢子悬液接种于玉米粉摇瓶发酵 培养基中。在转速为200rpm旋转摇床上， 30℃培养5～6天。
牛肉膏蛋白胨培养基
（1.5L，分装10只
250mL三角瓶） 牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g,琼脂15g， 水1000mL, pH7.4～7.6。制法：溶解分装后 121℃灭菌20min。
改良CHALMERS培养基（1.5L，分装10只
250mL三角瓶） 大豆蛋白胨5g，牛肉浸膏5g，酵母浸膏5g ，葡萄糖10g，乳糖20g，碳酸钙10g，琼脂 15g，水1000mL， pH7.4～7.6 ，1%中性红 溶液5mL。制法：溶解分装后121℃灭菌 20min。
灭菌自来水
（20mL，于50mL三角瓶） 每组2瓶，其中一瓶放置数颗玻璃珠 （每组1套） 小包装1.5mL离心管、蓝色黄色枪头若干， 培养皿每组1包（每包不少于6个）
实验七 黑曲霉发酵生 产柠檬酸
实验目的
了解产物发酵生产的机理；
柠檬酸发酵的发酵条件
掌握发酵过程步骤
柠檬酸的发酵的过程
80%的糖代谢走EMP途径
黑曲霉中存在TCA的酶系
柠檬酸发酵的条件
1、合适的碳源（淀粉、麦芽糖、甘露糖等），高浓度的糖； 2、限制有机氮源、选择适量的无机氮源（铵盐）； 孢子培养基 ：要求能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，所以 营养不要太丰富； 发酵培养基 ：既要使菌体能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要
使长好的菌体能迅速合成所需产物 ；
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思考题
1.柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点， 如何控制？
2.说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。 3.简述二氧化碳固定反应对提高柠檬酸产 率的意义。
（五）柠檬酸发酵的产率
1、无CO2固定反应的产率 合成1分子柠檬酸需要3分 子乙酰辅酶A，也就是需要 1.5分子的葡萄糖。 理论产率为： 192 /( 180×1.5) = 71.1%
2、通过 CO2固定反应提供C4二羧酸
四、柠檬酸发酵过程的控制要点
（1）控制Mn2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的
（四）乙醛酸循环与醋酸发酵柠檬酸
乙醇乙酸
3醋酸 1柠檬酸 生成的柠檬酸一半转化为 异柠檬酸 酵母N源耗尽后开始烷烃 发酵，低浓度AMP抑制 NAD-异柠檬酸脱氢酶的 活性，柠檬酸大量合成并 积累。此时顺乌头酸水合 酶催化反应平衡为：柠檬 酸：异柠檬酸：顺乌头酸 = 90：7：3。细胞质中积 累大量异柠檬酸。
存在问题：出口量增长过快，技术创新相对滞后，加 上国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设 备利用率不到60%，行业经济效益呈滑坡态势。
第二节 柠檬酸合成途径与代谢调控
一、柠檬酸合成途径的发现
1940年，Krebs: TCA；
1953年，Jagnnathan证实黑曲霉中存在EMP途 径所有酶；
(三)氧对柠檬酸积累的调节
乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一 个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它 对柠檬酸发酵的作用为： (1)氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。 (2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链 以外，还有一条侧系呼吸链。
当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧 系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。
二、柠檬酸及其盐的应用概况
食品工业：酸味剂、增溶剂、抗氧化剂，除腥脱 臭剂； 医药工业：
化学工业： 美容品、化妆品
三、我国柠檬酸生产现状 生产状况： 60年代开始，生产柠檬酸年总产量居世界
第一，出口量一直占国内总产量的50%以上。目前，生产 厂家近百家，万吨级以上的有6家。主要有安徽丰原生物 化学集团公司（生产能力为12.0万吨/年）、江苏无锡罗氏 中亚柠檬酸有限公司（生产能力为4.0万吨/年）、安徽华 源生物药业有限公司（生产能力为3.5万吨/年）等。
3、α-酮戊二酸脱氢酶的调节 在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特 点是，α-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻 遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内 不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。 α-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不 可逆反应，一旦α-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起： ①TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸 逆TCA循环生成，使TCA循环成“马蹄形”。②α-酮戊 二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。
小结：
①Mn2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4+↑，有一条呼吸活动强的不产生 ATP的侧呼吸链：解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径畅通。 ②丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成 乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节， 增强了合成柠檬酸的能力。 ③顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡： 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。 ④随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱 氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。
第四章 柠檬酸发酵机制
重点：柠檬酸生物合成途径；柠檬酸生物 合成的代谢调节机制。 难点：柠檬酸生物合成的代谢调节机制。
第一节 概述
一、柠檬酸简介
柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是 生物体主要代谢产物之一。化学名称2-羟基丙三 羧酸，英文文献俗名citric acid，分子式C6H8O7。 无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙 醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。
1954年，Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢； 1954-1955年，Ramakrishman等发现黑曲霉中 存在TCA循环。
二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径
黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡 萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化 脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙 酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。
抑制，使EMP畅通无阻。 （2） 控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。
（3）控制培养基中的Fe2+ 的浓度，使顺乌头酸水
合酶ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ活。
五、柠檬酸产生菌育种的传统方法：
1. 透明圈大的菌株 平板：10%甘薯 + 2 %的琼脂 + 0.5% CaCO3 诱变后，涂布，透明圈大的则好 2. 显色圈大小 平板：麦汁培养基 + pH值指示剂 诱变后，33℃培养3天，透明圈大的则好。
3. 不分解柠檬酸的菌株 不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其TCA循环中柠檬 酸后续酶的活性较低，或者丧失，这有利于积累柠檬酸。 方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变株。 4. 选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株 在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使 TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成。 （为何？中间产物少，C架少，不利于合成代谢……）
三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制
（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节
1、磷酸果糖激酶（PFK）：
Mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响
Mn2+ 缺乏为何会使NH4+浓度升高呢？ 当培养基中Mn2+ 缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸 （GA、GLu、Arg、Oin等），这些氨基酸的积累，意味着 体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受 到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。
(1)生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者 EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1 (2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在 以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环 被阻断或减弱。
(3)由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由 丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。 即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用 下固定化CO2生成草酰乙酸为主。
2、丙酮酸羧化酶：催化生成草酰乙酸。
3、丙酮酸脱氢酶：催化生成乙酰CoA
（二）三羧酸循环的调节
1、柠檬酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是TCA循环第一个 酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。 2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节： 顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸 正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线 粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡： 柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸＝90:3:7。 顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬 酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/L， 铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵 中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的。