_柠檬酸发酵工艺
柠檬酸发酵工艺
下补水接种。 • 严格无菌操作。
• 5.补水接种 • 避免淀粉回生，并且减少染菌几率。
• 6.装盘进室
• 曲醅疏松，不可压实，厚度6~7cm，高温 天气5cm左右
（五）发酵规程
• 1.薄层发酵法 • 品温30~35℃左右 • 发酵终点由酸度决定，48h后每12h测一次，
五、溶解氧的控制
产酸速率与溶氧分压成正比。 菌体生长中，有呼吸作用， 在对数生长期需氧量达到最高峰 进入产酸期后，氧的消耗降低 到一个较低的水平
溶解氧浓度的控制
• 2.置换法发酵
• 采用低糖而营养较丰富的培养液先培养菌 盖，菌盖形成后再更换发酵培养基一次或 数次。
• 培养液糖浓度50g/L，室温34~36℃、培养 液32~34 ℃，第二天室温32~34 ℃，一般 接种40h可形成紧实菌盖，排掉培养液，补 充发酵培养基（第一次置换），室温降至 30~32℃，发酵48~60h在排去发酵液，进 行第二次置换，以此循环。
• 优点：
• （1）发酵体系是均一的液体，传热传质良好，不 存在死区；
• （2）设备占地面积小，生产规模大；
• （3）发酵速率高，采用预培菌丝球接种只需 50~70h；
• (4)产算率高，产柠檬酸几乎接近理论产率，菌体 生成量少；
• （5）发酵设备密闭，杂菌污染可能性小，管理方 便；
• （6）完全机械化操作，并可以实现自动控制，劳 动强度低，劳动生产率高；
• （7）发酵副产物少，有利于产品提取，所得产品 质量高。
（一）黑曲霉柠檬酸深层发酵条件控制
一、营养要求
• 根据柠檬酸发酵机制，黑曲霉能够大量积累柠檬酸的条件， 提供高浓度的葡萄糖和充足的氧，对磷、锰、铁、锌等无机 盐物质处于低水平。
柠檬酸发酵工艺
（二）酶法液化淀粉的方法
➢ 按工艺条件分类：间歇液化法、半连续 液化法 、连续液化法 ；
➢ 按设备条件分：罐式、管式、喷射式；
➢ 按加酶方式分：一次、二次、三次加酶 多段液化工艺。
间歇液化法
➢ 又称为直接升温液化法。此法最为简 单，但是液化效果最差。
易
化后的糖化液过滤性
差，糖浓度低
淀粉乳浓度30%，pH 1.8~2.0，液化温度90℃。 30~60min液化DE值 15~18%
淀粉乳浓度30%，pH6.5， 液化温度95~140℃，10~ 120min液化DE值15~17%
设备要求低，操作容 料液容易溅出，操作
易，效果比直接升温 安全性差，蒸汽用量
❖ 因此淀粉质的柠檬酸发酵培养基在灭 菌前必须先进行液化，使料液的流动 性好，有利于料液的输送、灭菌完全 、发酵初期的生长、易于糖化、提高 产酸率和淀粉的利用率。发酵成熟醪 过滤性好、也有利于发酵罐搅拌功率 的下降。
❖ α-淀粉酶是一种金属酶，Ca2+使α-淀粉 酶保持适当的构象，从而维持其最大 的活性和稳定性．除Ca2+外，其它二 价碱金属离子Ba2+、Mg2+等也有维持 α-淀粉酶活性的作用．
好
大，液化温度未达到
液化效果好，液化液 高温酶的最适温度，
清亮、透明，质量好，液化效果一般，糖化
葡萄糖的收率高
液过滤性能差
旋转蒸汽加热器，喷 液化液较有利于糖化 工艺过程有待于进一 射温度大于160℃， 酶结合，糖化后的糖 步完善 糊精的聚合度200 化液DE值可达99%，
二、糖蜜原料的预处理
6. 柠檬酸发酵
2.柠檬酸生物合成途径
柠檬酸位于三 羧酸循环的起 始点，几乎所 有微生物都能 合成柠檬酸。
柠檬酸
3.柠檬酸产生菌
菌 种
假单胞菌 节杆菌 棒杆菌 短杆菌 诺卡氏菌 放线菌
柠檬酸
4.柠檬酸发酵生产菌
我国选育柠檬酸高产菌株
字佐米曲霉N558(产酸6％-7％)； 黑曲霉r144(产酸9％)； D353(产酸9％-10％)； N05016(产酸14％-17％)；
米曲霉 黑曲霉
5. 柠檬酸生物合成途径
l 在正常生长情况下．柠 檬酸在细胞内不会积累。 因为柠檬酸不是代谢途 径的终产物，而且是黑 曲霉的良好碳源.
l 柠檬酸积累是菌体代谢 失调的结果。
柠檬酸
柠檬酸积累
二、柠檬酸发酵工艺
l 柠檬酸发酵工艺的发展分为三个阶段：
1.表面发酵； 2.深层发酵； 3.固体发酵工艺。
课程名称:生物工艺学
1
柠檬酸发酵机理
2
柠檬酸培养工艺方法
一、柠檬酸发酵机理
1.柠檬酸简介
l 早期，柠檬酸主要从柑橘、菠 萝和柠檬等水果中提取。
l 1893年，wehmer发现青霉可以 生成柠檬酸。
l 19l7年Currie使用黑霉菌的浅 盘发酵生产柠檬酸，为柠檬酸 的发酵奠定基础。
黑曲霉
浅盘发酵
1.表面发酵
2.深层发酵
3.固体发酵
1.表面发酵工艺
l 发酵室为不锈钢金属制大型发酵 盘，具有保温、保湿。
l 原料：糖蜜原料。
l 发酵条件：采用间歇培养；孢子 需1-2天发芽，30℃，发酵6-8d， pH降至2。
l 生产力：柠檬酸0.2-0.4kg/m3.h
糖蜜原料 发酵控制室
2.固体发酵法
柠檬酸液态发酵及提取工艺
柠檬酸液态发酵及提取工艺综述摘要:发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。
液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。
发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。
国内目前有很多人研究了MgCl2、普鲁兰酶、植酸钠、磷浓度、菌种、木薯原料、纤维素糖化液、玉米粉淀粉混合原料、接种量和碳氮比、溶解氧、发酵罐搅拌系统、尿素、乙醇等添加剂、初始含糖量、温度、pH、发酵时间等等对黑曲霉发酵产酸的影响，从而改良提取工艺。
关键词：柠檬酸液态发酵提取工艺一、前言柠檬酸(citric acid）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸(2-hydroxytricarboxylic acid)或2-羟基丙烷-l，2，3-三羧酸(2-hydroxy propane-1，2，3-triearboxylic acid)是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。
分子式：C6H8O7（相对分子质量：192.13），无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。
极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大；从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质，加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。
柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。
柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。
另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。
它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。
柠檬酸酒精等的发酵生产
19
1. 淀粉质和纤维质原料的水解
淀粉的糊化、液化
淀粉在水中经加热会吸收一部分水而 发生溶胀。如果继续加热至一定温度（ 一般60～80℃）,淀粉粒即发生破裂,造 成黏度迅速增大,体积也随之迅速变大, 这种现象称为淀粉的糊化
1. 淀粉质和纤维质原料的水解
不同种类淀粉糊化温度有所不同, 苷薯、马铃薯、玉米和小麦淀粉的 糊 化 温 度 分 别 为 70 ～ 76℃ 、 59 ～ 67℃ 、 64 ～ 72℃ 和 65 ～ 68℃ 。 发 生 糊化现象称为淀粉的溶解，或称为 液化。马铃薯、小麦和玉米支链淀 粉 完 全 液 化 的 温 度 为 132℃ 、 70 ～ 80℃、136～141℃和146～151℃。
24
淀粉质原料酒精生产工艺流程
•
大米 曲霉菌 麸皮 淀粉质原料
酵母
•
↓
↓
米曲霉→米曲
固体试管酵母
•
↓
↓
•
米曲汁→试管培养→三角瓶培养 粉碎
三角瓶液体酵母
•
↓
↓
ห้องสมุดไป่ตู้
↓
•
曲种
蒸煮
卡式罐酒母
•
↓
↓
↓
•
糖化曲液 糖化→酒母糖化醪→小酒母
•
↓
↓
•
发酵
大酒母
•
↓
•
蒸馏
•
↓
•
•
酒糟废液 酒精 杂醇油
米曲汁
25
淀粉颗粒→淀粉分子→可发酵性糖→酒精→95％乙醇 (C6H10O5)n+nH2O→nC6H12O6→2nC2H6O+2nCO2+2nATP
现在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌”（大肠杆菌） 高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的先锋霉素（头孢菌 素类）、氨苄青霉素，就是这类半合成抗生素类药物。
柠檬酸发酵的原理及工艺流程
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以小麦粉为原料发酵生产柠檬酸工艺
以小麦粉为原料发酵生产柠檬酸工艺柠檬酸是一种广泛应用于食品、饮料、药品等领域的有机酸，其应用范围广泛。
小麦粉作为一种重要的食品原料，也可以用来发酵生产柠檬酸。
下面我就以小麦粉为原料发酵生产柠檬酸工艺为话题，简要介绍一下该工艺流程以及其优点。
一、工艺流程：小麦粉作为原料，经过以下几个步骤进行发酵生产柠檬酸：1.酵母制备：将活性酵母与酸化细菌共同培养，以制备出酵母菌株。
2.发酵工艺：将小麦粉和相应的食品添加剂混合均匀，加入适量的水制成面团，水分含量控制在60%左右，面团中加入pH调节剂，将其置于发酵罐内发酵。
在适宜的温度和湿度条件下，酵母菌株与面团中的糖分发生反应，形成乳酸、乙酸以及柠檬酸等物质。
3.滤清工艺：将面团在经过发酵后，依据质量的高低、不同的PH值度比例进行筛选。
4.提纯工艺：将小麦粉中未溶化的部分进行沉淀，获取清洁透明的柠檬酸，通过调节pH值和温度将柠檬酸晶化提取。
二、工艺优点：1.以小麦粉为原料发酵生产柠檬酸工艺省去了传统工艺中对柠檬的采集、提取工序，降低了柠檬酸的成本。
2.发酵生产柠檬酸的过程中，所需添加的食品添加剂较少，使柠檬酸的纯度比较高。
3.柠檬酸的生产过程中无任何污染物产生，在环保方面做的比较好。
4.柠檬酸是一种可再生的有机酸，通过小麦粉为原料的发酵工艺生产，极大程度上利用了资源再生。
三、总结：小麦粉为原料发酵生产柠檬酸工艺是一种新型的食品工业生产工艺，其优点在于无需采集柠檬等水果资源，纯度高、环保性好等，为食品添加剂、药品等领域的发展提供了新的方向。
当然该工艺流程中还存在各种问题，需要在实践中不断探索总结，使之趋于完善。
以小麦粉为原料发酵生产柠檬酸工艺
以小麦粉为原料发酵生产柠檬酸工艺简介柠檬酸是一种广泛应用于食品、饮料、药品等行业的有机化合物，具有酸味和清新的风味。
传统上，柠檬酸主要通过柠檬果实提取或发酵工艺生产，使用柠檬果实生产柠檬酸会受到果实季节性、价格波动等限制。
因此，利用发酵工艺以小麦粉为原料生产柠檬酸成为一种具有潜力的替代方案。
本文将详细介绍以小麦粉为原料发酵生产柠檬酸的工艺。
工艺流程以下是以小麦粉为原料发酵生产柠檬酸的基本工艺流程：第一步：小麦粉的处理1.将小麦粉加入适量的水中，搅拌均匀，形成小麦粉糊状物。
2.将小麦粉糊状物进行蒸煮，以破坏小麦粉中的淀粉颗粒。
第二步：接种发酵菌种1.将蒸煮后的小麦粉糊状物冷却至适宜的温度，通常在30-35摄氏度之间。
2.在小麦粉糊状物中加入适量的柠檬酸发酵菌种，并充分搅拌均匀。
第三步：发酵过程1.将接种好发酵菌种的小麦粉糊状物进行发酵，通常需要在适宜的温度下进行，持续时间约为48-72小时。
2.在发酵过程中，注意控制发酵温度、pH值和氧气供应，以促进柠檬酸的生产。
第四步：柠檬酸的提取和纯化1.将发酵过程中产生的发酵液，进行离心分离，获得澄清的柠檬酸液。
2.对柠檬酸液进行酸碱调节，使其pH值适合柠檬酸结晶。
3.通过结晶、过滤和干燥等操作，将柠檬酸进行纯化，获得纯度较高的柠檬酸成品。
工艺优势1.以小麦粉为原料发酵生产柠檬酸相对传统柠檬果实提取工艺更加灵活，可以实现全年生产，并且避免了果实季节性和价格波动的影响。
2.小麦粉作为广泛可用的资源，在全球范围内都具备较高的可获得性和成本优势。
3.发酵工艺相对简单，需要的设备和技术要求相对较低，成本较低。
4.柠檬酸是一种天然有机酸，与传统化学合成方法相比，发酵工艺更加环保和可持续。
工艺改进和展望目前以小麦粉为原料发酵生产柠檬酸的工艺已经有了初步的应用，但仍有一些改进和发展的空间：改进一：增加柠檬酸产量1.通过优化发酵条件，如温度、pH值、氧气供应等，提高柠檬酸的产量。
柠檬酸的发酵生产与提取
一、柠檬酸发酵的生产
柠檬酸发酵生产分深层发酵法、固体发酵法和液体表面发 酵法。深层发酵法是柠檬酸发酵生产的主要方法。国内以 淀粉质粗原料为培养基，发酵产酸一般为 11%~13% ，最 高达 15%，发酵周期为50~70h。国外以淀粉水解糖为原 料，产酸达19%，发酵周期为5d以上。
二、深层发酵法生产柠檬酸工艺流程
三、发酵设备
柠檬酸深层发酵一般都采用不锈钢机械搅拌通气 发酵罐，容积大部分为100～200 m3，也有250～ 400m3，国外的发酵罐容积为400～600 m3。采 用二挡搅拌，为了减小对丝状菌丝的剪切作用， 多用箭叶式搅拌器。近年来国内大型柠檬酸发酵 罐采用喷环装置，它是在罐的底部安装一个气液 型喷射混合搅拌装置和环流反应器以增加气—液 混合并可减少一组以上搅拌叶，能明显起到省电 节能的作用。
四、钙离子交ห้องสมุดไป่ตู้提取柠檬酸工艺流程
Thank you
2-1柠檬酸发酵工艺-zy
A、置于γ射线下照射处理，照射后孢子悬浮液稀释， 取0.1mL涂平板。
B、DES诱变处理，孢子悬浮液4.5mL，加入 2%DES0.5mL，于30℃振荡5min，再加入 75%Na2S2O310mL，解毒10min或稀释10倍后涂平 板。
C、复合诱变，Co60 γ射线---高温处理---亚硝基胍处 理等，低剂量多次复合处理。
柠檬酸在制药方面的应用
❖ 1、作为泡腾片：柠檬酸与NaCO3或NaHCO3水溶液反应， 生成大量CO2（泡腾）和柠檬酸钠，可使药物中活性配料迅 速溶解并增强味觉能力。
❖ 2、柠檬酸糖浆是发热病人的清凉饮料，具有清凉、解毒功 效。
❖ 柠檬酸普遍用于营养口服液中，维持活性配料的稳定性，加 强防腐剂效果。
❖ 柠檬酸钙盐在水中的溶解度较小；并且随温度 升高进一步降低。
❖ 柠檬酸钙的溶解度也与酸度有关，pH 值降低 时溶解度增大
❖ 如果温度升高至95～100℃， Ca3(C6H5O7)·4H2O的溶解度可进一步降低为 0.578g/L水。
❖ 将溶液加热至沸，使柠檬酸钙盐比较完全沉淀 析出，而其它有机酸钙（葡萄糖酸钙、草酸钙） 等物质溶解。
采用不同原料所用菌种不同
淀粉原料:
TD-01,初糖浓度20.8%，96h,产酸率20.24%，转化 率97.28%.
薯干原料: 糖蜜原料:
上海工微所 东酒2号 N-558 Co827 T419
初糖浓度18-19%，60-90h,产酸率20.24%，转化 率97%.
川柠-17-66（四川食品研究所），8668（黑龙江轻工 所），产酸14%，性能粗放，抗金属离子能力强，以甘 蔗糖蜜不需要黄血盐预处理。
烷基磺酸盐和烷基硫酸盐：EMS甲基磺酸乙酯、DES硫酸二乙酯 亚硝基烷基化合物：亚硝基乙基脲（NEH）、N-亚硝基-N-乙基脲烷 （NEU） 亚硝酸（改变核酸结构和性质） 叠氮化钠（可获得较高的突变频率）、环氧乙烷、吖啶橙等
《发酵工艺》柠檬酸
AMP
高葡萄糖 （2）-酮戊二酸脱氢酶受
NH4+
的阻遏。
（3）低pH下，乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶受抑制。
三高三低:
高底物浓度： 激活磷酸果糖激酶
高铵离子浓度: 阻遏-酮戊二酸脱氢酶
高通氧强度：存在一条侧系呼吸链,
正常情况下，不产生ATP。 缺氧导致不可逆失活,NADPH2改走标准呼吸链，产生 ATP。
二、柠檬酸生产菌
青霉（Penicillium）、毛霉（Mucor）、曲霉 （Aspergillus）等。
国内外学者一致认为：
黑曲霉（Aspergillus niger）是生产柠檬酸的最
佳菌种。因为： 黑曲霉具有多种较强的酶系，边长菌、边糖化、边
发酵产酸。
三、柠檬酸发酵机制及代谢调控
1. 柠檬酸生物合成途径
二、历史
•20世纪20年代，发现某些霉菌和酵母可积累L-苹果酸。 •60年代，英美用化学合成法生产L-苹果酸，成本高。
•1959年，日本利用短乳杆菌（lactabacillus brevis）
产生的富马酸酶催化富马酸转化为L-苹果酸成功。 •60年代以来，各国争相研制一步法从淀粉等糖质原料 生产苹果酸。 •目前，世界上苹果酸的主要产地是日本。
三、生产方法
1. 从果汁中直接抽提法：经济上不合理
2. 化学合成法：产物是DL-苹果酸
3. 发酵法：
（1）一步法 糖类
苹曲霉果酸
（2）二步法
根霉
酵母菌、细菌
糖类 富马酸
苹果酸
4.酶转化法:
固定化细胞
富马酸盐（化学合成） 富马苹酸果酶 酸盐
四、苹果酸合成途径
EMP
淀粉 葡萄糖
丙酮固酸定CO2的方法：钙盐法 1.发酵醪预处理：直接加热
柠檬酸的生产工艺
柠檬酸的生产工艺柠檬酸是一种广泛应用于食品、饮料、化妆品等领域的有机酸，具有酸味和清香的特点。
以下是柠檬酸的生产工艺的简要介绍。
柠檬酸的主要生产工艺包括传统工艺和现代工艺两种。
传统工艺:传统工艺主要以柠檬或柠檬皮为原料进行发酵生产。
具体工艺流程如下：1. 预处理: 将柠檬或柠檬皮去皮、去籽，然后切碎或研磨成泥状。
2. 发酵: 将柠檬泥放入发酵罐中，加入一定比例的细砂糖和水，并加入适量的发酵剂，如酵母、酒石酸盐等，进行发酵。
发酵温度一般控制在30-35摄氏度，发酵时间约为2-3天。
3. 分离: 发酵后的混合物经过滤去除固体残渣，得到柠檬酸浸提液。
4. 浓缩: 柠檬酸浸提液经过真空蒸发或浓缩器浓缩，使其浓度达到一定程度。
5. 结晶: 浓缩液经过冷却结晶或结晶沉淀等方式，获得柠檬酸晶体。
6. 过滤: 将柠檬酸晶体进行过滤、洗涤和干燥，得到纯净的柠檬酸成品。
现代工艺:现代柠檬酸生产工艺主要采用微生物发酵生产。
具体工艺流程如下：1. 选种培养: 选用高产柠檬酸的微生物，如亚洲真菌、微生物菌株等进行培养和选种。
2. 培养基制备: 通过混合培养基原料，如糖、酵母粉、蛋白胨、盐等，制备培养基。
3. 发酵: 将选好的微生物种子培养液接入发酵罐中，加入培养基和适量的营养物质，如氮源、磷源、微量元素等，进行发酵。
发酵温度和时间一般根据菌株的要求进行控制。
4. 分离: 将发酵液经过滤或离心分离，得到柠檬酸发酵液。
5. 浓缩: 将发酵液经过真空蒸发或浓缩器浓缩，使其浓度达到一定程度。
6. 结晶: 浓缩液经过冷却结晶或结晶沉淀等方式，获得柠檬酸晶体。
7. 过滤: 将柠檬酸晶体进行过滤、洗涤和干燥，得到纯净的柠檬酸成品。
以上是柠檬酸生产的主要工艺流程，不同生产厂家可能会有一些细微的差异和改进。
现代工艺相对于传统工艺而言更加高效、可控性更强，并且可以实现大规模连续生产，提高了生产效率和产品质量。
柠檬酸发酵工艺新进展探究
柠檬酸发酵工艺新进展探究柠檬酸是一种重要的有机酸，具有广泛的应用价值，包括食品加工、医药制备、工业生产等领域。
柠檬酸的生产通常通过发酵方法进行，其发酵工艺的研究和改进对于提高柠檬酸生产效率、降低成本具有重要意义。
近年来，随着生物技术和发酵工程的进步，柠檬酸发酵工艺取得了新的进展，本文将对柠檬酸发酵工艺的新进展进行探究。
一、传统柠檬酸发酵工艺柠檬酸的传统生产方法是以糖类为基质，通过革兰氏阳性菌属植物（如黑曲霉、毛霉、曲霉等）发酵产生。
传统工艺中，通常采用固态发酵或液态发酵的方式，通过控制温度、pH值、通气量等参数，使得菌株在合适的条件下进行生长和代谢，最终产生柠檬酸。
传统工艺虽然可以实现柠檬酸的生产，但存在工艺复杂、产品纯度低、发酵周期长等问题，难以满足当前工业生产的需求。
二、新型菌株的应用在柠檬酸发酵工艺的研究中，新型菌株的应用是一个重要的方向。
近年来，研究人员通过筛选和改造，发现了一些优良的菌株，如黄曲霉、新拟杆菌等。
这些菌株在柠檬酸的发酵过程中，具有高产酸能力、耐酸能力强、对底物利用效率高等优点，能够显著提高柠檬酸的生产效率和产品纯度。
一些基因重组技术的应用也为新型菌株的改良提供了可能，通过改变菌株的代谢途径、增强其柠檬酸产生能力，进一步提高了柠檬酸的产量和品质。
三、发酵条件的优化发酵条件的优化是柠檬酸发酵工艺改进的重要方向。
传统工艺中，发酵条件的调控主要依靠经验和试错，难以实现最佳化。
而现代生物技术的发展为优化发酵条件提供了新的思路和手段。
利用响应面方法和遗传算法，可以实现对发酵参数（如温度、pH值、通气量、底物浓度等）的精确控制和优化组合，从而提高柠檬酸的产量和质量。
随着生物传感技术、在线监测技术的应用，发酵过程中的关键参数可以实时监测和调控，实现对发酵过程的动态优化，提高了工艺的可控性和稳定性。
四、底物利用的深化在传统的柠檬酸发酵工艺中，通常采用蔗糖、葡萄糖等单一底物进行发酵，底物的利用率有限。
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置换法一般是采用糖浓度低而营养较丰富的培
养液先培养菌盖，待菌盖形成之后再更换发酵
培养基。可更换1次也可数次，发酵液用来提取 柠檬酸。
置换法的优点是节省了大量培菌时间，发酵速度 快，而且原本不适宜长菌的原料都可用作发酵培 养基。
但为了保持菌盖的高活性，不能将发酵液残糖控
制得很低，这样一来就造成替换出来的发酵液残
柠檬酸发酵工艺
柠檬酸发酵工艺 工艺流程
柠檬酸发酵工艺 1、试管斜面菌种培养
察氏琼脂培养基：NaNO3 3g， 蔗糖 20g， K2HPO4 1g， KCl 0.5g， MgSO4.7 H2O 0.5g， FeSO4 0.01g， 琼脂20g， 用水定溶至1000ml， pH自 然。 察氏-多氏琼脂培养基：蔗糖30g， NaNO3 2g， MgSO4.7H2O 0.5g， KH2PO4 1g， KCl 0. 5g， FeSO4.7H2O 0.01g， 溴甲分绿0.4g，琼脂 20g， 蒸馏水1000ml， pH自然。
1、试管斜面菌种培养
蔗糖合成琼脂培养基：蔗糖140g， NH4NO3 2g，
KH2PO4 2g， MgSO4.7H2O 0.25g， FeCl3.6H2O 0.02g ， MnSO4.4H2O 0.02g， 麦芽汁20ml， 琼脂20g， 用 水定溶至1000ml。 米曲汁琼脂培养基：一份米曲加四倍质量的水， 于55℃保温糖化3~4小时后煮沸，滤液用水调整浓度 至10‘Bx，并用碱液将pH调制到6.0，接着添加琼脂 2%。确认所制成的斜面无杂菌污染后，接入黑曲霉 孢子悬液0.1ml，于32℃培养4~5d。
糖量较高，给后道提取柠檬酸带来困难。
c 一般发酵法影响表面发酵的因素
a) 培养液层厚度 b) 糖浓度 c) 温度 d) pH值 e) 通风
③ 固体发酵
分为浅盘发酵和厚层通风发酵，统称曲法发酵。
固体发酵工艺具有的优点： （1）设备简单，投资少； （2）操作简单，能耗低，适应性强； （3）原料粗放，来源广泛，培养基简单； （4）发酵时间短 缺点是设备占地面积大、劳动强度大，传质传热 困难，产品回收率低，副产物多等。
2、 种子扩大培养 ① 二级扩大培养
a 培养基
有琼脂固体培养和液体表面培养两种方法，前
者的培养基组成与斜面培养基相同，后者的组成
如下：麦芽汁7˚BX，氯化铵2%，尿素0.1%
2、 种子扩大培养 ① 二级扩大培养
b 培养
固体培养时，500ml茄子瓶装80ml琼脂培养基， 250ml茄子瓶装50ml琼脂培养基。灭菌后摆成斜面， 凝固后的斜面至37℃下培养24h。确认无杂菌污染 即可使用。 液体培养时，将液体培养基装入三角瓶中，使液层 深度达45cm，于0.1MPa下湿热灭菌15min。按无菌 操作接种。培养温度32℃。液体表面需7~10d，琼 脂固体培养需6~7d。
① 柠檬酸的液体深层发酵工艺
（5） 孢子接种数与菌球体的特征 柠檬酸发酵液中的菌球体是有一个或数个孢子在 生长过程物理作用形成的。菌球体的大小和数量 关系到发酵的成败，一般来讲，菌球体越小、越 多，产酸就越高，发酵周期也越短。菌球体的大 小和数量与孢子接种量有关。
② 表面发酵
采用表面发酵工艺具有一些优点： （1）设备简单，投资少，投产快； （2）操作技术简单，能耗低； （3）原料粗放，而且适于高浓度发酵，产酸浓度 也较高； 但表面发酵存在的问题是设备占地面积大，劳动 强度大，发酵时间长，菌体生长量多，而影响产 率等。
为了克服上、下曲盘的温差，在发酵40h左右时应
将曲盘上下对调。整个发酵期间
发酵终点根据酸度来判定，从48h开始测量酸度，
以后每隔12h测定1次，自72h以后则每隔4h测定1次， 在酸度达到最高时即出料，否则时间延长，柠檬酸 反而被菌体消化。
b 厚层通风发酵
② 三级扩大培养
可采用麸曲固体培养、液体表面培养或琼脂 固体培养。 所用培养基如下：
a 麸曲培养基： 新鲜小麦麸皮1kg，加水1.1~1.3L。液体培养基与 第二级扩大培养基所用液体培养基相同。 b琼脂固体培养基： 与斜面培养基相同。
3、 发酵生产
柠檬酸发酵是典型的好氧发酵，工业上好氧发酵基
本上有三种，即表面发酵、固体发酵和液体深层发
酵。前两者是利用气相中的氧，后者是利用溶解氧。
这三种发酵方法都各有优缺点和经济可行性，工业 上仍然在使用。
① 柠檬酸的液体深层发酵工艺
用液体深层发酵罐从罐底部通气，送入的 空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶 解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对 于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养 法来讲，称为深层培养法。
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① 柠檬酸的液体深层发酵工艺
（3）控制生物量 正常的发酵液中生物量控制在12-20g/L，过多的生 物量影响氧的溶解，增加发酵罐的搅拌，且消耗大 量的葡萄糖，如果生物量的过度生长，柠檬酸的产 率则迅速下降。 （4）严防缺氧 柠檬酸是耗氧发酵，对氧十分敏感，当发酵进入产 酸期时只需要几分钟的缺氧时间，就会造成严重影 响，甚至完全失败。对于突然停电等在所难免的事 故，要采取紧急的补救措施，关闭进气阀，迅速启 动备用电源，防止发酵罐料液倒流到空气过滤器中， 用灭过菌的碳酸钙或石灰乳中和发酵液pH至2.5-3.5， 然后恢复正常操作。
接种后72h起进入产酸期，这时菌体代谢速率高， 耗糖快，发酵液酸度急剧升高，并释放出大量热， 此时应加强通风措施，严格将发酵温度控制在 26~28℃，以利柠檬酸的形成。 因此，一般在进入产酸期前8h左右需增大风量， 且降低进汽温度在25℃以下，湿度仍在75%以上。 160h以后发酵结束。
b 置换法
（3）添加法 有两种方法：一是分菌膜生长期和产酸期，生长 期的液层3cm左右，待菌膜形成，放掉菌膜下的生 长液，通入产酸培养基，液层在10~12cm，一直到 发酵结束。 另一种添加工艺是在液层为6~8cm的一段发酵基础 上，待产酸进入高峰期通入3~4cm的产酸培养基， 总液层达9~12cm，直至发酵结束。
② 表面发酵 a 一般发酵法
具体操作：接种后，培养温度维持在35℃72h左 右，这是黑曲霉的适宜生长温度，以促进孢子发 芽及菌体发育。当温度逐渐下降时，必须通入约 50℃的空气以维持35℃的培养温度。接种后20h 左右可出现灰白色、很薄的菌膜，72h时菌膜已 完全形成，菌膜相当厚且有皱褶。48h起由于菌 体耗氧增加，可开动另一组风管向盘层之间通汽， 进汽温度为40℃左右，进汽湿度为75%以上，以 防培养液水分蒸发过快。
③ 固体发酵 a 浅盘发酵
③ 固体发酵 a 浅盘发酵
浅盘固态发酵在发酵室内进行，发酵时也叫曲房， 需要配置无菌空调设备，室内放置盘架，以8~10层 为宜，架盘层垂直间距为15~20cm。 浅盘发酵的容器可以采用发酵盘（曲盘、竹盘等） 曲盘的厚度在6~8cm，材料可以是木质，铁质或不 锈钢等，盘底最好是多孔篩板，以利于通气。
③ 固体发酵 a 浅盘发酵
将曲置于曲室内培养，室温可按需要调节。在孢子 发芽和菌丝生长期，由于产生的热量少，品温会逐 渐下降，在入室后18h内，应维持品温在27~31℃。 培养18~48h期间，由于发酵热的大量释放，品温上 升很快，应采取措施，不得让品温超过43℃
菌体活力下降，所以品温会下降，此时应维持在 35℃左右，直至发酵结束。
特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求 以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培 养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。
① 柠檬酸的液体深层发酵工艺
（1）发酵温度 黑曲霉发酵柠檬酸温度控制在28~30℃，柠檬酸 产率最高，发酵速度较快，超过35℃时，虽然初 期产酸较快，但最终的发酵产率降低15%以上。 为了节约降温能耗，我国成功培育出高温发酵的 产酸微生物，可以在37℃发酵。 （2）pH 在薯干粉发酵柠檬酸中，初始pH不加调节, 约5.5。当接入菌种后，菌种生长繁殖，消耗氮 源和铵离子，使培养基的PH下降，前期pH下降较 快，活力强的菌种微生物培养12h后，ph可以降 至2.5-3.0，24小时后可以降至2.2-2.3，这时会 有少量的柠檬酸产生，但要到48小时后柠檬酸才 大量产生，才使pH下降至2.0以下。
b 厚层通风发酵
厚层发酵与空气的接触面小，所以需要在容器底部
设置空气通道，以利于通氧，这种发酵设备又称发
酵箱，这种发酵箱为厚层通风制曲箱，简称曲箱。 大型的曲箱可以配置翻曲机，这样曲层可以加厚。
机械通风固体曲发酵设备 1一输送带 2一高位料斗 3一送料小车 4一曲料室 5一进出料机 6一料斗 7一输 送带 8一鼓风机 9一空调室 10一循环风道 11-室闸门
b 厚层通风发酵
与浅盘发酵明显不同的是，在物料铺摊厚度上，厚
层发酵的曲醅厚度在50cm左右，比浅盘发酵的
15~20cm要大出许多。
为了给曲霉菌提供氧，在培养过程中需要进行机械 通风。
培养过程中的温度控制与浅盘发酵的温度管理相似， 但最高品温不能超过40℃。温度和湿度主要靠通风 来调节，因为物料厚度大，所以培养过程中需要翻 料。 厚层发酵比浅盘发酵优越之处在于：占地面积少， 污染杂菌可能性小，机械化程度高。
② 表面发酵
（1）一般发酵法 根据菌种的产酸能力，液层一般在8~12cm，一次 性发酵至结束。 （2）置换法 一次发酵结束，将酸液从菌膜下排走，然后在菌 膜下通入无菌水，静止1小时，待菌膜中酸液渗入 水中，排走洗水至贮酸桶，再通入置换液，液层 视菌种生产能力而定，一般在6~8cm。
② 表面发酵