柠檬酸液态发酵及提取工艺
柠檬酸的提取工艺
3.过滤的基本概念
过滤：使固、液两相分离常用的有 效方法。 其基本原理：是利用一种有很多毛 细孔的物体做过滤介质，利用过滤介 质两侧的压力差为推动力，使被过滤 的液体由介质的小孔通过以得到澄清 的滤液，悬浮物被截留而积聚在介质 表面形成滤饼。
我国某柠檬酸厂，曾引进德国维斯
伐利亚的喷嘴式离心机，分离薯干 发酵醪菌渣，但因渣量多、固体颗 粒不均匀易堵塞喷嘴而未成功。某 厂用卧螺沉降式离心机分离菌渣大 型试验获得成功，但处理量偏小， 总体投资太大。
7.除草酸的方法
发酵醪中的有机杂酸主要是草酸和葡萄糖 酸，他们都能形成钙盐沉淀，但前者的溶解度很 低，故可在中和前除去，后者溶解度高，中和之 后大部分在废水中排除。 利用草酸钙溶解度低于硫酸钙溶解度的原理， 在一次滤液中加硫酸钙，使其生成草酸钙，在一 次滤液复滤时，一并除去，反应方程式如下： （COOH）2 + CaSO4 Ca（COOH）2 + H2SO4
些微孔中，由于表面张力和粘着力而不 能自动流出，为提高滤出物的收率，应 加清洗液将这些清洗液排出。 一般要大体洗涤干净，只需消耗少量 的清洗液，如果要完全洗涤干净，则要 消耗大量的洗涤液，但因而增加了滤液 的稀释度，在生产中要权衡利弊，利用 适当两的洗涤液，达到较佳的效果。
4.过滤机的生产能力
过滤机的生产能力，通常以每单位 过滤面积（m2）,在每单位时间（h）内 所能得到的产物量〔滤液（ m3）或滤饼 （kg）〕来表示。
色谱分离（ILCS）工艺 该工艺由中科院生态环境中心研究成功，目 前仍处于实验性生产阶段。主要特点是： a、采用对柠檬酸分子具有高效分离特性的离子交 换树脂作分离材料，从发酵液中分离出柠檬酸； b、强化了发酵过滤液的预处理工作，除去非柠檬 酸杂质，使成品中易炭化物含量达标； c、提取液中柠檬酸浓度可达20%~40%，减少蒸发 能耗； d、从发酵液中总酸算起，总收率可达85%~90%。
柠檬酸液态发酵及提取工艺
1.4.2 发酵液预处理
➢ 取细度为60目以上的玉米粉300g装入2000ml烧杯中，加 入1000mL水和7～8个单位α-淀粉酶(高温)/g玉米粉；
➢ 于80℃液化l0min后，继续加热至90℃保温30min，碘检 不变色后，再加热到100℃煮沸(5～l0min)，趁热经过二 层纱布过滤;
➢ 滤液加水冷却并调整糖度至15％～20％和蛋白质含量不超 过4g/L，pH6.0。
总糖及残糖(还原糖) 采用测定：试剂或DNS法， 测上清的总糖。
1.4.5 柠檬酸提取
• 过滤： 加热至65±2℃，3 层纱布过滤， 可用少量75±2℃水洗；
• 离心：3000 r/min，10 min离心去掉菌体 等杂质；
• 水洗：75±2℃水洗至柠檬酸＜1％；
④ 中和
➢ 滤液中除含柠檬酸外，还含可溶性的残糖以及蛋白质、金属离子等杂 质。利用柠檬酸钙难溶于水的特点，与杂质分离；
柠檬酸积累的原因
• Mn2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4↑ • 由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧
化脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及 柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。 • 由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡： 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累 。 • 随柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，顺乌头酸酶和异 柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出胞外。
用途
➢ 柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被 广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、清洗(洗涤)、建筑等工业部门。
➢ 其中食品和饮料业占56％，清洗(洗涤剂)业占20％，医药和化妆品占11％ ，其他工业占13％。
柠檬酸发酵及产物提取
综合实验：柠檬酸发酵及产物提取（一）柠檬酸发酵一、实验原理柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羟生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。
但就柠檬酸产生菌而言，由于其乌头酸流水作业事酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式：2 C6H12O6 +3 O2→2 C6H8O7 +4 H2O国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。
二、实验器材（一）材料1．菌种：黑曲霉2．蔗糖、硫酸铵等（二）主要仪器设备1．旋转式摇床、超净工作台、15L发酵罐等三、操作步骤1．种子培养基制备：马铃薯培养基配方:(1000ml)马铃薯（去皮）200g葡萄糖（或蔗糖）20g琼脂15~25g水1000ml自然pH2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。
3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。
4．发酵培养基制备：蔗糖15%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁7水0.025%。
5. 上罐灭菌（操作同实验一）5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的5%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、500转条件下发酵4天。
6.分别在0,24,48,72,96小时测定一下参数。
四、实验结果1．对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。
2．测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。
3．计算柠檬酸发酵的转化率，即每100克葡萄糖经转化所能生成的柠檬酸克数，柠檬酸酵的理论转化率按下列反应计算应为106.7%。
柠檬酸提取工艺
• （3）树脂交联度大，离子扩散慢，应减小 流速
• （4）进液中杂质离子多可加快，否则减慢 • （5）开始操作室杂质离子不流出，可加快
流速，随后逐渐减慢
• （6）综合各因素考虑
• 3.脱色柱的再生
• 脱色柱使用失效后，先水洗柱内残酸和浮 色，流出液无酸味用水反冲，使柱内悬浮 性杂质浮起漂走。漂清后用1mol/LNaOH冲 洗并浸泡1h，然后水洗至中性，反向漂清， 用1mol/LHCl冲洗并浸泡1h，水洗至pH4， 用水浸没树脂备用。
第十节 柠檬酸提取工艺
• 柠檬酸成熟发酵液中除了含有主要产品 柠檬酸之外，尚含有残糖、菌体、蛋白质、 色素和胶体物质、无机盐、有机杂酸，以 及原料带入的各种杂质，要在如此复杂的 混合体系中获得符合质量要求的柠檬酸成 品，必须采用一系列物理和化学方法进行 处理，这一系里过程成为提取工艺。
• 钙盐法、萃取法、离子交换法、电渗析法
防治分解 • （2）是蛋白质变性而絮凝，破坏胶体，降
低料液黏度，利于过滤； • （3）可使菌体中柠檬酸部分释放出来。
三、发酵液过滤
（一）原理 利用过滤介质两侧的压力差，让液相透
过介质与固相分离
• （二）目标 • 1.彻底除去发酵液中的悬浮物 • 2.除去发酵液中的草酸 • 3.尽可能减少滤液的稀释度 • 4.把柠檬酸的损失减少到最低限度
• 三种不同的柠檬酸钙盐在水中溶解度相差 很大
（二）影响中和的因素
• 1.滤液的质量 • 带有悬浮物和蛋白质胶体物质的滤液缓冲
性较大，影响中和终点的控制 • 用碳酸钙中和时产生泡沫多而不易消失，
影响柠檬酸钙结晶，生成的钙盐颗粒细小； • 稀释度太大的料液则导致废水排放量大、
柠檬酸钙溶损多且能耗高。
柠檬酸的提取工艺
FRIENDS
3 离子交换法提取柠檬酸 4 传统钙盐法提取柠檬酸
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水果中柠檬酸的提取
在水果中提取柠檬酸尤其在未成熟的 杏、苹果或李子和柑橘等含柠檬酸较高的 水果中提取可用水或乙醇作提取剂经过加 热、浓缩和结晶后FR得IEN到DS 的柠檬酸可以直接 应用于食品添加剂等。
柠檬酸的提取工艺
概述 传统提取方法
新型提取方法 展望
概述
成熟的柠檬酸发酵液中，除含有主产物柠 檬酸之外，还含有纤维、菌体、有机杂酸、糖 、蛋白类胶体物质、色素、矿物质及其他代谢 产物等杂质，它们或来FRIE自NDS发酵原料、或在发酵 过程中生产，或溶存或悬浮于发酵液中。通过 各种理化方法，清除这些杂质，得到符合各级 质量标准的柠檬酸产品的全过程，即为柠檬酸 生产的下游工程。它是一个确保产物“丰收”，提 高企业效益的生产系统工程。
超滤法提取柠檬酸的工艺流程
柠檬酸发酵液预处理→超滤→结晶→离心分离的母 液→干燥→成品。
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采用该提取方法，不使用任何有害物质， 无废弃物产生，而且实施简便，容易实现自动 化，应该说实现了柠檬酸的清洁化生产。
但是，该方法要F求RIE柠ND檬S 酸发酵液残糖含量 ≤1 g／L，柠檬酸产率与残糖含量之比>1275， 方能得到较好的效果。
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提取工艺
FRIENDS
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1.发酵液预处理
预处理是指待发酵液加热至75-90℃， 可以及时杀死柠檬酸产生菌及其他杂菌，终 止发酵作用，同时使发酵液中部分蛋白质变 性、絮凝、降低酵液浓FRIE度ND利S 于过滤。此外也 可能使菌体内部分柠檬酸释放出来。预处理 加热时间不能太长，若破坏菌丝球则影响过 滤。
目前柠檬酸生产过程
一、目前柠檬酸生产过程：基本化学原理：C12H22011 +H20+302→2C6H8O7+4H2O(蔗糖) （柠檬酸）总体来说，柠檬酸的生产主要分为发酵和提取两步。
具体过程如下：步骤：1、原料处理湿粉渣必须经过压榨脱水，使含水量在60%左右；干粉渣含水量低，应按60％的比例补足水分；结块的粉渣需粉碎成二至四毫米颗粒。
2、接种、发酵注意适当通风，因黑曲霉菌是喜空气细菌。
发酵室内的相对湿度注意发酵过程中的温度控制。
（该步骤可浸取得柠檬酸，但此时的柠檬酸清液中含很多其他液态杂质，液态混合物不易分离。
该步骤的生产原理比较简单，即淀粉水解成蔗糖，蔗糖进而与水和氧气生成柠檬酸）该步骤常用产酸能力较强的黑曲霉作为生产菌。
3、清液中和将上一步骤经过沉淀的清液（即含柠檬酸的液态混合物）移入中和罐，加温至60℃后，加入碳酸钙中和，边加边搅拌。
柠檬酸与碳酸钙形成难溶性的柠檬酸钙，从发酵液中分离沉淀出来，达到与其它可溶性杂质分离的目的。
加完碳酸钙后，升温到90℃，保持半小时待碳酸钙反应完成后，倒入沉淀缸内，抽去残酸，再放入离心机脱水，用95℃以上的热水洗涤钙盐，以除去其表面附着的杂质和糖分。
在这里要重点检查糖分是否洗净（洗净的柠檬酸钙盐最好能迅速进行酸解，不要过久贮放，否则会因发霉变质造成损失。
如因故不能及时处理，要晾干后再存放），方法是将1～2%的高锰酸钾溶液滴一滴到20毫升洗水中，3分钟不变色即说明糖分已基本洗净。
在清液中和过程中，控制中和的终点很重要，过量的碳酸钙会造成胶体等杂质一起沉淀下来，不仅影响柠檬酸钙的质量，而且给后道工序造成困难。
一般按计算量加入碳酸钙（碳酸钙总量=柠檬酸总量×0．714），当pH为6．5～7．0，滴定残酸为0．1～0．2％时即达到终点。
一旦加过了碳酸钙量，需要补加发酵或母液。
4、酸解与脱色酸解是将已洗净的难溶性的柠檬酸钙与硫酸作用，生成柠檬酸与硫酸钙。
化学原理如下:Ca(C6H5O7)2+3H2SO4=2C6H8O7+3CaSO4（沉淀）5、浓缩、结晶将脱色后过滤所得清液，用减压法浓缩（要求真空度在600～740毫米汞柱，温度为50～60℃）。
柠檬酸液态发酵及提取工艺
柠檬酸液态发酵及提取工艺综述摘要:发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。
液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。
发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。
国内目前有很多人研究了MgCl2、普鲁兰酶、植酸钠、磷浓度、菌种、木薯原料、纤维素糖化液、玉米粉淀粉混合原料、接种量和碳氮比、溶解氧、发酵罐搅拌系统、尿素、乙醇等添加剂、初始含糖量、温度、pH、发酵时间等等对黑曲霉发酵产酸的影响，从而改良提取工艺。
关键词：柠檬酸液态发酵提取工艺一、前言柠檬酸(citric acid）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸(2-hydroxytricarboxylic acid)或2-羟基丙烷-l，2，3-三羧酸(2-hydroxy propane-1，2，3-triearboxylic acid)是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。
分子式：C6H8O7（相对分子质量：192.13），无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。
极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大；从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质，加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。
柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。
柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。
另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。
它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。
柠檬酸酒精等的发酵生产
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1. 淀粉质和纤维质原料的水解
淀粉的糊化、液化
淀粉在水中经加热会吸收一部分水而 发生溶胀。如果继续加热至一定温度（ 一般60～80℃）,淀粉粒即发生破裂,造 成黏度迅速增大,体积也随之迅速变大, 这种现象称为淀粉的糊化
1. 淀粉质和纤维质原料的水解
不同种类淀粉糊化温度有所不同, 苷薯、马铃薯、玉米和小麦淀粉的 糊 化 温 度 分 别 为 70 ～ 76℃ 、 59 ～ 67℃ 、 64 ～ 72℃ 和 65 ～ 68℃ 。 发 生 糊化现象称为淀粉的溶解，或称为 液化。马铃薯、小麦和玉米支链淀 粉 完 全 液 化 的 温 度 为 132℃ 、 70 ～ 80℃、136～141℃和146～151℃。
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淀粉质原料酒精生产工艺流程
•
大米 曲霉菌 麸皮 淀粉质原料
酵母
•
↓
↓
米曲霉→米曲
固体试管酵母
•
↓
↓
•
米曲汁→试管培养→三角瓶培养 粉碎
三角瓶液体酵母
•
↓
↓
ห้องสมุดไป่ตู้
↓
•
曲种
蒸煮
卡式罐酒母
•
↓
↓
↓
•
糖化曲液 糖化→酒母糖化醪→小酒母
•
↓
↓
•
发酵
大酒母
•
↓
•
蒸馏
•
↓
•
•
酒糟废液 酒精 杂醇油
米曲汁
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淀粉颗粒→淀粉分子→可发酵性糖→酒精→95％乙醇 (C6H10O5)n+nH2O→nC6H12O6→2nC2H6O+2nCO2+2nATP
现在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌”（大肠杆菌） 高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的先锋霉素（头孢菌 素类）、氨苄青霉素，就是这类半合成抗生素类药物。
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柠檬酸液态发酵及提取工艺0802班生物科学饶慧（指导教师：胡远亮）0前言柠檬酸(citric acid）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸(2-hydroxytricarboxylic acid)或2-羟基丙烷-l，2，3-三羧酸(2-hydroxy propane-1，2，3-triearboxylic acid)是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。
分子式：C6H8O7（相对分子质量：192.13），无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。
极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大；从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质，加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。
柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。
柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。
另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。
它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。
柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。
柠檬酸循环(citric acid cycle)又称三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle)，克雷布斯循环(Krebs cycle)。
体内物质糖、脂肪或氨基酸有氧氧化的主要过程。
通过生成的乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成三羧酸（柠檬酸）开始，再通过一系列氧化步骤产生CO2、NADH及FADH2，最后仍生成草酰乙酸，进行再循环，从而为细胞提供了降解乙酰基而提供产生能量的基础。
实验发酵机理：1）以薯干粉、玉米粉或淀粉等糖类为原料经黑曲霉柠檬酸产生菌（我们采用黑曲霉M288）糖化后产生高浓度的葡萄糖。
2）黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸：葡萄糖以EMP（糖酵解途径或者）、HMP（磷酸戊糖循环）两种途径产生丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧形成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应后生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰CoA缩合产生柠檬酸。
3）生理调节：柠檬酸是黑曲霉的良好碳源，故柠檬酸的积累是菌体代谢失调的结果。
Mn2+抑制蛋白质合成造成NH4+的浓度增大，从而解除对PFK的抑制，使EMP通畅；柠檬酸脱氢酶在柠檬酸浓度高的情况下活性降低，进一步促进柠檬酸的积累。
发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。
固态发酵是以薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的农副产品为原料，配好培养基后，在常压下蒸煮，冷却至接种温度，接入种曲，装入曲盘，在一定温度和湿度条件下发酵。
采用固态发酵生产柠檬酸，设备简单，操作容易。
液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。
发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。
深层发酵生产柠檬酸的主体设备是发酵罐。
微生物在这个密闭容器内繁殖与发酵。
现多采用通用发酵罐。
它的主要部件包括罐体、搅拌器、冷却装置、空气分布装置、消泡器，轴封及其他附属装置。
发酵罐径高比例一般是1:2.5 ，应能承受一定的压力,并有良好的密封性。
除通用式发酵罐外，还可采用带升式发酵罐、塔式发酵罐和喷射自吸式发酵罐等。
我国柠檬酸的生产现状：我国是世界柠檬酸生产大国，总产量居世界前列。
近年来，由于我国柠檬酸生产能力和出口量增长过快，技术创新相对滞后，加上国际市场竞争激烈，已出现严重供大于求局面。
我国柠檬酸生产以薯干为原料的深层发酵技术具有独创性，发酵指数处世界前列，产品在国际市场具有一定竞争力。
但我国提取工艺和设备水平落后，生产单耗高，收率低，产品质量不高，规模效益差，深度产品开发少，废渣废水污染严重。
针对这些问题，国内目前有很多人研究了MgCl2、普鲁兰酶、植酸钠、磷浓度、菌种、木薯原料、纤维素糖化液、玉米粉淀粉混合原料、接种量和碳氮比、溶解氧、发酵罐搅拌系统、尿素、乙醇等添加剂、初始含糖量、温度、pH、发酵时间等等对黑曲霉发酵产酸的影响，也有大量的研究探究了柠檬酸生产废渣栽培平菇厌氧发酵生产沼气制取糖化酶等综合利用、废水循环利用和治理等。
柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温度、通风量及pH值等条件。
一般认为，黑曲霉适合在28～30 ℃时产酸。
温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。
微生物生成柠檬酸要求低pH，最适pH 为2～4，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。
柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量。
通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。
随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。
采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60％饱和度对产酸有利。
柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下降。
1材料与方法1.1材料菌种：黑曲霉，来自黄石市兴华生化有限公司；原料：玉米粉、蔗糖；试剂：α-淀粉酶、琼脂、碳酸钙、硫酸、0.1429 mol/L NaOH、DNS等。
1.2 仪器设备试管、三角烧瓶、茄子瓶、培养皿、1 mL吸管、吸耳球、无菌涂棒、量筒、酒精灯、接种环、棉花、棉线、牛皮纸、天平、灭菌锅、培养箱、摇床、小型板框过滤机、恒温水浴锅、搅拌机、离子交换柱、旋转蒸发器、恒温干燥箱。
1.3培养基斜面种子培养基（马铃薯琼脂培养基）：去皮马铃薯200 g切成小块，加水约500 mL，煮沸30 min，然后用纱布过滤，滤液加蔗糖20 g，琼脂20 g．溶化后自来水定容至1000 mL，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内，121℃灭菌20 min，取出摆斜面；马铃薯液体培养基：同马铃薯琼脂培养基的制作，但不加琼脂，25 ml/250 ml三角瓶分装，121℃灭菌20 min；种子与发酵培养基。
1.4种子制备(1) 接种：用无菌水将麸曲孢子制成孢子悬液，按1‰接种于摇瓶中；一支斜面接4～5瓶；(2) 摇瓶培养：八层纱布盖口，回旋式摇床，38℃，100 r/min培养20 h；或35℃下、转速200 r/min( 24 h前l00，24 h后200 r/min)、300 r/min( 24 h前l00，24 h后300 r/min) ，培养3～4 d；(3) 镜检：显微镜观察，处于快速生长期，可用于接种。
1.5发酵液预处理(1) 取60目以上的玉米粉500 g装入2000 mL烧杯中，加1000 mL水以及7-8单位的α-淀粉酶/g玉米粉，于80℃消化10 min；(2) 继续加热至90℃保持30 min，碘检不变色后，加热到100℃煮沸10 min，趁热两层纱布过滤；(3) 滤液加水冷却并调整糖度至15%-20%和蛋白质含量不超过4 g/L，最后调整pH 为6.0 ；(4) 然后用500 mL三角瓶按每瓶50 mL分装，瓶口塞入8层纱布包扎好，121℃灭菌20 min。
1.6发酵(1) 第一阶段：前24 h，温度32～35℃，转速100 r/min ；(2) 第二阶段：24 后，温度35℃，转速200 r/min；(3) 发酵0、24、48、72、96 h取样，0 h样品直接取1瓶作对照，并从中取10 ml 冷冻保存。
其它时间取样时，每个样品仅取1 ml冷冻保存，取样时用试纸现场检测pH值。
1.7发酵过程及分析(1) 样品80℃水浴30 min，3000 r/min，10 min离心去掉菌体等杂质，收集上清，检测残糖和柠檬酸含量，以观察发酵过程中黑曲霉的耗糖与柠檬酸生成速率。
如果检测样品量不够，可对上清进行适当倍数稀释；(2) 柠檬酸含量检测：一般检测发酵过程中的总酸，采用0.1429 mol／L NaOH溶液滴定发酵过滤清液；(3) 总糖及残糖(还原糖)测定：采用DNS法。
1.8柠檬酸提取(1) 过滤：加热至65±2℃，3 层纱布过滤，可用少量75±2℃水洗；取滤液。
(2) 中和：利用柠檬酸钙难溶于水的特点，与残糖以及蛋白质、金属离子等杂质分离的过程，加热至70-75℃，加入碳酸钙中和至pH6.1；(3) 过滤、洗糖：真空抽滤，90℃热水洗至无糖。
2 结果与分析2.1种子的制备将黑曲霉菌种接种于2支土豆斜面培养基3 d后观察到培养基上生长出能够产生黑色孢子的黑曲霉，然后分别接种于已灭菌的5瓶分装有25 mL/250 mL土豆液体培养基中，摇床培养。
表2.1.1 发酵过程中培养基的变化情况发酵时间（h）培养基变化情况0液体较澄清、透明24液体变化不大48液体浑浊有沉淀产生72液体较浑浊不透明96液体中有成团的沉淀末液体高度浓缩结果液体较培养前浑浊，镜检观察到了球形孢子，但数量不是很多，且没有杂菌生长。
2.2发酵液预处理发酵液预处理时用碘液检查发现碘液变蓝，说明发酵液中还有淀粉的存在，可能的原因是α-淀粉酶的活性低因而转化速率较慢；再加入一定量的α-淀粉酶继续处理5 h后碘液未变蓝，说明玉米中的淀粉完全转化为糖。
纱布过滤于烧杯中，并重复过滤几次，用糖度计测量含糖量为14.2 g/100 ml、14.5 g/100 ml，经滤纸过滤后的清夜含糖量为12.4 g/100 ml，经计算加入蔗糖调至15 g/100 ml过夜培养。
2.3pH值变化在发酵过程中，每隔24 h测定一次pH值，以确定发酵的终点。
表2.3.1 pH值变化发酵时间（h）培养瓶编号及pH值0 3(6.0) 5(6.0) 10(6.0)24 2(5.5) 8(6.0 ) 18(6.0)48 9(5.0) 17(5.0) 24(5.0)72 7(4.4) 12(4.6) 16(4.8)96 4(3.8) 11(3.6) 22(4.0)末4(3.0) 17(2.5) 20(4.0)从表中可以看出，随着时间的推移，pH下降，说明菌在持续产酸。
实际的发酵时应当在pH下降到1.5以下时加入少量的CaCO3以中和酸，保证黑曲霉的生长环境。
2.4柠檬酸含量测定结果通过每24 h取一次样，用NaOH进行酸碱滴定，计算获得柠檬酸的含量。
图2.4.1柠檬酸含量变化曲线由柠檬酸含量变化曲线可以看出，随着时间的推移，柠檬酸含量呈现上升的趋势。