柠檬酸工艺

柠檬酸的提取、分离、鉴定

生物111 201100606027 何远升

一、钙盐法提取柠檬酸

钙盐法生产柠檬酸工艺流程为：发酵液→过滤(除去菌体和残渣)→中和过滤(中和剂石灰乳)→柠檬酸钙盐→硫酸酸解、过滤→粗酸液→净化→浓缩结晶→离心→干燥→柠檬酸晶体。

1. 发酵液热处理

将发酵液煮沸5min,然后搅拌降温至80℃。80℃下,发酵液用两层医用纱布过滤,除去其中的菌丝体、薯干粉渣等较大的固体杂质。然后用80℃热水洗涤滤饼,使菌体中的柠檬酸释放出来。离心取上清液。量筒计量出上清液的体积V0准确量取5mL上清液，量取5mL清液、5mL蒸馏水于锥形瓶中，再滴入2～3滴酚酞指示剂，用标准NaOH 溶液滴定，滴定终点为淡红色，30s内不褪色，记下消耗的NaOH 溶液体积V1；

M柠檬酸（g）＝V1(mL)×c(NaoH)×0.001×1/3×210×V0 /5

2. 碳酸钙中和沉淀

钙盐法主要的化学反应步骤有两步:中和与酸解。其中,中和又可以采用两种方法: 中和:

2C6H8O7·H2O+ 3CaCO3→Ca3(C6H5O7)2·4H2O↓+ 3CO2↑+H2O 酸解:

Ca3(C6H5O7)2·4H2O↓+ 3H2SO4+H2O→2C6H8O7·H2O+ 3CaSO4·H2O

柠檬酸与碳酸钙发生中和反应，形成难溶的柠檬酸钙沉淀，碳酸钙的添加量根据滤液中柠檬酸的重量添加，比例约为柠檬酸：碳酸钙=2.1：1。边搅拌边缓慢加入碳酸钙，以防止产生大量气泡。碳酸钙加完后放置90℃恒温水浴中加热，保温搅拌30分钟，趁热过滤，并用沸水洗涤柠檬酸钙沉淀。

3. 酸解

将柠檬酸钙沉淀物取出，称量，加入2倍量的水，调匀，加入浓硫酸溶液，硫酸的添加量根据碳酸钙的量计算，碳酸钙与硫酸的摩尔比为1：1.5。加完硫酸后，搅拌30分钟，过滤，得清亮的棕黄色液体，取样测定柠檬酸的含量，并准确计量柠檬酸液体积。

4. 过滤、脱色

先吸附脱色再过滤:在一次滤液中加入3%(W/'V)的活性炭,80℃水浴中恒温搅拌30min,然后真空抽滤,除去活性炭与其它杂质。

5.离子交换

（1）树脂的预处理

用去离子水浸泡过夜，并洗至去离子水近无色，装入色谱柱，用5倍体积量2%的氢氧化钠冲洗树脂柱，使树脂转化为钠型，并用去离子水洗至流出液近中性;最后用5倍体积量2mol/L盐酸冲洗树脂柱，使树脂转化为氢型，并用去离子水洗至流出液近中性，备用。（2）上样

将滤液沿着柱壁缓慢加入到树脂柱中，使其按照一定的流速流经树脂柱。

（3）洗涤

用蒸馏水将留在交换柱中不发生交换作用的阳离子洗出。

（4）洗脱

用4M HCl 将被树脂柱交换的柠檬酸根洗脱出来，形成柠檬酸。

（5）洗脱液收集

当流出液pH为4时，表示有柠檬酸流出，开始收集。

6．准确取样测定柠檬酸的含量，量取5mL洗脱液，再滴入2～3滴酚酞指示剂，用已经标定过的NaoH溶液标定，滴定终点为淡红色，30s内不褪色，

二、纸层析法分离鉴定柠檬酸

2.1.1 展开滤纸的准备

新华3 号层析滤纸，裁成30cm×20cm 备用，注意使短边的方向和滤纸的纤维方向一致.在距滤纸的长边一侧2cm 处用铅笔划一直线，在该直线上均匀分布各点样点.

样品的制备:准确称取0.3g分析纯的柠檬酸,溶解后定容至100mL,即得3g/L的柠檬酸溶液,发酵液预处理后所得滤液浓度约为100留L,将其稀释30倍使用。

展开剂(体积比):正丁醇:甲酸:水:冰醋酸=4:1:4:1

显色剂:准确称取2g分析纯的澳甲酚绿,将其溶于95%的乙醇中,然后定容至1000mL 2.1.2 点样及展开方式

用铅笔在距滤纸边线2cm 左右划一直线（称为原线），线上每隔2cm 划一圆点（称为原点）.然后用毛细管吸取样品液点在原点，样品点的直径约0.3cm--0.5cm，点样量约为5ug—30ug.点样采取少量多次点样，每次点样的位置应完全重合，以免出现斑点畸形现象.

点样后、展开前，先将滤纸与层析缸用配好的展开溶液的蒸汽来饱和，以免造成展开体系的组分发生改变，影响层析效果.平衡结束后，将滤纸靠近点样点的一端浸入展开剂，展开液面距离原线距离约1cm，开始展开.当展开液到达距离滤纸的另一端1cm--2cm 处时，展开结束

2.4 显色

展开结束后，取出滤纸，自然晾干.用2g/L 的溴甲酚绿- 乙醇溶液作为显色剂，显色剂中加入0.1mol/L 的NaOH 调成蓝绿色，用喷雾法进行显色.在喷显色剂时，必须在整张滤纸上喷洒均匀，而且用量要适度，然后在100℃下烘干即可.由于溴甲酚绿遇酸呈黄色"遇碱呈深蓝色，所以得到的纸色谱为蓝色（或绿色）背景下的黄色斑点.