中空纤维膜过滤技术在单抗生产中的应用

中空纤维膜过滤技术在单抗生产中的应用

苗景赟孙文改解红艳 (通用电气医疗集团 GE HC Life Sciences)

作为生物药物的“重磅炸弹”，大规模动物细胞培养生产治疗用单抗已成为生物制药发展的主导。Mabselect SuRe亲和层析结合Capto Adhere复合离子交换两步层析工艺已经成为抗体生产工艺的亮点，而中空纤维膜过滤技术是一种快速高效的膜分离技术，具有容尘量高、温和低剪切力、操作灵活、成本低、易于放大等优点，因此广泛应用于重组蛋白、疫苗等生物制药领域。通过将中空纤维膜过滤技术和下游两步层析工艺相结合，可以成功的迎接几十甚至上百公斤单抗生产所面临的挑战。

1.单抗的发展和面临的挑战

近年来，高密度细胞培养技术和大规模蛋白质生产纯化技术的不断进步，推动了治疗用抗体产业化的发展。和传统的基因工程蛋白药物相比，治疗用单抗具有一些不同的特点：(1) 高剂量

单抗的给药剂量较高，一般从数百毫克到克级，且给药方式多为静脉注射。因此，抗体的生产规模和产品质量都面临着巨大挑战。

为了满足日益增长的高剂量抗体药物需求，大规模细胞培养技术不断发展：细胞密度已达107 ~ 108 cell/ml；表达量从1~5g/L增加到>10g/L，甚至出现27g/L的表达量新高1；细胞培养规模从上千升增加到20,000升。这就要求开发一条高速、高载量的下游分离纯化工艺，以便能够快速处理上万升的培养液，并实现每批几十公斤甚至上百公斤抗体的生产。另外，高的给药剂量也对产品质量提出了更高的要求。为了保证药品安全，很多杂质成分必需降低到极低水平，如宿主DNA，内毒素等；潜在的病毒、泄漏的亲和配基以及抗体的聚集体也必须有效去除，这就要求采用更高效的分离纯化工艺，并对每步工艺去除各种杂质的能力进行深入研究。

(2) 易形成多种变体

抗体是一类结构比较复杂的大分子，比活和稳定性很大程度上取决于其翻译后修饰的程度，如糖基化、磷酸化等。在生产过程中会由于糖基化程度不同、蛋白酶作用、以及脱氨基和脱酰胺等化学反应而产生性质不同的多种抗体变体2；另外，氧化、聚集和片段化也是常见的降解途径。针对这些变体，在表达和纯化过程中选择参数 (如pH、盐浓度等) 时要充分考虑到抗体的稳定性；另外，应严格控制细胞培养的条件，如溶氧、渗透压等3；同时加快下游分离纯化的速度，最大程度避免抗体在纯化过程中产生变体，保证终产品的均一性和高比活，也有利于控制终产品的内毒素水平。

(3) 高附加值

作为多种癌症和抗排异的特效药，高纯度的治疗用抗体具有极高的市场价值。因此收率成为抗体生产过程中的重要考量指标。减少不必要的工艺步骤不仅可以提高收率，还能提高生产效率。

基于抗体药物的上述特点，为了提高生产效率，达到严格的产品质量要求，抗体的生产工艺也必须着眼于：高处理速度、高载量，更简单有效！

通用电气医疗集团为单抗生产提供了快速高效的完整解决方案（图1），将中空纤维膜过滤技术和高流速高载量的新一代Mabselect SuRe亲和层析介质、Capto Adhere两步层析工艺相结合，成为治疗用抗体生产纯化的趋势4。

注射用抗体

图1治疗用单抗的一般生产工艺流程

Mabselect SuRe亲和层析介质采用改造过的新型SuRe配基，可以耐受0.1-0.5M NaOH的反复在位清洗5。可以避免抗体产品批间交叉污染，显著降低内毒素水平，也有利于延长层析介质寿命，降低CIP/SIP的成本。R.Hahn6发现，与其他蛋白A亲和层析介质相比，Mabselect SuRe具有无可比拟的稳定性，配基脱落最少，寿命最长，宿主蛋白HCP的残留比玻璃基架的蛋白A介质低10倍以上。

Mabselect SuRe和Capto Adhere采用高流速琼脂糖骨架，专为大规模层析柱的装填而设计，可以在高流速下仍保持高动态载量和较低的反压，尤其适于自动装填大规模层析柱以快速处理上万升细胞培养液，如图2。

图2大型工业层析柱的自动化填装

2.中空纤维膜分离技术

2.1切向流过滤技术简介

膜过滤技术，又称膜分离技术，是采用具有一定孔径的高分子聚合物，根据体积大小对不同的物质进行筛分的物理分离手段。膜分离技术在生物药物生产过程中扮演着重要角色，尤其近二十年来，膜分离技术发展迅速，不断出现新的膜结构、材质以及操作方式，以满足生物制药日益增长的需求。

切向流技术（Tangential Flow Filtration, TFF ）又称错流过滤（Cross-Flow Filtration ，CFF ），其操作原理如图3：料液以一定的流速在膜表面循环，小于膜孔径的物质可以透过膜到透过端，而大于膜孔径的物质会被膜截留，从而实现不同物质的分级分离。

5，料液/缓冲液补料口

4，Permeate （透过端）压力表

3，Retentate （回流端）压力表

2，Feed （入口端）压力表

1，料液储罐

图3 切向流过滤示意图

切向流过滤膜按孔径可分为超滤膜和微滤膜：孔径较小的超滤膜常用于蛋白质的浓缩；而孔径较大的微滤膜( 如 0.45μ )常用于培养液中细胞和细胞碎片的去除，实现层析前料液的澄清。

由于切向流过滤技术引入了平行于过滤膜表面的切向流速(Crossflow)，在过滤过程中对膜表面不断进行冲刷，一定程度上可以缓解浓度极化层(Concentration Polarization Layer)和滤饼(Filter Cake)的形成，从而降低过滤阻力(Filtration Resistance)，提高单位膜面积的处理量和过滤速度。

2.2中空纤维膜分离技术

中空纤维膜采用切向流过滤的方式，其膜组件结构如图4所示：一定孔径的膜 (如0.45 μ) 制成纤维状的膜管结构，细胞培养液在膜管的内部流过形成切向流，目标抗体透过膜孔，而细胞和细胞碎片被截留，收集透过端(permeate)即得到澄清的培养液。

图4 中空纤维膜开放式的流道结构

Robert van Reis 等人早在90年代初就进行了0.2 μ中空纤维膜澄清CHO细胞培养液生产 rt-PA的研究8，并放大到180平方米的中空纤维膜系统处理12,000L细胞培养液，澄清收率99%，每平米膜每小时平均处理速度达27升。此外，细胞培养液在处理前后，总细胞密度