第九章 基因诊断
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是最经典的基因分析方法，不但能检出特异 的DNA片段，而且能进行定量和测定分子 量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变 分析等。
Northern杂交
用于RNA的检测，能对组织细胞中总RNA 或mRNA进行定性和定量分析。
斑点杂交（Dot blot）
可用基因组中特定基因及其表达的定性及定 量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量 少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量， 特异性不高，有一定比例的假阳性。
不能得知病原体进入体内后机体的反应
二、基因诊断的感染性疾病
（一）、病毒 特点： 1. 分离培养—周期长，操作繁杂，制约因素多 2. 电镜观察—直观快速，但昂贵 3. 免疫学诊断—简便快速，但存在问题： 不易检出潜伏期的病毒 有些病毒亚型多，抗原变异性大 整合进入人基因组的病毒
病毒核酸分析技术
HBV—包含4个开放阅读框，S、C、P、X PCR PCR/限制性内切酶谱分析 PCR/点杂交, PCR/Southern blot 基因芯片
目的基因 引物序列 扩增片段
C
5’ACTGTTCAAGCCTCCAAGCT3’ 425 bp 5’AGTGCGAATCCACACTC3’
*HIV病毒基因组结构
长末端 重复序列
正常的病毒基因
调节蛋白基因
LTR
gag
pol
env
tat，rev LTR
调节和 产生病毒 启动转录 核心蛋白
产生逆转录 产生病毒 附加基因 酶和整合酶 外膜蛋白
即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链
解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形
成双链结构。因此应用已知碱基序列的单链核
苷酸片段作为探针，就可检测样本中是否存在
与其互补的同源核苷酸序列。
probe
probe
核酸杂交的关键要素
probe DNA target DNA signal detection
利用PCR/ASO探针法诊断苯丙 酮尿症
▽ ◎ ▽
正常探针 突变探针
△
▲
wk.baidu.com
○
◎
●
△健康男性 ○健康女性
▽男性携带者 ◎女性携带者
▲男性患者 ●女性患者
第三节 肿瘤的基因诊断
肿瘤基因诊断的策略
1 通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤 慢粒：（染色体易位）费城染色体 PCR检测融合基因 检测肿瘤相关基因
（一）DMD分子基础：
抗肌萎缩蛋白基因长约2900kb，含79个外显 子。抗肌萎缩蛋白基因突变分为基因缺失型和非 基因缺失型。 （1）DNA片段缺失（60%的病例→导致阅读框移 码→移码实变→致DMD，整码缺失→BMD）。缺 失的2个热点区①该基因5’端处②45~55外显子范 围内。 （2）非基因缺失型部分重复（病例的5%）
寡核苷酸杂交分析 SNP和等位基因特 异寡核苷酸杂交 （ASO）#
（三） DNA序列测定
DNA序列测定是进行基因突变检测的 最直接、最准确的方法，可以确定突 变的部位，突变的性质。
（四 ） DNA芯片技术
应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变 多态性，对基因表达的情况进行分析。
二 基因诊断的特点
正常人 左侧缺 失患者 右侧缺 失患者
+
四、杜氏肌营养不良症（DMD）
1. DMD是常见的性连锁隐性遗传病， 2. 主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性 肥大，XP21.21—21.3区抗肌萎缩蛋白基 因突变形式不同。 DMD多在5岁发病，10岁左右瘫痪， 在20岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡， 其发病率为活产男婴的1/3500。
PCR/核酸杂交诊断艾滋病
目的基因 引物序列
扩增片段
env
5’ACAATTATTGTCTGGTATAG3’ 135 bp 5’AGGTATCTTTCCACAGCCAG3’ HIV-1
（一） β地贫病的分子基础
β珠蛋白基因全长2053bp，含2个内含子 （IVS－I和IVS-II），3个外显子。 目前发现突变有百余种，中国人群发现约 20种； 一般对特定种族来说，90%的β地贫基因仅 由4～6种突变组成。
（二） β地中海贫血的基因诊断
PCR/ASO斑点杂交法 合成2对PCR引物（扩增区段700bp和 580bp，分别包含14种和1种可能突变）→ 合成等位特异寡核苷酸(ASO)探针（4～6对， 分别标记） →制备DNA样品 →PCR扩增 →斑点印迹杂交 RFLP分析法
1. PCR—SSCP 2. PCR—测序 3. PCR—RFLP
㈢ 其它基因的 检测
PCR结合其它技术 基因芯片
4、肿瘤标志物检测或mRNA诊断
肿瘤标志物 是由肿瘤组织细胞产生的、与肿瘤形成和 发展相关的物质，包括肿瘤抗原、激素、酶、 同工酶等。 基因标志和基因表型标志（胚胎性抗原）
检测方法：
直接采用PCR进行基因诊断 采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析（PCRRFLPs）进行基因诊断 采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO） 斑点杂交进行基因诊断 * 通过PCR产物的反相点杂交(RBD)进行基因诊断 采用PCR产物的单链构象多态性(SSCP)分析进行基 因诊断 采用PCR技术对靶核酸进行定量分析
引物1
MstⅡ酶切位点 (CCTNAGG) 引物2
CCT GAG GAG 103bp 191bp 294bp 引物1
CCT GTG GAG 引物2
镰状红细胞贫血患者PCR产物的限制性酶切分析 294bp 191bp
﹣
103bp
正常人 突变携带着 患者
+
镰状细胞贫血的基因诊断方法
RT-PCR/序列分析
高特异性 高灵敏度
获得稳定的结果
早期快速 适用性强，应用范围广
第二节 遗传病的基因诊断
一、概述
人类的遗传病达数千种 地中海贫血在意大利等国家发病率达10％ 镰状细胞贫血在美国黑人中发病率达14％ 我国常见的遗传性疾病有地中海贫血、异 常血红蛋白病和血友病。 有效治疗难；通过基因诊断进行携带者筛 查，产前早期诊断，降低发病率。
原位杂交
（Colony in situ hybridization）
可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾 病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序
列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的
具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可 检出基因和基因产物的亚细胞定位。
（二）利用PCR及结合其他技术进行 基因诊断
采集制备血液RNA→RT-PCR→产物测序→推 测氨基酸序列→进行诊断
二、β－地中海贫血 (β－Thalassaemia,简写βthal或βT)
β珠蛋白基因突变导致该多肽链的合成大为减少
（β＋）或完全缺失（β0） β珠蛋白合成速率降低，导致β链和α链合成的不 平衡→多余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上→改变 了膜的通透性和硬度→导致溶血性贫血。 高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人； 中国人群中又一广东、广西、四川、贵州等省发 病率最高。 缺乏有效治疗措施。
癌基因（ras）、抑癌基因（ p53）、肿瘤转移基因
2 3
检测肿瘤相关病毒基因 HBV HCV－肝癌 EB－鼻咽癌
4
检测肿瘤标志物基因或mRNA
肝癌—甲胎蛋白（AFP） 结肠癌—癌胚抗原（CEA）
引物A
1. 肿瘤标记物基因的检测
bcr-mRNA
染色体 22 着丝粒 染色体 9 c- abl gene bcr gene
1.35kb
﹣
1.15kb
0.2kb
正常人 突变携带着 患者
+
镰状细胞贫血的基因诊断方法
PCR/限制性内切酶 设计引物→PCR扩增→产物进行限制性内切酶酶 切→电泳→EB染色→直接观察 例： 引物1：5’-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-3’ 引物2：5’-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-3’ 扩增产物294bp
五、苯丙酮尿症（PKU）
1、苯丙酮尿症是一种常见的隐性遗传性氨基酸代谢病。 2、主要特征： （1）苯丙氨酸
苯丙氨酸 羟化酶↓ （肝）
酪氨酸→多巴→儿茶酚胺
苯丙酮酸 酪胺 黑色素 （2）患儿出生后须及早得到低phe饮食治疗，否则发生 不可逆大脑损害和严重智力发育障碍。
（一 ） PKU分子基础
（1）迄今约3/4的导致中国人PKU的突变基因已 被查清 ，它们分属11种PAH基因点突变。体外 研究表明，这些突变导致PAH活力↓或丧失。 （2）PAH第11外显子的第399密码GTA（val） →GTT（val）中性突变：①不改变任何限制酶 识别位点，故又称“序列多态性”。②这一 “序列多态性”在PKU患者和正常人中存在着 连锁不平衡性， 故可作为一种“遗传标记”应 用于产前诊断。
二、镰状细胞贫血
血红蛋白病（异常血红蛋白病） 红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫 血。 患者多在成年以前死亡
（一）镰状红细胞贫血分子机制
MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)
5´ 1.15kb 3´
×
5´ 1.35kb
5 6 7 正常基因 --Pro Glu Glu— --CCT GAG GAG-3´
第九章
基因诊断
第一节 基因诊断的概念 及常用技术
一、基本概念
基因诊断—利用分子生物学技术， 从DNA/RNA水平检测基因的存在, 分析基因的结构变异和表达状态， 从而对疾病作出诊断。
二、基因诊断常用方法
㈠ ㈡ ㈢ ㈣ 核酸分子杂交 PCR DNA序列测定 DNA芯片技术
(一)
核酸杂交
基本原理-------核酸变性和复性理论
三α地中海贫血的基因诊断
左侧缺失型 基因序列 •PCR扩增法——定性分析 α1
左侧缺失4.2kb 正常基 因序列
ac扩增0.4kb ab无扩增片段
a α2
右侧缺失型 基因序列
ab扩增1.2kb
b
c 右侧缺失 3.7kb
α1 a α2N端α1C端
b b
地中海贫血患者基因组的PCR分析
﹣
1.2kb
0.4kb
1. 2. 3. 4. PCR—ASO PCR—测序 PCR—RFLP PCR－SSCP
第四节 感染性疾病的 基因诊断
一、感染性疾病基因 诊断的策略
1. 针对病原体特异的核酸序列设计探针进
行杂交 2. 应用PCR技术扩增病原体基因保守序列 3. 核酸杂交技术与PCR技术联合应用
特点
简便、特异、快捷 能检测出潜在的病原体 可对病原体进行分类、分型鉴定
（1）基因组探针法 用XP21区分离得到的不同探针如（P20）来进行相应内 切酶酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。 （2）cDNA探针法 抗肌萎缩蛋白基因系列cDNA探针分析患者基因缺失、 外显子拼接改变和基因内部分重复。 （3）多重PCR法 如有人设计多对引物进行多重PCR扩增该基因的9个易 发缺失“热点区”DNA片段，可检出80%有基因缺失的 DMD患者。 （4）多态性分析法 基因内及其旁侧探针进行RFLP连锁分析。 （5）RT—PCR扩增该基因外显子（全长2.4MB、外显子起 来全长c14kb、用多对引物）可检出：外显子拼接异常。 联用测序：可定位基因缺失的起始和终止。
5 6 7 --Pro Ala Glu— --CCT GTG GAG--
突变基因
（二）镰状细胞贫血的基因诊断方 法
限制性内切酶/Southern blot
采集制备血液DNA→内切酶MstⅡ消化→电 泳→转膜→32P标记的β 珠蛋白cDNA杂交→ 放射自显影
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
引物 B
染色体 9, 22
bcr-abl mRNA
慢性骨髓白血病
bcr-abl 融合蛋白（具PTK活性）
2
癌基因和抑癌基因的检测
㈠ras癌基因的检测
ras基因中最常见的点突变是第12，13或61密码 子突变 检测方法： 1. PCR/ASO 2. PCR-SSCP
㈡ p53的检测 p53基因突变主要为点突变，热点区域位于密 码子130~290，以175、273、284最多见 检测方法：
（二）PKU的DNA诊断
①PCR/ASO探针法和PCR-RFLP连锁分 析法。 ②PCR/SSCP ③直接测序法—若待诊断的PKU家系的基 因突变类型尚属“未知”或无RFLP信 息。
利用PCR/ASO探针法诊断苯丙 酮尿症
先合成ASO 如： 正常探针： TCCATTAACAGTAAGAATTT 突变探针： TCCATTAACAATAAGAATTT
核酸杂交方法分类
按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交
两种类型。
固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固 体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。 液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液 中。
固相杂交分类
Southern 印记杂交 Northern 印记杂交 斑点杂交 原位杂交
Southern blot
Northern杂交
用于RNA的检测，能对组织细胞中总RNA 或mRNA进行定性和定量分析。
斑点杂交（Dot blot）
可用基因组中特定基因及其表达的定性及定 量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量 少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量， 特异性不高，有一定比例的假阳性。
不能得知病原体进入体内后机体的反应
二、基因诊断的感染性疾病
（一）、病毒 特点： 1. 分离培养—周期长，操作繁杂，制约因素多 2. 电镜观察—直观快速，但昂贵 3. 免疫学诊断—简便快速，但存在问题： 不易检出潜伏期的病毒 有些病毒亚型多，抗原变异性大 整合进入人基因组的病毒
病毒核酸分析技术
HBV—包含4个开放阅读框，S、C、P、X PCR PCR/限制性内切酶谱分析 PCR/点杂交, PCR/Southern blot 基因芯片
目的基因 引物序列 扩增片段
C
5’ACTGTTCAAGCCTCCAAGCT3’ 425 bp 5’AGTGCGAATCCACACTC3’
*HIV病毒基因组结构
长末端 重复序列
正常的病毒基因
调节蛋白基因
LTR
gag
pol
env
tat，rev LTR
调节和 产生病毒 启动转录 核心蛋白
产生逆转录 产生病毒 附加基因 酶和整合酶 外膜蛋白
即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链
解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形
成双链结构。因此应用已知碱基序列的单链核
苷酸片段作为探针，就可检测样本中是否存在
与其互补的同源核苷酸序列。
probe
probe
核酸杂交的关键要素
probe DNA target DNA signal detection
利用PCR/ASO探针法诊断苯丙 酮尿症
▽ ◎ ▽
正常探针 突变探针
△
▲
wk.baidu.com
○
◎
●
△健康男性 ○健康女性
▽男性携带者 ◎女性携带者
▲男性患者 ●女性患者
第三节 肿瘤的基因诊断
肿瘤基因诊断的策略
1 通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤 慢粒：（染色体易位）费城染色体 PCR检测融合基因 检测肿瘤相关基因
（一）DMD分子基础：
抗肌萎缩蛋白基因长约2900kb，含79个外显 子。抗肌萎缩蛋白基因突变分为基因缺失型和非 基因缺失型。 （1）DNA片段缺失（60%的病例→导致阅读框移 码→移码实变→致DMD，整码缺失→BMD）。缺 失的2个热点区①该基因5’端处②45~55外显子范 围内。 （2）非基因缺失型部分重复（病例的5%）
寡核苷酸杂交分析 SNP和等位基因特 异寡核苷酸杂交 （ASO）#
（三） DNA序列测定
DNA序列测定是进行基因突变检测的 最直接、最准确的方法，可以确定突 变的部位，突变的性质。
（四 ） DNA芯片技术
应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变 多态性，对基因表达的情况进行分析。
二 基因诊断的特点
正常人 左侧缺 失患者 右侧缺 失患者
+
四、杜氏肌营养不良症（DMD）
1. DMD是常见的性连锁隐性遗传病， 2. 主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性 肥大，XP21.21—21.3区抗肌萎缩蛋白基 因突变形式不同。 DMD多在5岁发病，10岁左右瘫痪， 在20岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡， 其发病率为活产男婴的1/3500。
PCR/核酸杂交诊断艾滋病
目的基因 引物序列
扩增片段
env
5’ACAATTATTGTCTGGTATAG3’ 135 bp 5’AGGTATCTTTCCACAGCCAG3’ HIV-1
（一） β地贫病的分子基础
β珠蛋白基因全长2053bp，含2个内含子 （IVS－I和IVS-II），3个外显子。 目前发现突变有百余种，中国人群发现约 20种； 一般对特定种族来说，90%的β地贫基因仅 由4～6种突变组成。
（二） β地中海贫血的基因诊断
PCR/ASO斑点杂交法 合成2对PCR引物（扩增区段700bp和 580bp，分别包含14种和1种可能突变）→ 合成等位特异寡核苷酸(ASO)探针（4～6对， 分别标记） →制备DNA样品 →PCR扩增 →斑点印迹杂交 RFLP分析法
1. PCR—SSCP 2. PCR—测序 3. PCR—RFLP
㈢ 其它基因的 检测
PCR结合其它技术 基因芯片
4、肿瘤标志物检测或mRNA诊断
肿瘤标志物 是由肿瘤组织细胞产生的、与肿瘤形成和 发展相关的物质，包括肿瘤抗原、激素、酶、 同工酶等。 基因标志和基因表型标志（胚胎性抗原）
检测方法：
直接采用PCR进行基因诊断 采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析（PCRRFLPs）进行基因诊断 采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO） 斑点杂交进行基因诊断 * 通过PCR产物的反相点杂交(RBD)进行基因诊断 采用PCR产物的单链构象多态性(SSCP)分析进行基 因诊断 采用PCR技术对靶核酸进行定量分析
引物1
MstⅡ酶切位点 (CCTNAGG) 引物2
CCT GAG GAG 103bp 191bp 294bp 引物1
CCT GTG GAG 引物2
镰状红细胞贫血患者PCR产物的限制性酶切分析 294bp 191bp
﹣
103bp
正常人 突变携带着 患者
+
镰状细胞贫血的基因诊断方法
RT-PCR/序列分析
高特异性 高灵敏度
获得稳定的结果
早期快速 适用性强，应用范围广
第二节 遗传病的基因诊断
一、概述
人类的遗传病达数千种 地中海贫血在意大利等国家发病率达10％ 镰状细胞贫血在美国黑人中发病率达14％ 我国常见的遗传性疾病有地中海贫血、异 常血红蛋白病和血友病。 有效治疗难；通过基因诊断进行携带者筛 查，产前早期诊断，降低发病率。
原位杂交
（Colony in situ hybridization）
可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾 病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序
列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的
具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可 检出基因和基因产物的亚细胞定位。
（二）利用PCR及结合其他技术进行 基因诊断
采集制备血液RNA→RT-PCR→产物测序→推 测氨基酸序列→进行诊断
二、β－地中海贫血 (β－Thalassaemia,简写βthal或βT)
β珠蛋白基因突变导致该多肽链的合成大为减少
（β＋）或完全缺失（β0） β珠蛋白合成速率降低，导致β链和α链合成的不 平衡→多余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上→改变 了膜的通透性和硬度→导致溶血性贫血。 高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人； 中国人群中又一广东、广西、四川、贵州等省发 病率最高。 缺乏有效治疗措施。
癌基因（ras）、抑癌基因（ p53）、肿瘤转移基因
2 3
检测肿瘤相关病毒基因 HBV HCV－肝癌 EB－鼻咽癌
4
检测肿瘤标志物基因或mRNA
肝癌—甲胎蛋白（AFP） 结肠癌—癌胚抗原（CEA）
引物A
1. 肿瘤标记物基因的检测
bcr-mRNA
染色体 22 着丝粒 染色体 9 c- abl gene bcr gene
1.35kb
﹣
1.15kb
0.2kb
正常人 突变携带着 患者
+
镰状细胞贫血的基因诊断方法
PCR/限制性内切酶 设计引物→PCR扩增→产物进行限制性内切酶酶 切→电泳→EB染色→直接观察 例： 引物1：5’-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-3’ 引物2：5’-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-3’ 扩增产物294bp
五、苯丙酮尿症（PKU）
1、苯丙酮尿症是一种常见的隐性遗传性氨基酸代谢病。 2、主要特征： （1）苯丙氨酸
苯丙氨酸 羟化酶↓ （肝）
酪氨酸→多巴→儿茶酚胺
苯丙酮酸 酪胺 黑色素 （2）患儿出生后须及早得到低phe饮食治疗，否则发生 不可逆大脑损害和严重智力发育障碍。
（一 ） PKU分子基础
（1）迄今约3/4的导致中国人PKU的突变基因已 被查清 ，它们分属11种PAH基因点突变。体外 研究表明，这些突变导致PAH活力↓或丧失。 （2）PAH第11外显子的第399密码GTA（val） →GTT（val）中性突变：①不改变任何限制酶 识别位点，故又称“序列多态性”。②这一 “序列多态性”在PKU患者和正常人中存在着 连锁不平衡性， 故可作为一种“遗传标记”应 用于产前诊断。
二、镰状细胞贫血
血红蛋白病（异常血红蛋白病） 红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫 血。 患者多在成年以前死亡
（一）镰状红细胞贫血分子机制
MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)
5´ 1.15kb 3´
×
5´ 1.35kb
5 6 7 正常基因 --Pro Glu Glu— --CCT GAG GAG-3´
第九章
基因诊断
第一节 基因诊断的概念 及常用技术
一、基本概念
基因诊断—利用分子生物学技术， 从DNA/RNA水平检测基因的存在, 分析基因的结构变异和表达状态， 从而对疾病作出诊断。
二、基因诊断常用方法
㈠ ㈡ ㈢ ㈣ 核酸分子杂交 PCR DNA序列测定 DNA芯片技术
(一)
核酸杂交
基本原理-------核酸变性和复性理论
三α地中海贫血的基因诊断
左侧缺失型 基因序列 •PCR扩增法——定性分析 α1
左侧缺失4.2kb 正常基 因序列
ac扩增0.4kb ab无扩增片段
a α2
右侧缺失型 基因序列
ab扩增1.2kb
b
c 右侧缺失 3.7kb
α1 a α2N端α1C端
b b
地中海贫血患者基因组的PCR分析
﹣
1.2kb
0.4kb
1. 2. 3. 4. PCR—ASO PCR—测序 PCR—RFLP PCR－SSCP
第四节 感染性疾病的 基因诊断
一、感染性疾病基因 诊断的策略
1. 针对病原体特异的核酸序列设计探针进
行杂交 2. 应用PCR技术扩增病原体基因保守序列 3. 核酸杂交技术与PCR技术联合应用
特点
简便、特异、快捷 能检测出潜在的病原体 可对病原体进行分类、分型鉴定
（1）基因组探针法 用XP21区分离得到的不同探针如（P20）来进行相应内 切酶酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。 （2）cDNA探针法 抗肌萎缩蛋白基因系列cDNA探针分析患者基因缺失、 外显子拼接改变和基因内部分重复。 （3）多重PCR法 如有人设计多对引物进行多重PCR扩增该基因的9个易 发缺失“热点区”DNA片段，可检出80%有基因缺失的 DMD患者。 （4）多态性分析法 基因内及其旁侧探针进行RFLP连锁分析。 （5）RT—PCR扩增该基因外显子（全长2.4MB、外显子起 来全长c14kb、用多对引物）可检出：外显子拼接异常。 联用测序：可定位基因缺失的起始和终止。
5 6 7 --Pro Ala Glu— --CCT GTG GAG--
突变基因
（二）镰状细胞贫血的基因诊断方 法
限制性内切酶/Southern blot
采集制备血液DNA→内切酶MstⅡ消化→电 泳→转膜→32P标记的β 珠蛋白cDNA杂交→ 放射自显影
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
引物 B
染色体 9, 22
bcr-abl mRNA
慢性骨髓白血病
bcr-abl 融合蛋白（具PTK活性）
2
癌基因和抑癌基因的检测
㈠ras癌基因的检测
ras基因中最常见的点突变是第12，13或61密码 子突变 检测方法： 1. PCR/ASO 2. PCR-SSCP
㈡ p53的检测 p53基因突变主要为点突变，热点区域位于密 码子130~290，以175、273、284最多见 检测方法：
（二）PKU的DNA诊断
①PCR/ASO探针法和PCR-RFLP连锁分 析法。 ②PCR/SSCP ③直接测序法—若待诊断的PKU家系的基 因突变类型尚属“未知”或无RFLP信 息。
利用PCR/ASO探针法诊断苯丙 酮尿症
先合成ASO 如： 正常探针： TCCATTAACAGTAAGAATTT 突变探针： TCCATTAACAATAAGAATTT
核酸杂交方法分类
按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交
两种类型。
固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固 体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。 液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液 中。
固相杂交分类
Southern 印记杂交 Northern 印记杂交 斑点杂交 原位杂交
Southern blot