临床免疫学：第七章 免疫比浊技术
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免疫比浊检验技术原理与进展 ppt课件
PPT课件
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3、免疫学检测技术
凝集放射性核素标记 酶标记、荧光标记和胶 体金标记 化学发光物标记或偶联 化学发光反应
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标记免疫检测技术
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二、免疫沉淀
凝集：细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质 参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为凝集反应 （agglutination）是最经典的免疫学检测技术。
PPT课件
8
半抗原 +
载体
完全抗原
B B B
B Th
Th
抗体
半抗原—载体效应示意图
PPT课件 半抗原 + 蛋白质（载体） ＝ 完全抗原 9
1、抗原与抗体
抗原决定簇：抗原分子存在的能TCR/BCR或抗体Fab片 段特异性结合的特殊化学基团，是免疫应答特异性的 物质基础。 构象决定簇 ：构象决定簇（conformational determinant） 由空间构象形成的决定簇，序列上不连续。 顺序决定簇：顺序决定簇（sequence determinant），又 称线性决定簇（linear determinant），序列相连续的 氨基酸肽片段构成的决定簇。 抗原结合价：抗原结合价（antigenic valence）是指能够 与抗体分子结合的决定簇数目。
免疫比浊分析技术原理与进展
PPT课件
1
免疫比浊检验技术原理与进展
一、免疫学基本原理 二、免疫沉淀 三、免疫比浊技术原理
PPT课件
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一、免疫学基本原理
1、抗原与抗体 2、抗原抗体的结合——免疫学反应 3、免疫学反应的检测技术
PPT课件
3
1、抗原与抗体
抗原（Antigen, Ag）是刺激机体产生免疫应 答的物质。 “应” 是指抗原刺激机体产生免疫应答产物-抗体或免疫效应细胞 “答” 是指相应抗原与免疫应答产物结合并 将其排除体外） 抗原的免疫原性和免疫反应性 完全抗原与半抗原 抗原表位与抗原结合价位
免疫比浊法
8
整理版ppt
实验材料
1.免疫球蛋白A,M,G（IgA, IgM, IgG）测定试剂 2.免疫球蛋白A,M,G （IgA, IgM, IgG）校准品，蒸馏水， 血清样本 3.微量加样枪、试管 4.分光光度仪、水浴箱
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实验方法 整理版ppt
空白管
+蒸馏水 （10mL）
校准管 +IgX试剂 37℃ （1mL） 5min
5
整理版ppt
实验原理
聚乙二醇即PEG是中性、无毒且具有独特理化性质和良 好的生物相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇具有高度的亲水 性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。
在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，如34％的聚乙二醇等，利用其破坏抗原抗体的水化层，促进其靠 近反应，但如浓度不适合，高了会影响其它溶质或产生非特 异性聚集影响结果。
实验 免疫比浊法检 测免疫球蛋白
整理版ppt
免 1疫 系
整理版ppt
1
实验原理
2
材料和方法
3
实验结果
2
整理版ppt
实验原理
免疫球蛋白（Ig）是指一类具有抗体样结构或具有抗体活性 的球蛋白，能与诱导其产生的抗原发生特异性结合，是体液免 疫应答的主要效应分子。免疫球蛋白水平增高常见于各种慢性 细菌感染，如慢性骨髓炎、慢性肺脓肿等。在多种自身免疫病、 肝脏疾病患者中可有IgG、IgA、IgM升高：在系统性红斑狼疮 患者中以IgG、IgA或IgG 、IgM升高较多见；在类风湿关节炎 中则以IgM升高为主。免疫球蛋白水平降低多见于先天性体液 免疫缺乏病、肾病综合症、吸收不良综合症、淋巴瘤、放射损 伤和免疫抑制剂治疗后等情况。
7
整理版ppt
免疫比浊分析
3.按log-logit转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线拟 合，制备剂量-反应曲线，由计算机处理，计算出抗原
浓度。
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（三）技术要求
• 待测的抗原抗体复合物分子量足够大。 • 抗原抗体复合物数量足够多。 • 具有充分的反应时间，只能测定抗原抗
体反应的第二阶段。 • 高亲和力的抗体，并保证抗体过量。
• A.测定光线通过反应混合液时，被其中IC反射的光的强度
• B.测定光线通过反应混合液时，被其中IC折射的光的强度
• C.测定光线通过反应混合液时，被其中IC吸收的光的强度 • D.测定光线通过反应混合液时，透过的光的强度
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• 4.单向琼脂扩散法可用于
• A.抗体定性 B.抗体定量
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技术要求
速率散射比浊法峰值出现的时间与抗体浓度
及纯度直接相关，需选用抗体纯度及亲和力交高的试 剂。
此外，要保证待测样本血清的性状符合要求， 如严重脂血等即为不合格样本。
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(三)方法评价
散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本法 自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密等优 点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的准确性。 但仪器和试剂价格比较贵, 对抗体的质量要求很高。
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2.仪器基本组成
系统由分析仪、计算机、条码读取器、打印 机四部分组成，其中分析仪是主要组成部分，包括
散射测浊仪、自动加样系统、运输装置和比色杯装置。
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BNⅡ、BN100特种蛋白分析分析系统
免疫学实验 免疫比浊(免疫球蛋白的测定)
3 免疫胶乳比浊法
原理
选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗 粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则 发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之 内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则 使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝 集成正比，与抗原量成正比。
（a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线； （b）结合后，则形成光线衰减
2. 海德堡（heidelberger）曲线理 论
2 抗体的质量
（1）特异性高 （2）效价高 （3）亲和力高 （4）抗血清来源
3 抗原抗体反应的溶液
• pH 6.5~8.5
• 电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）
4 增浊剂的使用
• PEG、tween-20等非离子型亲水 剂
• 作用：消除蛋白质分子周围的电子 云和水化层，促进抗原、抗体分子 靠近，结合形成大分子复合物。
（二）类型
1. 透射免疫比浊法 2. 散射免疫比浊法 3. 免疫胶乳比浊法
1 透射免疫比浊法
原理：
抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物 (IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复 合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减 少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线 吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物 的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量 成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出 待检抗原含量。
•
样本管吸光度
• 浓度＝————————×校准液浓度（g/L）
•
校管吸光度
• 结果及讨论
– 检测报告 – 检测意义
实验二、免疫浊度测定 ——免疫球蛋白检测
实验步骤见说明书 IgG9.77g/L IgA1.72g/L IgM1.37g/L
沉淀反应
微生物与免疫教研室
实验测试方法免疫比浊法原理
实验测试方法免疫比浊法原理免疫比浊法（immunoturbidimetry）是一种常用的实验测试方法，用于测定血清或尿液中特定分析物质的浓度。
它基于免疫学原理，通过测量可见光的散射程度来获得目标物质的浓度信息。
在实验中，样品中的目标物质与专门设计的抗原抗体反应，形成可见性沉淀物，从而引起溶液的浑浊程度的变化。
免疫比浊法的原理可以概括为以下几个步骤：1.抗原抗体反应：在实验开始前，需要将抗原抗体组分预先混合。
抗原可以是目标物质的衍生物或合成物，而抗体是特异性识别和结合抗原的蛋白质。
2.沉淀形成：向样品中加入混合的抗原抗体溶液，使其与样品中的目标物质相互作用。
当目标物质存在于样品中时，抗体会识别并与其结合，形成可见性沉淀物。
3.光散射测量：实验中使用的光散射测量器可以测量光线通过沉淀物混浊的溶液时的散射程度。
目标物质的浓度越高，形成的沉淀物越多，溶液的浑浊程度越高，从而引起更强的散射。
4.标准曲线计算：为了准确测量目标物质的浓度，需要根据已知浓度的标准品制备一条标准曲线。
标准品的浓度范围一般从低浓度到高浓度逐步增加。
通过测量标准品和待测样品的散射程度，并使用标准曲线进行外推和内推，可以得出待测样品中目标物质的浓度。
免疫比浊法的优点包括操作简单、结果快速、成本较低和高灵敏度。
然而，它也存在一些限制和注意事项。
由于光散射测量主要基于理论计算，因此需要确保实验中的测量条件如温度、光源强度和检测器的响应都是稳定和准确的。
另外，免疫比浊法在样品中可能存在其他干扰物质时可能会失去灵敏度和特异性。
因此，在进行免疫比浊法实验时，需要进行一系列的控制实验来检测和排除干扰因素。
除了免疫比浊法，还有其他一些常用的免疫学方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射免疫分析（RIA）。
这些方法在分析物质浓度的测量范围、特异性和精确度方面可能略有不同。
因此，在选择适当的实验方法时，需要考虑样品性质、目标物质的特征和实验室的设备和技术条件。
免疫比浊检验技术原理与进展
新型免疫比浊法研究动态
纳米颗粒增强免疫比浊法
01
利用纳米颗粒的高比表面积和光学性质，提高抗原抗体复合物
的浊度变化，从而提高检测灵敏度。
均相免疫比浊法
02
在反应体系中直接加入抗原抗体复合物，通过浊度变化检测待
测物，无需分离步骤，简化实验操作。
多重免疫比浊法
03
同时检测多个目标物，提高检测通量和效率，满足临床多样化
需求。
存在问题与挑战分析
抗原抗体复合物稳定性
复合物在反应体系中的稳定性直接影响浊度变化的准确性和可重复性，需要优化复合物制备和保 存条件。
非特异性干扰
血清等样本中的非特异性物质可能干扰免疫比浊反应，导致结果误差，需要采取相应措施降低干 扰。
自动化与标准化
当前免疫比浊法操作仍较为繁琐，需要进一步提高自动化程度，同时推动标准化进程，以确保结 果的准确性和可比性。
肿瘤标志物检测中的应用
01
肝癌
通过检测甲胎蛋白（AFP）等肿 瘤标志物，可辅助诊断肝癌及判 断其预后。
卵巢癌
02
03
前列腺癌
免疫比浊法可检测癌抗原125 （CA125），用于卵巢癌的诊断 和病情监测。
通过检测前列腺特异性抗原 （PSA），有助于前列腺癌的早 期发现和诊断。
05 免疫比浊法研究进展及挑 战
探讨了免疫比浊检验技术在临床实验室中的应用，如特定蛋白的 测定、药物监测等，并强调了质量控制的重要性和实施方法。
对未来发展趋势的展望
自动化与智能化
多项目联合检测
随着科技的进步，未来免疫比浊检验技术 将更加自动化和智能化，提高检测效率和 准确性。
开发能够同时检测多个项目的免疫比浊试 剂盒，以满足临床实验室对于高通量、高 效率的检测需求。
临床免疫学：第七章 免疫比浊技术
复合物的速度，可用该时间段内测定的散射 光强度表示。 • 当仪器测定到某一时间内形成速率下降时， 即出现速率峰，该峰值的高低即代表所测抗 原的量。
抗原抗体反应与散射光峰值信号 的动态变化示意图
散射免疫比浊法
• 速率峰值一般在25秒时出现。
抗原抗体复合物形成的速率
累计时间（s） 形成IC总量 速率
絮状沉淀试验
液体内沉淀反应
环状沉淀试验
沉淀反应
单向扩散试验
凝胶内沉淀反应 双向扩散试验
免疫电泳
免疫电泳技术
免疫固定电泳
免疫比浊技术
免疫比浊技术的分类
• 所检测的光信号性质
透射免疫比浊 散射免疫比浊
终点法 • 测定时间
速率法
无增敏 • 增敏剂 PEG增敏
胶乳增敏
透射免疫比浊法
• 基本原理
• 一定波长的光线通过抗原抗体反应的溶液时，由 于抗原抗体复合物的形成使入射光被反射、吸收， 透射光减少，光吸收量增多。
胶乳颗粒增强免疫比浊法
• 改良的免疫比浊检测方法； • 基本原理：在高分子胶乳颗粒的表面交联
单克隆抗体或抗原，当这些颗粒与待测抗 原或抗体相遇后，短时间内会迅速凝聚， 从而改变了反应液的透光性能（即吸光度 ）或散光性能； • 透射免疫增强比浊和散射免疫增强比浊；
胶乳颗粒增强免疫比浊法
• 胶乳(latex) • 聚合物微粒分散于水中形成的胶体乳液的
散射免疫比浊法
• 基本原理
• 一定波长的光线通过 抗原抗体反应的溶液 时，溶液中的抗原抗 体复合物会对入射光 产生折射、偏转，从 而产生散射光，通过 测定散射光的强度进 而推算得到待测抗原 的含量。
散射免疫比浊法
• 基本流程与方法 以标准抗原浓度及所测得散射光度值制作 剂量-反应曲线，依据所测散射光强度可以 计算出待测抗原含量。
抗原抗体反应与散射光峰值信号 的动态变化示意图
散射免疫比浊法
• 速率峰值一般在25秒时出现。
抗原抗体复合物形成的速率
累计时间（s） 形成IC总量 速率
絮状沉淀试验
液体内沉淀反应
环状沉淀试验
沉淀反应
单向扩散试验
凝胶内沉淀反应 双向扩散试验
免疫电泳
免疫电泳技术
免疫固定电泳
免疫比浊技术
免疫比浊技术的分类
• 所检测的光信号性质
透射免疫比浊 散射免疫比浊
终点法 • 测定时间
速率法
无增敏 • 增敏剂 PEG增敏
胶乳增敏
透射免疫比浊法
• 基本原理
• 一定波长的光线通过抗原抗体反应的溶液时，由 于抗原抗体复合物的形成使入射光被反射、吸收， 透射光减少，光吸收量增多。
胶乳颗粒增强免疫比浊法
• 改良的免疫比浊检测方法； • 基本原理：在高分子胶乳颗粒的表面交联
单克隆抗体或抗原，当这些颗粒与待测抗 原或抗体相遇后，短时间内会迅速凝聚， 从而改变了反应液的透光性能（即吸光度 ）或散光性能； • 透射免疫增强比浊和散射免疫增强比浊；
胶乳颗粒增强免疫比浊法
• 胶乳(latex) • 聚合物微粒分散于水中形成的胶体乳液的
散射免疫比浊法
• 基本原理
• 一定波长的光线通过 抗原抗体反应的溶液 时，溶液中的抗原抗 体复合物会对入射光 产生折射、偏转，从 而产生散射光，通过 测定散射光的强度进 而推算得到待测抗原 的含量。
散射免疫比浊法
• 基本流程与方法 以标准抗原浓度及所测得散射光度值制作 剂量-反应曲线，依据所测散射光强度可以 计算出待测抗原含量。
《免疫比浊分析》课件
免疫比浊试剂的制备
2
便进行免疫比浊分析实验。
根据实验需求，制备相应的免疫比浊试
剂，确保其质量和稳定性。
3
试管法免疫比浊分析的步骤
按照一定的程序和条件，在试管中进行Βιβλιοθήκη 微量比浊仪法免疫比浊分析的步
4
免疫比浊分析实验。
骤
使用微量比浊仪进行免疫比浊分析，准 确测定样品的蛋白质含量。
3. 数据分析
- 免疫比浊试剂的标准曲线 - 样品测定的结果计算 - 数据分析的示例
《免疫比浊分析》PPT课 件
免疫比浊分析是一种常用的实验方法，用于测定血液或生化样品中的特定蛋 白质含量。本课件将介绍免疫比浊分析的概述、实验步骤、数据分析、实验 注意事项、结论与展望等内容。
1. 概述
- 免疫比浊分析简介 - 免疫比浊分析的应用领域
2. 实验步骤
1
样品和抗原的制备
准备样品和抗原的浓度合适的溶液，以
4. 实验注意事项
样品处理的注意事项
保证样品质量和纯度，避免 样品污染或降解。
免疫比浊试剂的保存和 使用
妥善保存免疫比浊试剂，避 免受到温度、光照等因素的 影响。
实验过程中的注意事项
注意操作规范，避免误差的 产生。
5. 结论与展望
- 结论总结 - 免疫比浊分析的发展前景
6. 参考文献
- 相关研究文献 - 参考书目
免疫比浊法PPT
在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，如34％的聚乙二醇等，利用其破坏抗原抗体的水化层，促进其靠 近反应，但如浓度不适合，高了会影响其它溶质或产生非特
异性聚集影响结果。
免疫比浊法的特点：
实验原理
优点
稳定性好，敏感性高(达ng/L)、精确度高，干扰因素少，结果判断更加客观、 准确。
快速、简便，结果回报时间短，便于及时将各种信息向临床反馈，又可节约 大量人力物力，利于大批量样品的处理。
空白管
+蒸馏水 （10mL）
校准管 +IgX试剂 37℃ （1mL） 5min
+校准品 （10mL）
混匀 37℃,10min
OD340
样本管
+样品血清 （10mL）
结果计算方法：
实验结果
样本管吸光度 Ig浓度（g/L）×= Ig校准浓度（g/L）
校准管吸光度 IgA：1.72 g/L IgG：9.77 g/L IgM，除非放置较长时间 。
如要形成较大的的复合物，抗原抗体量应较大。
实验材料
1.免疫球蛋白A,M,G（IgA, IgM, IgG）测定试剂 2.免疫球蛋白A,M,G （IgA, IgM, IgG）校准品，蒸馏水，
血清样本 3.微量加样枪、试管 4.分光光度仪、水浴箱
实验方法
实验 免疫比浊法检 测免疫球蛋白
免疫系
1
实验原理
2
材料和方法
3
实验结果
实验原理
免疫球蛋白（Ig）是指一类具有抗体样结构或具有抗体活性的 球蛋白，能与诱导其产生的抗原发生特异性结合，是体液免疫 应答的主要效应分子。免疫球蛋白水平增高常见于各种慢性细 菌感染，如慢性骨髓炎、慢性肺脓肿等。在多种自身免疫病、 肝脏疾病患者中可有IgG、IgA、IgM升高：在系统性红斑狼疮 患者中以IgG、IgA或IgG 、IgM升高较多见；在类风湿关节炎 中则以IgM升高为主。免疫球蛋白水平降低多见于先天性体液 免疫缺乏病、肾病综合症、吸收不良综合症、淋巴瘤、放射损
异性聚集影响结果。
免疫比浊法的特点：
实验原理
优点
稳定性好，敏感性高(达ng/L)、精确度高，干扰因素少，结果判断更加客观、 准确。
快速、简便，结果回报时间短，便于及时将各种信息向临床反馈，又可节约 大量人力物力，利于大批量样品的处理。
空白管
+蒸馏水 （10mL）
校准管 +IgX试剂 37℃ （1mL） 5min
+校准品 （10mL）
混匀 37℃,10min
OD340
样本管
+样品血清 （10mL）
结果计算方法：
实验结果
样本管吸光度 Ig浓度（g/L）×= Ig校准浓度（g/L）
校准管吸光度 IgA：1.72 g/L IgG：9.77 g/L IgM，除非放置较长时间 。
如要形成较大的的复合物，抗原抗体量应较大。
实验材料
1.免疫球蛋白A,M,G（IgA, IgM, IgG）测定试剂 2.免疫球蛋白A,M,G （IgA, IgM, IgG）校准品，蒸馏水，
血清样本 3.微量加样枪、试管 4.分光光度仪、水浴箱
实验方法
实验 免疫比浊法检 测免疫球蛋白
免疫系
1
实验原理
2
材料和方法
3
实验结果
实验原理
免疫球蛋白（Ig）是指一类具有抗体样结构或具有抗体活性的 球蛋白，能与诱导其产生的抗原发生特异性结合，是体液免疫 应答的主要效应分子。免疫球蛋白水平增高常见于各种慢性细 菌感染，如慢性骨髓炎、慢性肺脓肿等。在多种自身免疫病、 肝脏疾病患者中可有IgG、IgA、IgM升高：在系统性红斑狼疮 患者中以IgG、IgA或IgG 、IgM升高较多见；在类风湿关节炎 中则以IgM升高为主。免疫球蛋白水平降低多见于先天性体液 免疫缺乏病、肾病综合症、吸收不良综合症、淋巴瘤、放射损
常用免疫学检验检测技术
• 6、捕获法测IgM抗体
IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间 接ELISA一般仅适用于检测IgG抗体。如用酶标记的抗 人IgM作为二抗进行间接ELISA测定IgM抗体，标本中 同时存在的不同浓度的IgG抗体将与IgM抗体竞争，而 使结合在固相抗原上的IGM抗体相应减少。另外标本 中如含有类风湿因子、也会产生干扰。因此用一般的 间接法测定IgM抗体不能得到准确的结果。
• （二）酶联免疫电转移印斑法
• Burnette于1981年建立酶联免疫电转移印斑法 （enzyme linked immunolectrotransfer blot, EITB），并称之为西部印斑(Western blot). EITB分三个阶段进行。
第一阶段为SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳（SDSPAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷， 在聚丙烯酞胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量 越小，泳动速度越快。此阶段分离效果肉眼不可 见（只有在染色后才显出电泳区带）．
• （4）加底物显色。夹心式复合物中的酶催化底物 成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原 的定性或定量。
• 在临床检验中，此法适用于检测各种蛋白质等 大分子抗原，例如乙型肝炎病毒表面抗原 （HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）、促绒毛膜性腺 激素（HCG）等。双抗体夹心法只适用于二价或 二价以上较大分子抗原的检出和定量分析，而 不能用于半抗原等小分子的测定。
速率散射比浊法有三大特点： • 一、时间快，一般在30-60s之内就可完成测试； • 二、比较准确，因其测定形成速率，抗原多，
速率快； • 三、节省试剂。
• （三）粒子强化免疫浊度测定法
粒子强化免疫浊度测定法的基本原理是，选择 一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒吸附或交联抗 体后，当遇到相应抗原时，则发生聚集，单个胶乳 颗粒在入射光波长之内，光线可透过。当两个胶乳 颗粒凝聚时，则使透射光减少，这种减少的程度与 胶乳凝集成正比，当然也与抗原量成正比。
免疫比浊法原理
免疫比浊法原理免疫比浊法是一种常用的免疫学实验方法，它通过测定抗原与抗体相互作用后形成的免疫复合物的光学密度来定量测定抗原或抗体的含量。
该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，被广泛应用于临床诊断、生物医药研究等领域。
本文将详细介绍免疫比浊法的原理及其应用。
免疫比浊法的原理主要是利用抗原与抗体结合后形成的免疫复合物对光的散射作用来定量测定抗原或抗体的含量。
当抗原与抗体结合后，形成的免疫复合物会使溶液的透光性降低，导致溶液的浑浊度增加。
通过测定溶液的光学密度，就可以间接反映出抗原或抗体的含量。
免疫比浊法可以用于测定血清中的抗体含量、细胞表面抗原的表达水平等。
在进行免疫比浊法实验时，首先需要将待测样品与特异性抗体充分混合，使其发生免疫反应。
随后，通过离心等方法将免疫复合物沉淀下来，去除未结合的抗体。
然后，测定上清液的光学密度，利用标准曲线来计算出待测样品中抗原或抗体的含量。
需要注意的是，免疫比浊法在进行实验时需要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性。
免疫比浊法具有许多优点，首先，它的灵敏度高，可以检测到极低浓度的抗原或抗体。
其次，该方法的特异性强，可以准确地区分不同的抗原或抗体。
此外，免疫比浊法操作简便，不需要昂贵的仪器设备，适用于大规模样品的检测。
因此，免疫比浊法被广泛应用于临床诊断、生物医药研究等领域。
总之，免疫比浊法是一种重要的免疫学实验方法，它通过测定免疫复合物的光学密度来定量测定抗原或抗体的含量。
该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，被广泛应用于临床诊断、生物医药研究等领域。
希望本文对免疫比浊法的原理及应用有所帮助，欢迎批评指正。
免疫比浊法PPT课件
+校准品 （10mL）
混匀
37℃,10min OD340
样本管
+样品血清 （10mL）
10
结果计算方 法：
精品ppt
实验结果
样本管吸光 Ig浓度（g/L）= 度校准管吸光度 × Ig校准浓度（g/L）
IgA：1.72 g/L IgG：9.77 g/L IgM：1.37g/L
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精品ppt
实验原理
免疫比浊法的特点：
缺点
当抗体或抗原大量过剩时，出现可溶性的复合物，造成误差。
应维持反应管中的抗体蛋白量始终过剩，此值要预先测定。
受血脂浓度影响。脂蛋白的小颗粒可形成浊度，造成假性升高。
少量小抗原抗体复合物极难形成浊度，除非放置较长时间 。
如要形成较大的的复合物，抗原抗体量应较大。
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精品ppt
实验材料
1.免疫球蛋白A,M,G（IgA, IgM, IgG）测定试剂 2.免疫球蛋白A,M,G （IgA, IgM, IgG）校准品，蒸馏水， 血清样本 3.微量加样枪、试管 4.分光光度仪、水浴箱
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实验方法 精品ppt
空白管
+蒸馏水 （10mL）
校准管 +IgX试剂 37℃ （1mL） 5min
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精品ppt
实验原理
聚乙二醇即PEG是中性、无毒且具有独特理化性质和良 好的生物相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇具有高度的亲水 性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。
在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，如 3-4％的聚乙二醇等，利用其破坏抗原抗体的水化层，促进其 靠近反应，但如浓度不适合，高了会影响其它溶质或产生非 特异性聚集影响结果。
免疫比浊法原理
免疫比浊法原理
免疫比浊法是检测类风湿因子的方法，是利用抗原和抗体相互结合，动态测定类风湿因子的方法，基本原理是抗原、抗体在特定稀释系统中反应，比例合适的时候形成可溶性免疫复合物，在稀释系统中的促凝剂作用下，从液体状态析出形成微粒，使反应液混浊，抗体浓度固定的时候形成的免疫复合物量，会随检测样中抗原量增加，反应液混浊度也会随之增加。
通过测定反应液的浊度，与一系列标准品进行对比，可以计算出检测样品中抗原含量。
所以，免疫比浊法是检测类风湿因子的定量检查，有时候在测定类风湿因子的时候会将检测方法写在检查结果后面，有利于临床医生对结果做出比较规范的判断。
在临床上也会采用其他检测方法进行类风湿因子的检测，有的是定性检测，报告只出现阴性、阳性结果，没有具体数值。
免疫比浊法是一种检测类风湿性因子的方法，是利用抗原抗体相互结合，动态测定类风湿因子的方法，其基本原理是：抗原、抗体在特定稀释系统中反应，适当比例后形成可
溶性免疫复合物，在稀释系统中的促凝剂作用下，从液体状态析出形成微粒，使反应液混浊，当抗体浓度固定时，所形成的免疫复合物量，就会随检测样中抗原量增加，反应液混浊度也会随之增加。
用该反应液测定浊度，并与标准系列产品对比，可计算出检测样品中抗原含量。
免疫比浊法
实验 免疫比浊法检 测免疫球蛋白
免 疫 系
1 2 3
实验原理 材料和方法 实验结果
实验原理
免疫球蛋白（Ig） 免疫球蛋白（Ig）是指一类具有抗体样结构或具有抗体活性 的球蛋白，能与诱导其产生的抗原发生特异性结合， 的球蛋白，能与诱导其产生的抗原发生特异性结合，是体液免 疫应答的主要效应分子。 疫应答的主要效应分子。免疫球蛋白水平增高常见于各种慢性 细菌感染，如慢性骨髓炎、慢性肺脓肿等。在多种自身免疫病、 细菌感染，如慢性骨髓炎、慢性肺脓肿等。在多种自身免疫病、 肝脏疾病患者中可有IgG、IgA、IgM升高： 肝脏疾病患者中可有IgG、IgA、IgM升高：在系统性红斑狼疮 IgG 升高 患者中以IgG、IgA或 IgM升高较多见 升高较多见； 患者中以IgG、IgA或IgG 、IgM升高较多见；在类风湿关节炎 IgG 中则以IgM升高为主。免疫球蛋白水平降低多见于先天性体液 中则以IgM升高为主。 IgM升高为主 免疫缺乏病、肾病综合症、吸收不良综合症、淋巴瘤、 免疫缺乏病、肾病综合症、吸收不良综合症、淋巴瘤、放射损 伤和免疫抑制剂治疗后等情况。 伤和免疫抑制剂治疗后等情况。
实验材料
1.免疫球蛋白A,M,G（ IgG）测定试剂 1.免疫球蛋白A,M,G（IgA, IgM, IgG）测定试剂 免疫球蛋白A,M,G 2.免疫球蛋白A,M,G （IgA, IgM, IgG）校准品，蒸馏水， IgG）校准品，蒸馏水， 2.免疫球蛋白A,M,G 免疫球蛋白 血清样本 3.微量加样枪、 3.微量加样枪、试管 微量加样枪 4.分光光度仪、 4.分光光度仪、水浴箱 分光光度仪
实验原理
聚乙二醇即PEG是中性、 聚乙二醇即PEG是中性、无毒且具有独特理化性质和良 PEG是中性 好的生物相溶性的高分子聚合物， 好的生物相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇具有高度的亲水 性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。 在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。 在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂， 在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，如34％的聚乙二醇等，利用其破坏抗原抗体的水化层，促进其靠 的聚乙二醇等，利用其破坏抗原抗体的水化层， 近反应，但如浓度不适合， 近反应，但如浓度不适合，高了会影响其它溶质或产生非特 异性聚集影响结果。 异性聚集影响结果。
免 疫 系
1 2 3
实验原理 材料和方法 实验结果
实验原理
免疫球蛋白（Ig） 免疫球蛋白（Ig）是指一类具有抗体样结构或具有抗体活性 的球蛋白，能与诱导其产生的抗原发生特异性结合， 的球蛋白，能与诱导其产生的抗原发生特异性结合，是体液免 疫应答的主要效应分子。 疫应答的主要效应分子。免疫球蛋白水平增高常见于各种慢性 细菌感染，如慢性骨髓炎、慢性肺脓肿等。在多种自身免疫病、 细菌感染，如慢性骨髓炎、慢性肺脓肿等。在多种自身免疫病、 肝脏疾病患者中可有IgG、IgA、IgM升高： 肝脏疾病患者中可有IgG、IgA、IgM升高：在系统性红斑狼疮 IgG 升高 患者中以IgG、IgA或 IgM升高较多见 升高较多见； 患者中以IgG、IgA或IgG 、IgM升高较多见；在类风湿关节炎 IgG 中则以IgM升高为主。免疫球蛋白水平降低多见于先天性体液 中则以IgM升高为主。 IgM升高为主 免疫缺乏病、肾病综合症、吸收不良综合症、淋巴瘤、 免疫缺乏病、肾病综合症、吸收不良综合症、淋巴瘤、放射损 伤和免疫抑制剂治疗后等情况。 伤和免疫抑制剂治疗后等情况。
实验材料
1.免疫球蛋白A,M,G（ IgG）测定试剂 1.免疫球蛋白A,M,G（IgA, IgM, IgG）测定试剂 免疫球蛋白A,M,G 2.免疫球蛋白A,M,G （IgA, IgM, IgG）校准品，蒸馏水， IgG）校准品，蒸馏水， 2.免疫球蛋白A,M,G 免疫球蛋白 血清样本 3.微量加样枪、 3.微量加样枪、试管 微量加样枪 4.分光光度仪、 4.分光光度仪、水浴箱 分光光度仪
实验原理
聚乙二醇即PEG是中性、 聚乙二醇即PEG是中性、无毒且具有独特理化性质和良 PEG是中性 好的生物相溶性的高分子聚合物， 好的生物相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇具有高度的亲水 性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。 在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。 在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂， 在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，如34％的聚乙二醇等，利用其破坏抗原抗体的水化层，促进其靠 的聚乙二醇等，利用其破坏抗原抗体的水化层， 近反应，但如浓度不适合， 近反应，但如浓度不适合，高了会影响其它溶质或产生非特 异性聚集影响结果。 异性聚集影响结果。
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絮状沉淀试验
液体内沉淀反应
环状沉淀试验
沉淀反应
单向扩散试验
凝胶内沉淀反应 双向扩散试验
免疫电泳
免疫电泳技术
免疫固定电泳
免疫比浊技术
免疫比浊技术的分类
• 所检测的光信号性质
透射免疫比浊 散射免疫比浊
终点法 • 测定时间
速率法
无增敏 • 增敏剂 PEG增敏
胶乳增敏
透射免疫比浊法
• 基本原理
• 一定波长的光线通过抗原抗体反应的溶液时，由 于抗原抗体复合物的形成使入射光被反射、吸收， 透射光减少，光吸收量增多。
• Mie散射(d ＞λ)
散射免疫比浊法
散射免疫比浊法
• 免疫复合物形成的散射光多数属于Rayleigh散射， 其光强度计算公式为：
适当增加抗原-抗体的体积，减少入射光的波长，减 小检测角度，以及使用激光、较短波长等高强度光 源作为入射光，都可提高检测灵敏度。
（θ=0 ？）
散射免疫比浊法的类型
• 5、抗体亲和力好、效价高，且保证过量；
透射免疫比浊法
• 方法评价
• 1、操作简单，重复性好，结果较准确； • 2、能用全自动或半自动化仪器进行检测； • 3、灵敏度比单向免疫扩散法高5～10倍，但
是比散射免疫比浊法低； • 4、要求抗原抗体复合物分子应足够多、足
够大，故耗时长。
根据透射光减弱的原理来定量，分子太小则入射光 直接通过，只能测定抗原-抗体反应的第二阶段。
累计时间（s） 形成IC总量 速率
5
8
－
10
13
5
15
25
12
20
60
35
25
150
90
30
230
80
35
300
70
40
360
60
45
415
55
50
450
35
55
480
30
60
500
20
散射免疫比浊法
• 技术要点 • 峰值出现的时间与抗体的浓度及其亲和力
直接相关，纯度高、亲和力高的抗体可以 缩短反应时间； • 方法评价 • 检测抗原抗体反应的第一阶段，检测时间 短，速度快，灵敏度高，可自动化，存在 钩状效应
• 2、如果待测反应液中形成的抗原抗体复合物颗粒 太小或数量太少时，阻挡不了光线的通过，影响结 果准确性，因此选择检测抗体的分子量需足够大或 抗体的数量需足够多；
标本用量相应增多
• 3、使用非离子型聚合物，如PEG,可提高复合物 形成速度，缩短检测时间并增加反应液的浊度， 从而提高检测的灵敏度；
• 4、反应体系的温度和时间将影响抗原抗体复合 物的形成及稳定性；
终点散射比浊法
• 方法评价 • 可用于自动化仪器测定； • 检测灵敏度可达μg/ml水平，高于透射免疫
比浊法； • 检测抗原-抗体反应的第二阶段，测定时间
长，不适合快速检测；
散射免疫比浊法的类型
• 速率散射比浊法（rate nephelometry ） • 是测定抗原抗体结合反应的动态过程。 • 所谓速率，即单位时间内抗原抗体结合形成
散射免疫比浊法
• 基本原理
• 一定波长的光线通过 抗原抗体反应的溶液 时，溶液中的抗原抗 体复合物会对入射光 产生折射、偏转，从 而产生散射光，通过 测定散射光的强度进 而推算得到待测抗原 的含量。
散射免疫比浊法
• 基本流程与方法 以标准抗原浓度及所测得散射光度值制作 剂量-反应曲线，依据所测散射光强度可以 计算出待测抗原含量。
含量变化引起的。 1、保证抗体过量：
抗体结合抗原的能力达到相应待测样本正常血清浓度的 50倍以上； 2、对抗原过量进行阈值限定：
在预反应阶段先加入患者1/10的样本与抗体反应，当抗 原抗体复合物产生的散射光信号在预设阈值内，提示标本 中待测抗原浓度合适，可继续进行测定。若超过预设阈值 ，说明抗原过剩，应先稀释标本再测定。
质控（quality control）
4、用已知浓度的质控品（第三方）检测定标结果的质量；
标本检测（sample testing）
5、根据待测标本管的吸光度值，按剂量-反应曲线求得标本中抗原的浓度。
透射免疫比浊法
• 技术要点 • 1、由于抗原抗体复合物颗粒大小多在35-100nm之
间，被近紫外光线照射可获得最大吸收峰，故选择 290～410nm波长的光线测定效果最好，目前多选 用340nm的波长；
复合物的速度，可用该时间段内测定的散射 光强度表示。 • 当仪器测定到某一时间内形成速率下降时， 即出现速率峰，该峰值的高低即代表所测抗 原的量。
抗原抗体反应与散射光峰值信号 的动态变化示意图
散射免疫比浊法
• 速率峰值一般在25秒时出现。
抗原抗体复合物形成的速率
累计时间（s） 形成IC总量 速率
• 应体系后的透射光强度，或者测定反 应体系的吸光度，即可推导出溶液中待测物质的 浓度。
分光光度计/ 光电比色计
浊度仪
透射免疫比浊法
• 基本流程与方法
定标（calibration）
1、将已知浓度的抗原标准品作适当稀释； 2、将不同浓度的标准抗原溶液与适当过量的抗血清混合，在一定的反应条 件下，待抗原抗体反应完成后，在一定波长下检测各标准管的吸光度； 3、按一定方法进行曲线拟合，以标准抗原浓度及所测得吸光度值确定剂量 -反应曲线；
• 散射光的强度与免疫复合物的含量、大小 、偏转角度、形状有关，与反应时间、光 源的强度、波长也有关。
散射免疫比浊法
• 如何检测散射光 • 根据免疫复合物颗粒直径与入射光波长的
关系,散射光路可以分为三种： • Rayleigh散射(d＜λ/20)
• Rayleigh-Debye散射(λ/20 ＜ d ≤λ)
第七章 免疫比浊技术
第一节 免疫比浊的类型
免疫比浊技术 （immunoturbidimetric assay, IA）
将液相中沉淀反应与现代光学仪器和自动化分析 技术相结合的一项免疫分析技术。
当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合 适时，在一定的缓冲液中它们快速形成一定大小 的抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，利用现 代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含 量。
• 终点散射比浊法（endpoint nephelometry）： 在免疫反应进行到 一定时间时测定其浊度 ，故又被称为定时散射 比浊法（fixed time nephelometry ）
• 分为两个阶段 • 预反应阶段 • 反应阶段
终点散射比浊法
• 技术要点 • 保证检测时所获取的信号峰值是由被检抗原产生，即抗原