临床免疫学：第七章 免疫比浊技术

絮状沉淀试验
液体内沉淀反应
环状沉淀试验
沉淀反应
单向扩散试验
凝胶内沉淀反应 双向扩散试验
免疫电泳
免疫电泳技术
免疫固定电泳
免疫比浊技术
免疫比浊技术的分类
• 所检测的光信号性质
透射免疫比浊 散射免疫比浊
终点法 • 测定时间
速率法
无增敏 • 增敏剂 PEG增敏
胶乳增敏
透射免疫比浊法
• 基本原理
• 一定波长的光线通过抗原抗体反应的溶液时，由 于抗原抗体复合物的形成使入射光被反射、吸收， 透射光减少，光吸收量增多。
• Mie散射(d ＞λ)
散射免疫比浊法
散射免疫比浊法
• 免疫复合物形成的散射光多数属于Rayleigh散射， 其光强度计算公式为：
适当增加抗原-抗体的体积，减少入射光的波长，减 小检测角度，以及使用激光、较短波长等高强度光 源作为入射光，都可提高检测灵敏度。
（θ=0 ？）
散射免疫比浊法的类型
• 5、抗体亲和力好、效价高，且保证过量；
透射免疫比浊法
• 方法评价
• 1、操作简单，重复性好，结果较准确； • 2、能用全自动或半自动化仪器进行检测； • 3、灵敏度比单向免疫扩散法高5～10倍，但
是比散射免疫比浊法低； • 4、要求抗原抗体复合物分子应足够多、足
够大，故耗时长。
根据透射光减弱的原理来定量，分子太小则入射光 直接通过，只能测定抗原-抗体反应的第二阶段。
累计时间（s） 形成IC总量 速率
5
8
－
10
13
5
15
25
12
20
60
35
25
150
90
30
230
80
35
300
70
40
360
60
45
415
55
50
450
35
55
480
30
60
500
20
散射免疫比浊法
• 技术要点 • 峰值出现的时间与抗体的浓度及其亲和力
直接相关，纯度高、亲和力高的抗体可以 缩短反应时间； • 方法评价 • 检测抗原抗体反应的第一阶段，检测时间 短，速度快，灵敏度高，可自动化，存在 钩状效应
• 2、如果待测反应液中形成的抗原抗体复合物颗粒 太小或数量太少时，阻挡不了光线的通过，影响结 果准确性，因此选择检测抗体的分子量需足够大或 抗体的数量需足够多；
标本用量相应增多
• 3、使用非离子型聚合物，如PEG,可提高复合物 形成速度，缩短检测时间并增加反应液的浊度， 从而提高检测的灵敏度；
• 4、反应体系的温度和时间将影响抗原抗体复合 物的形成及稳定性；
终点散射比浊法
• 方法评价 • 可用于自动化仪器测定； • 检测灵敏度可达μg/ml水平，高于透射免疫
比浊法； • 检测抗原-抗体反应的第二阶段，测定时间
长，不适合快速检测；
散射免疫比浊法的类型
• 速率散射比浊法（rate nephelometry ） • 是测定抗原抗体结合反应的动态过程。 • 所谓速率，即单位时间内抗原抗体结合形成
散射免疫比浊法
• 基本原理
• 一定波长的光线通过 抗原抗体反应的溶液 时，溶液中的抗原抗 体复合物会对入射光 产生折射、偏转，从 而产生散射光，通过 测定散射光的强度进 而推算得到待测抗原 的含量。
散射免疫比浊法
• 基本流程与方法 以标准抗原浓度及所测得散射光度值制作 剂量-反应曲线，依据所测散射光强度可以 计算出待测抗原含量。
含量变化引起的。 1、保证抗体过量：
抗体结合抗原的能力达到相应待测样本正常血清浓度的 50倍以上； 2、对抗原过量进行阈值限定：
在预反应阶段先加入患者1/10的样本与抗体反应，当抗 原抗体复合物产生的散射光信号在预设阈值内，提示标本 中待测抗原浓度合适，可继续进行测定。若超过预设阈值 ，说明抗原过剩，应先稀释标本再测定。
质控（quality control）
4、用已知浓度的质控品（第三方）检测定标结果的质量；
标本检测（sample testing）
5、根据待测标本管的吸光度值，按剂量-反应曲线求得标本中抗原的浓度。
透射免疫比浊法
• 技术要点 • 1、由于抗原抗体复合物颗粒大小多在35-100nm之
间，被近紫外光线照射可获得最大吸收峰，故选择 290～410nm波长的光线测定效果最好，目前多选 用340nm的波长；
复合物的速度，可用该时间段内测定的散射 光强度表示。 • 当仪器测定到某一时间内形成速率下降时， 即出现速率峰，该峰值的高低即代表所测抗 原的量。
抗原抗体反应与散射光峰值信号 的动态变化示意图
散射免疫比浊法
• 速率峰值一般在25秒时出现。
抗原抗体复合物形成的速率
累计时间（s） 形成IC总量 速率
• 应体系后的透射光强度，或者测定反 应体系的吸光度，即可推导出溶液中待测物质的 浓度。
分光光度计/ 光电比色计
浊度仪
透射免疫比浊法
• 基本流程与方法
定标（calibration）
1、将已知浓度的抗原标准品作适当稀释； 2、将不同浓度的标准抗原溶液与适当过量的抗血清混合，在一定的反应条 件下，待抗原抗体反应完成后，在一定波长下检测各标准管的吸光度； 3、按一定方法进行曲线拟合，以标准抗原浓度及所测得吸光度值确定剂量 -反应曲线；
• 散射光的强度与免疫复合物的含量、大小 、偏转角度、形状有关，与反应时间、光 源的强度、波长也有关。
散射免疫比浊法
• 如何检测散射光 • 根据免疫复合物颗粒直径与入射光波长的
关系,散射光路可以分为三种： • Rayleigh散射(d＜λ/20)
• Rayleigh-Debye散射(λ/20 ＜ d ≤λ)
第七章 免疫比浊技术
第一节 免疫比浊的类型
免疫比浊技术 （immunoturbidimetric assay, IA）
将液相中沉淀反应与现代光学仪器和自动化分析 技术相结合的一项免疫分析技术。
当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合 适时，在一定的缓冲液中它们快速形成一定大小 的抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，利用现 代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含 量。
• 终点散射比浊法（endpoint nephelometry）： 在免疫反应进行到 一定时间时测定其浊度 ，故又被称为定时散射 比浊法（fixed time nephelometry ）
• 分为两个阶段 • 预反应阶段 • 反应阶段
终点散射比浊法
• 技术要点 • 保证检测时所获取的信号峰值是由被检抗原产生，即抗原