实验六-酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定
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（2）将沉淀用15ml的0.01mol/L的PBS（pH6.0） 搅拌溶解30min，溶液为浑浊液，再离心，转速 10000r/min条件下离心10min，离心后取上清液， 按下表2、3方法分别测蔗糖酶C的活性及蛋白含量。
试剂 0.1mol/L蔗糖（ml） 2 mol/L NaOH（ml）
各组酶液（ml）
40℃恒温水浴中准确反应10min
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
DNS（ml） 蒸馏水（ml）
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
100℃沸水浴准确加热5min，立即冷却
5
5
5
5
5
摇匀，以对照管作空白
A540
0
酶活（U）
0
酶比活力（U/mg ）
0
酶比活力平均值（U/mg ）
0
0.5
0.5
5
5
注意：
（4） 将上述上清液置于45℃的恒温水浴锅中，用 玻璃棒缓慢搅拌30min，然后置于冰浴中迅速冷却 5min。然后装入离心管中，离心，转速11000r/min 条件下离心10min，离心后取上清液，按下表2、3方 法分别测蔗糖酶B的活性及蛋白含量。
பைடு நூலகம்
（三）乙醇提取酵母蔗糖酶
（1）取上述第4步中的上清液10ml，缓慢加入 10ml的冰冻的无水乙醇（乙醇的终浓度为50％）， 并轻轻的搅拌5min，此过程在冰浴中进行。然后装 入离心管中，转速3000r/min条件下离心5min，离心 后弃上清液，离心管倒置于滤纸上，尽可能去除乙醇 残液。留沉淀。
对照管的颜色不能太深，如果太深，需要重新配蔗糖 溶液。
实验结果分析
4 思考题： （1）比较哪种蔗糖酶的粗提方法使酶的活性及纯度较高。 （2）本实验中有哪些影响蔗糖酶活性的因素。
谢谢
12
表1 酵母蔗糖酶酶活性及比活力测定
对照管 粗提A1 粗提A2 热提B1
0.2
0.2
0.2
0.2
0.1
0
0
0
40℃恒温水浴准确保温10min
0.1
0.1
0.1
热提B2 0.2 0
0.1
醇提C1 0.2 0
醇提C2 0.2 0
0.1
0.1
0.01 mol/L pH6.0 PBS（ml） 0.1
2 mol/L NaOH（ml）
实验方法
（一）粗提取酵母蔗糖酶
（1） 量取5g的面包酵母，分几次研磨（加入少量 石英砂）至粉状，再加入10-12ml的0.01mol/LPBS（pH 6.0），搅拌混合。置于小烧杯中。
（2） 置于－20℃冰箱中，反复冻融1-2次。
（二）热提取酵母蔗糖酶
（3） 解冻，然后置于离心管中，离心，转速 11000r/min离心10min，离心后取上清液，按下表2、3 方法分别测蔗糖酶A的活性及蛋白含量（蛋白含量 略）。
试剂 0.1mol/L蔗糖（ml） 2 mol/L NaOH（ml）
各组酶液（ml）
40℃恒温水浴中准确反应10min
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
DNS（ml） 蒸馏水（ml）
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
100℃沸水浴准确加热5min，立即冷却
5
5
5
5
5
摇匀，以对照管作空白
A540
0
酶活（U）
0
酶比活力（U/mg ）
0
酶比活力平均值（U/mg ）
0
0.5
0.5
5
5
注意：
（4） 将上述上清液置于45℃的恒温水浴锅中，用 玻璃棒缓慢搅拌30min，然后置于冰浴中迅速冷却 5min。然后装入离心管中，离心，转速11000r/min 条件下离心10min，离心后取上清液，按下表2、3方 法分别测蔗糖酶B的活性及蛋白含量。
பைடு நூலகம்
（三）乙醇提取酵母蔗糖酶
（1）取上述第4步中的上清液10ml，缓慢加入 10ml的冰冻的无水乙醇（乙醇的终浓度为50％）， 并轻轻的搅拌5min，此过程在冰浴中进行。然后装 入离心管中，转速3000r/min条件下离心5min，离心 后弃上清液，离心管倒置于滤纸上，尽可能去除乙醇 残液。留沉淀。
对照管的颜色不能太深，如果太深，需要重新配蔗糖 溶液。
实验结果分析
4 思考题： （1）比较哪种蔗糖酶的粗提方法使酶的活性及纯度较高。 （2）本实验中有哪些影响蔗糖酶活性的因素。
谢谢
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表1 酵母蔗糖酶酶活性及比活力测定
对照管 粗提A1 粗提A2 热提B1
0.2
0.2
0.2
0.2
0.1
0
0
0
40℃恒温水浴准确保温10min
0.1
0.1
0.1
热提B2 0.2 0
0.1
醇提C1 0.2 0
醇提C2 0.2 0
0.1
0.1
0.01 mol/L pH6.0 PBS（ml） 0.1
2 mol/L NaOH（ml）
实验方法
（一）粗提取酵母蔗糖酶
（1） 量取5g的面包酵母，分几次研磨（加入少量 石英砂）至粉状，再加入10-12ml的0.01mol/LPBS（pH 6.0），搅拌混合。置于小烧杯中。
（2） 置于－20℃冰箱中，反复冻融1-2次。
（二）热提取酵母蔗糖酶
（3） 解冻，然后置于离心管中，离心，转速 11000r/min离心10min，离心后取上清液，按下表2、3 方法分别测蔗糖酶A的活性及蛋白含量（蛋白含量 略）。