生化实验思考题参考答案

生化实验讲义思考题参考答案

实验一淀粉的提取和水解

1、实验材料的选择依据是什么？

答：生化实验的材料选择原则是含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低。从科研工作的角度选材，还应当注意具体的情况，如植物的季节性、地理位置和生长环境等，动物材料要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等，微生物材料要注意菌种的代数和培养基成分的差异等。

2、材料的破碎方法有哪些？

答：(1) 机械的方法：包括研磨法、组织捣碎法；

(2) 物理法：包括冻融法、超声波处理法、压榨法、冷然交替法等；

(3) 化学与生物化学方法：包括溶胀法、酶解法、有机溶剂处理法等。

实验二总糖与还原糖的测定

1、碱性铜试剂法测定还原糖是直接滴定还是间接滴定？两种滴定方法各有何优缺点？

答: 我们采用的是碱性铜试剂法中的间接法测定还原糖的含量。间接法的优点是操作简便、反应条件温和，缺点是在生成单质碘和转移反应产物的过程中容易引入误差；直接法的优点是反应原理直观易懂，缺点是操作较复杂，条件剧烈，不易控制。

实验五粗脂肪的定量测定─索氏提取法

（1）本实验制备得到的是粗脂肪，若要制备单一组分的脂类成分，可用什么方法进一步处理？

答：硅胶柱层析，高效液相色谱，气相色谱等。

（2）本实验样品制备时烘干为什么要避免过热?

答：防止脂质被氧化。

实验六蛋白质等电点测定

1、在分离蛋白质的时候，等电点有何实际应用价值？

答: 在等电点时，蛋白质分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以处于等电点的蛋

白质最容易沉淀。在分离蛋白质的时候，可以根据待分离的蛋白质的等电点，有目的地调节溶液的pH使该蛋白质沉淀下来，从而与其他处于溶液状态的杂质蛋白质分离。

实验七氨基酸的分离鉴定－纸层析法

1、如何用纸层析对氨基酸进行定性和定量的测定？

答: 将标准的已知氨基酸与待测的未知氨基酸在同一张层析纸上进行纸层析，显色后根据斑点的Rf值，就可以对氨基酸进行初步的定性，因为同一个物质在同一条件下有相同的Rf 值；将点样的未知氨基酸溶液和标准氨基酸溶液的体积恒定，根据显色后的氨基酸斑点的面积与点样的氨基酸质量成正比的原理，通过计算斑点的面积可以对氨基酸溶液进行定量测定。

3、纸层析、柱层析、薄层层析、高效液相层析各有什么特点？

答:

实验八蛋白质含量的测定

(1) 简述紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理及优点。

答：原理：由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（OD280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。优点：迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。

实验十影响酶活性的因素

（1）本实验中如何通过淀粉液加碘后的颜色的变化来判断酶促反应快慢的？

答：在唾液淀粉酶的作用下，淀粉水解，经过一系列被称为糊精的中间产物，最后生成麦芽糖和葡萄糖。变化过程如下：淀粉→紫色糊精→红色糊精→麦牙糖、葡萄糖淀粉、紫色糊精、红色糊精遇碘后分别呈蓝色、紫色与红色。麦芽糖和葡萄糖遇碘不变色。因此反应后颜色如为蓝色说明酶活力低，淡黄色则说明酶活力高。

（2）如何通过加入班氏试剂后生成沉淀多少来反映酶促反应快慢的？

答：淀粉与糊精无还原性，或还原性很弱，对本尼迪克特试剂呈阴性反应。麦芽糖、葡萄糖是还原糖，与本尼迪克特试剂共热后生成红棕色氧化亚铜的沉淀。因此，产生红棕色氧化亚铜的沉淀越多说明酶活力越高。

（3）通过本实验，结合理论课的学习，小结出哪些因素影响唾液淀粉酶活性？是如何影响的？

答：温度、pH、激活剂、抑制剂等。高于或低于最适温度或pH，酶活力都会降低；激活剂和抑制剂不是绝对的，只是相对而言，随着浓度的变化而变化。

实验十二碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定

(1) 试说明用硫酸铵分级分离酶的方法及应注意的事件。

答：用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。例如：某酶（或蛋白质）发生盐析的范围为35-65%饱和硫酸铵的浓度，因此可先选择30%饱和硫酸铵浓度，去沉淀杂蛋白，然后选择70%饱和硫浓度酸铵，留沉淀（含所要的酶）。

注意事项：在用硫酸铵沉淀酶蛋白时，要注意缓冲液的pH值和温度，盐的溶解度随温度不同而有较大的变化，同时酶的溶解度亦随温度的改变而改变。在加硫酸铵时，需事先将硫酸铵粉末研细。加入过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢，尽量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。

(2) 用正丁醇处理匀浆液可以有效地使碱性磷酸酶酶蛋白释放，使酶的产量大大提高，这是

为什么？

答：因为碱性磷酸酶酶是一种膜蛋白，正丁醇处理后可使结合在膜上的蛋白质更多地释放出来。

(3) 酶活力测定时，为什么必需先将酶液对缓冲液透析后才测定？

答：去除盐离子的影响。

实验十三凝胶过滤层析纯化碱性磷酸酶

1.在本实验中要注意哪些重要环节？

答：

1）注意区分柱子的上下端。

2）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。

3）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此凝胶。

4）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。

5）核酸蛋白检测仪，记录仪，部分收集器要正确连接。

6）要控制一定流速。

7）收集得到的液体要进行酶活力的检测。

实验十四底物浓度对酶活力的影响（米氏常数的测定）

1.在测定酶催化反应的米氏常数K m和最大反应速度V m时，应如何选择底物浓度范围？答：底物浓度选择范围[S] 0.2-5.0 Km为宜。底物浓度选取还应该注意其倒数能均匀分布。

1/v 1/v

0 1/[S] 0 1/[S]

底物浓度太大底物浓度太小

2.试说明米氏常数K m的物理意义和生物学意义。