第11章 临床免疫学检验仪器与技术

第十一章 临床免疫学检验仪器与技术
施新明
目录
第一节 免疫荧光分析仪器与技术 第二节 散射比浊分析仪器与技术 第三节 酶免疫分析仪器与技术 第四节 化学发光免疫分析仪器与技术 第五节 自动化免疫分析仪的染色的技术原理是什么？ 2.时间分辨荧光免疫分析仪的基本原理和性能特点是什么？ 3.散射比浊仪器的分类和原理是什么？ 4.比浊法检测抗原过剩的方法有哪些？ 5.酶联免疫分析技术的原理是什么？ 6.化学发光酶免疫分析的技术原理是什么？ 7.吖啶酯化学发光免疫分析技术的原理是什么？ 8.电化学发光免疫分析技术的原理和特点是什么？ 9.光激化学发光免疫分析技术的原理是什么？
软件系统等。
1.条形码扫描器 2.样品轨架 3.样品针清洗站 4.清洗站 5.清洗机头 6.载片 托盘 7.试剂架 8.用于初始稀释的稀释板 9.用于系列稀释的稀释板
一、免疫荧光染色仪器与技术
（二）免疫荧光染色相关仪器
1.免疫荧光染色自动操作仪 加样系统由样品针和清洗站、样品轨架和试剂架等构成； 清洗系统包括储液桶、清洗站、清洗机头、废液排除管路
不足，存在抗原过量，需将待测样品进一步稀释复测。 3. 全程动力学空白对照，排除非特异性的干扰，确保检测结果
的可靠性。
五、散射比浊分析仪的性能要求
1.灵敏度 2.精密度 3.准确度 4.携带污染 5.温度准确度与波动度 6.样品和试剂加样准确度与重复性
第三节 酶免疫分析仪器与技术
一、酶联免疫吸附试验
三、全自动酶免疫分析系统
（一）全自动酶免疫分析系统的基本结构
全自动酶免疫分析系统是具有自动加样本、加试剂，自动控 温温育，自动洗板和自动判读计算等功能的分析系统。
可用于各种酶免疫实验、血库筛查、生化检测、细胞培养、 分子生物学等各个方面。
三、全自动酶免疫分析系统
（二）全自动酶免疫分析系统的特点
三、定时散射比浊分析仪的基本结构与性能 （一）基本结构
BNⅡ散射免疫比浊分析仪由分析仪主机、计算机、键盘 、打印机、条形码扫描仪等组成。主要结构包括加样系 统，孵育转盘、光路系统和液路系统等。
三、定时散射比浊分析仪的基本结构与性能
（二）性能特点
以定时散射比浊分析法为原理。 比浊仪检测器与光路呈13°～24°角测量散射光。 使用乳胶颗粒增强技术，提高检测的灵敏度。 采用预先反应程序，防止抗原过剩。 非特异性反应的排除 通过测定反应管起始值和空白值之间的差异，排除样本由于
二、时间分辨免疫荧光分析仪器与技术
（一）时间分辨免疫荧光分析技术原理
3. 酶放大TRFIA 采用碱性磷酸酶水解5-氟水杨酸磷酸酯，生成5-氟水杨酸，
在碱性条件下5-氟水杨酸可与镧系元素（Tb3+）和乙二胺四 乙酸形成强荧光络合物，在激发光源激发下产生荧光。 4.均相TRFA系统 利用三联吡啶类化合物将镧系元素（Eu3+）和别藻蓝蛋白 连接，组成能量转移效率最高的能量供体和受体对，测量前 不必分离结合标记物和游离标记物，可以用双波长时间分辨 免疫荧光分析仪直接测定固相荧光。
酶标仪
洗板机
第四节 化学发光免疫分析仪器与技术
一、化学发光免疫分析技术原理与分类
（一）化学发光免疫分析技术原理
一、免疫荧光染色仪器与技术
②图形识别算法原理；
软件系统对阳性结果模拟合成一张三维全息图，测定三维 图的峰和谷，转换成数值信息，与软件中设定的条件进行 匹配，所需设备简单。
一、免疫荧光染色仪器与技术
（2）基本结构： 主要由全自动荧光显微镜、成像系统、机械与控制系统、
计算机和软件系统组成。
1、自动荧光显微镜；2、冷CCD摄像头；3、计算机；4、荧光准 直仪；5、显微镜控制器；6、LED荧光光源发生器
一、免疫荧光染色仪器与技术
（二）免疫荧光染色相关仪器
2.全自动免疫荧光判读系统 荧光强度判读：软件自动分析荧光图片中的每个像素点的荧
光强度，根据荧光强度的数值来判读荧光结果。 荧光模型的判读： ①模式识别原理 计算机系统将图形转化为数字参数，与数据库中存储的大量
数据比对，判读荧光模型。需要计算能力强大的计算机；有 学习能力，识别能力会随数据库内数据的累积而提高。
二、时间分辨免疫荧光分析仪器与技术
（二）时间分辨免疫荧光分析仪的基本结构
二、时间分辨免疫荧光分析仪器与技术
（三）时间分辨免疫荧光分析仪的性能特点
1.灵敏度高，检测下限可以达到10-18mol/L；分析范围宽， 可达4～5个数量级。
2.标记结合物稳定，有效使用期长。 3.特异性强。 4.测量快速，易于自动化，无放射污染。 5.不足之处是易受环境、试剂和容器中的镧系元素离子的污染，
速率是在单位时间内抗原、抗体结合形成复合物的速度。
抗原、抗体结合速率最大的某一时刻称为速率峰，当反应体 系的抗体过量时，速率峰的高低与抗原含量成正比。
速率散射比浊法动态地测定单位时间内抗原-抗体复合物形 成的散射光信号，从而获得多个速率峰，峰值的高低与待测 物质（抗原）的量成正比。当仪器测定到某一时间内形成速 率下降时，所出现速率峰的峰值高低代表所测抗原的量。
β-半乳糖苷酶 ， βGal 葡萄糖氧化酶，GOD
邻苯二胺， OPD 四甲基联苯胺 TMB
对-硝基苯磷酸酯 PNP
4-甲伞酮基-β-D-半乳 糖苷
对硝基氮蓝四唑
黄色 蓝色 黄色
蓝色
二、酶标仪
（一）酶标仪的基本原理与结构
基本工作原理和主要结构与光电比色计基本相同。 相当于专用于ELISA的光电比色计或分光光度计。
二、时间分辨免疫荧光分析仪器与技术
（一）时间分辨免疫荧光分析技术原理
1.解离增强镧系元素荧光免疫分析 增强液可使镧系元素形成具有高强度荧光的稳定螯合物。 增强液使Eu3+标记的抗体抗原复合物pH降至2～3，有利于 Eu3+从复合物上完全解离下来。 游离的Eu3+被増强液中的螯合剂所螯合、再与增强液中的β二酮体生成一个Eu3+在其内部的保护性胶态分子团。新生成的 螯合物在紫外光激发下能发射出很强的荧光，信号的增强效果 可达上百万倍。 2.FIAgen分析系统 用双功能螯合剂4, 7-二（氯磺酰基）苯基-1, 10-菲咯啉-2, 9-二羧酸，并把生物素-亲和素系统引入TRFIA系统。
当结合了胶乳颗粒的抗体遇到相应抗原发生聚集时，则使透 过光减少，散射光增加，散射光的增加程度与胶乳凝集成正 比，也与抗原量成正比。
抗体吸附于乳胶颗粒表面可以增加免疫反应复合物的直径， 从而增强散射光强度，达到提高散射比浊法检测灵敏度的目 的（检测水平可达到ng/ml或pg/ml）。
基于单克隆抗体胶乳免疫比浊技术的定量分析是比浊分析技 术的发展方向。
第一节 免疫荧光分析仪器与技术
一、免疫荧光染色仪器与技术
（一）免疫荧光染色技术原理
• 将荧光素标记在抗体上，免疫反 应结束后使用特定波长的激发光 照射标记的荧光素，荧光素吸收 激发光的能量，产生可见的荧光。
一、免疫荧光染色仪器与技术
（二）免疫荧光染色相关仪器
1.免疫荧光染色自动操作仪 用于自动化完成血清稀释、加样、温育、清洗等检测过程。 基本结构包含加样系统、清洗系统、温育系统、机械臂和
技术，以及速率散射比浊法、速率抑制散射比浊法、近红外
颗粒速率透射法、近红外颗粒速率抑制透射法四种方法，分
别检测大、中、小分子。
①LED光源（透射比浊
）；
②激光光源（散射比浊
）；
③聚焦镜头；
④分光棱镜；
⑤反应杯；
⑥散射比浊检测仪；
⑦激光反射；
⑧透射比浊检测仪
四、速率散射比浊分析仪的基本结构与性能
（二）性能特点
1．加样系统 加样系统用于样本和试剂的分配
加样系统
永久性加样针 采用一次性吸头
三、全自动酶免疫分析系统
（二）全自动酶免疫分析系统的特点
2． 温控孵育系统 提供在孵育时酶标板所需温度，防止蒸发， 并可振荡孵育，可使免疫反应更加充分，提高检测灵敏度。
3．洗涤工作站 洗涤工作站主要用于洗涤加样针和反应板。 4．酶标仪
（二）定时散射比浊法
由终点散射比浊法改进而成。
反应分预反应阶段和反应阶段。 预反应阶段用于
保证抗原抗体比 例合适，避免产 生的钩状效应。
反应阶段抗原、 抗体反应形成不 可溶性小分子颗 粒，产生的散射 光信号，这种信 号与待测的抗原 量成正比。
二、散射比浊技术的分类
（三）速率散射比浊法
速率散射比浊法是一种抗原抗体结合的动力学测定方法。
抗原和抗体反应达到平衡，免疫复合物形成的量不再增加， 反应体系的浊度不再变化时，可以认为是免疫反应结束。 特点： 反应过程时间较长， 抗体复合物易聚合形成大颗粒沉淀，导致偏低的结果， 标本内抗原含量较低时，敏感性不够。 主流的散射比浊仪器通常不采用终点散射比浊法。
二、散射比浊技术的分类
等部件； 温育系统包括恒温器，孵育盖等； 机械臂用于移动样品针、清洗机； 特点： ①能够替代手工操作，降低操作者的工作强度； ②使免疫荧光染色过程标准化，减少人为操作误差； ③清洗充分，减少非特异性的干扰。
一、免疫荧光染色仪器与技术
（二）免疫荧光染色相关仪器
2.全自动免疫荧光判读系统 （1）技术原理： DAPI染色使荧光显微镜能够定位细胞； 拍摄FITC染色的荧光图像； 智能数字荧光图像识别软件进行荧光模型的判读。
1. 采用速率检测法实现，排除干扰信号，提高准确度。 2. 抗原过量自动监测 在抗体与抗原反应过程完成时，再加入已知相应抗原到反应
体系中； 如果新增的抗原可与过量的抗体结合反应，则产生新的速率
峰，由此证明抗体过量，待测的抗原免疫反应完全； 若新加入抗原后不出现新的速率峰，则说明反应体系中抗体
二、酶标仪