农作物重要品种全基因组de novo测序
denovo-技术支持类-基因组denovo组装新技术
图1 10X Genomic linked-reads辅助基因组组装流程图表1 不同组装策略组装人的基因组大小和ScaffoldN50长度[1]随着技术的发展，越来越多的物种完成了基因组的测序工作。
但基于二代测序短读长的限制，制约了参考基因组的组装质量，从而影响了后续研究工作的开展。
如今，我们可以利用更多的新技术，如10X Genomics，BioNano，ChiCago等，将基因组组装结果进行完善，进一步构建出高质量的参考基因组。
10X Genomics linked-reads10X Genomics公司通过在序列中引入barcode序列，能够得到跨度在50-100Kb的linked reads信息，与二代测序数据相结合，在Scaffold 的组装上能够得到媲美三代测序的组装结果（表1）。
展开阅读10X Genomic linked-reads辅助基因组组装流程如下图所示：图2 光学图谱工作流程图表3 利用Chicago技术提升相应的指标图3 Chicago文库构建流程图[6]Chicago文库构建流程如下：基因组 de novo 组装新技术助力文章冲刺新高度[1] Mostovoy Y, Levy-Sakin M, Lam J, et al. A hybrid approach for de novo human genome sequence assembly and phasing[J]. Nature methods, 2016. 阅读原文>>/nmeth/journal/v13/n7/abs/nmeth.3865.html[2] Pendleton M, Sebra R, Pang A W C, et al. Assembly and diploid architecture of an individual human genome via single-molecule tech-nologies[J]. Nature methods, 2015. 阅读原文>>/s?wd=paperuri:(ac8d0768*******de9b67e959e5d924b)&filter=sc_long_sign&sc_ks_para=q%3DAssembly+and+diploid+architecture+of+an+individual +human+genome+via+single-molecule+technologies.&tn=SE_baiduxueshu_c1gjeupa&ie=utf-8&sc_us=14004045691020250024[3] VanBuren R, Bryant D, Edger P P , et al. Single-molecule sequencing of the desiccation-tolerant grass Oropetium thomaeum[J]. Nature, 2015. 阅读原文>>/s?wd=paperuri:(4f4baa5f458c3598ebfa32b1017a4569)&filter=sc_long_sign&sc_ks_para=q%3DSingle-molecule+sequencing+of+the+desiccation-tolera nt+grass+Oropetium+thomaeum.&tn=SE_baiduxueshu_c1gjeupa&ie=utf-8&sc_us=3671601047694710580[4] Dong Y, Xie M, Jiang Y, et al.Sequencing and automated whole-genome optical mapping of the genome of adomestic goat (Capra hircus). Nature biotechnology, 2013, 31(2): 135-141. 阅读原文>>/nbt/journal/v31/n2/full/nbt.2478.html [5] Zhang Q, Chen W, Sun L, et al. The genome of Prunus mume. Nature communications, 2012, 3: 1318. 阅读原文>>http://pubmedcentralcanada.ca/pmcc/articles/PMC3535359/[6] Bredeson J V, Lyons J B, Prochnik S E, et al. Sequencing wild and cultivated cassava and related species reveals extensive interspecific hybridization and genetic diversity[J]. Nature biotechnology, 2016, 34(5): 562-570. 阅读原文>>/s?wd=paperuri:(030555bb483ea9f72bf308bf22787f02)&filter=sc_long_sign&sc_ks_para=q%3DSequencing+wild+and+cultivated+cassava+and+related +species+reveals+extensive+interspecific+hybridization+and+genetic+diversity.&tn=SE_baiduxueshu_c1gjeupa&ie=utf-8&sc_us=13838504648880517513[7] Putnam N H, O'Connell B L, Stites J C,et al. Chromosome-scale shotgun assembly using an in vitro method forlong-range linkage[J]. Genome research, 2016, 26(3): 342-350. 阅读原文>>/s?wd=paperuri:(4c8ec46542c7e21bfa15ae10f7a9f8bf)&filter=sc_long_sign&sc_ks_para=q%3DChromosome-scale+shotgun+assembly+using+an+in+vit ro+method+for+long-range+linkage.&tn=SE_baiduxueshu_c1gjeupa&ie=utf-8&sc_us=36575566455777547参考文献Chicago技术（体外Hi-C 技术）作为提供长距离连接数据的组装提升方法，Chicago技术不仅能够获得长序列连接信息，还能帮助组装提升到染色体水平，该技术使用效率高、操作简便、经济性强，并且产生的高质量文库能够更好地应用于后期组装或研究。
动植物基因组de novo常见问题
动植物基因组de novo常见问题基础知识1、什么是基因组de novo测序答：对某一物种进行高通量测序，利用高性能计算平台和生物信息学方法，在不依赖于参考基因组的情况下进行组装，从而绘制该物种的全基因组序列图谱。
2、普通基因组的定义答：单倍体，纯合二倍体或者杂合度<%，且重复序列含量<50%，GC 含量为35%到65%之间的二倍体。
3、复杂基因组的定义答：杂合率＞%，重复序列含量＞50%，GC含量处于异常的范围（GC 含量＜35%或者GC含量＞65%＝的二倍体，多倍体。
诺禾致源对二倍体复杂基因组进一步细分为微杂合基因组（%＜杂合率＜%＝、高杂合基因组（杂合率＞%）以及高重复基因组（重复序列比例>50%）。
4、怎么查询基因组的大小答：查询植物基因组大小的网站：；查询动物基因组大小的网站：。
、5、基因组的项目周期6、基因组承诺的组装指标答：简单基因组：contig N50>20K，scaffold N50>500K；复杂基因组：contig N50>20K，scaffold N50>300K。
样品要求1、动植物基因组测序对取样有什么要求答：植物：需要黑暗无菌条件下培养的黄化苗、组培苗，基因组样本量500μg~1mg，越多越好。
选择纯合或杂合度尽可能小的样品（杂合度<%）。
动物：应选取肌肉、血液等含脂肪较少的部位取样，尽量选择同一个体取样，以减少个体差异性对后续拼接的影响。
基因组样本量500μg~1mg，越多越好。
样本的性别决定模式是XY型，则尽量选择雌性个体（XX型），如果是ZW型，则尽量选择雄性个体（ZZ型）。
2、全基因组测序对DNA样本有什么要求答：（1）样品需求量（单次）：小片段文库，≥3μg；2Kb~5Kb大片段文库，≥20μg；10Kb~20Kb大片段文库，≥60μg；完成全基因组测序样品DNA量需求约为500μg~1mg；（2）样品浓度：对于小片段文库，≥50ng/μl，对于2Kb~5Kb 大片段文库，≥150ng/μl；对于10Kb~20Kb大片段文库，≥150ng/μl；（3）样品纯度：OD260/280=~；无蛋白质、RNA污染或肉眼可见杂质污染；（4）样品质量：基因组完整。
二代测序 denovo 流程
一、概述二代测序（Next Generation Sequencing, NGS）技术的广泛应用，使得基因组学研究取得了长足的进步。
其中，二代测序denovo流程是利用NGS技术对未知生物样本进行全基因组测序，并在此基础上进行基因组组装和注释的过程。
本文将对二代测序denovo流程进行深入探讨，从数据处理到基因组组装和注释等方面进行详细介绍。
二、数据处理在进行denovo全基因组测序之前，首先需要进行数据处理。
数据处理包括测序数据的质量控制、序列过滤和去除低质量序列等步骤。
在质量控制方面，可以利用软件对测序数据进行质量评估，筛选出高质量的测序数据用于后续分析。
针对测序数据中可能存在的接头序列和低质量碱基，需要进行序列过滤和去除低质量序列的处理，确保后续的组装和注释过程能够得到准确的结果。
三、基因组组装基因组组装是denovo流程中的关键步骤，主要是将测序得到的短序列reads进行拼接，重建成完整的基因组序列。
目前，常用的基因组组装算法包括SOAPdenovo、Velvet、ABySS等。
这些算法能够根据reads之间的重叠信息和kmers的频率进行拼接，得到较为完整的基因组序列。
对于大规模基因组的组装，还可以采用高通量测序技术辅助组装，如mate p本人r测序或二代测序测序辅助第三代测序（Hybrid Assembly）等方法。
四、基因组注释基因组注释是denovo流程中的另一个重要步骤，主要是对组装得到的基因组序列进行基因预测、基因功能注释和通路分析等。
在基因预测方面，可以利用软件对基因组序列进行Open Reading Frame （ORF）预测和基因预测，以确定基因的位置和编码序列。
在基因功能注释方面，可以利用生物信息学数据库和工具对基因进行功能和结构注释，帮助研究人员理解基因的生物学功能和作用。
为了进一步了解基因的生物学功能和相互作用，还可以进行通路分析，探究基因在生物体内的作用机制。
五、应用与发展二代测序denovo流程在生命科学研究中有着广泛的应用与发展前景。
高通量测序 名词解释
高通量测序基础知识汇总一代测序技术：即传统的Sanger测序法，Sanger法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，通过检测得到DNA碱基序列。
二代测序技术：next generation sequencing（NGS）又称为高通量测序技术，与传统测序相比，二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定，从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序（Deep sequencing）。
NGS主要的平台有Roche（454 & 454+），Illumina（HiSeq 2000/2500、GA IIx、MiSeq），ABI SOLiD等。
基因：Gene，是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。
基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。
DNA：Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸，一个脱氧核苷酸分子由三部分组成：含氮碱基、脱氧核糖、磷酸。
脱氧核糖核酸通过3',5'-磷酸二酯键按一定的顺序彼此相连构成长链，即DNA链，DNA链上特定的核苷酸序列包含有生物的遗传信息，是绝大部分生物遗传信息的载体。
RNA：Ribonucleic Acid，，核糖核酸，一个核糖核苷酸分子由碱基，核糖和磷酸构成。
denovo测序原理
denovo测序原理
denovo测序是一种基因组测序技术，它的原理是通过对未知DNA序列进行高通量测序，从而获得该DNA的全面序列信息。
在denovo测序中，首先需要提取样本中的DNA，并将其打碎成小片段。
接下来，这些DNA片段会被连接到测序适配器上，形成一个包含多
个不同DNA片段的文库。
然后，这个文库会被放入测序仪中进行测序。
在测序过程中，denovo测序技术通常采用高通量测序平台，如Illumina、PacBio或Oxford Nanopore等。
这些平台使用不同的测
序方法，如Illumina采用的是碱基荧光标记的测序技术，PacBio
和Oxford Nanopore则采用的是单分子实时测序技术。
无论采用何
种测序技术，denovo测序都能够生成大量的短序列读段。
接下来，这些短序列读段会被组装成更长的连续序列，这个过
程称为de novo组装。
在de novo组装中，计算机会利用重叠的短
序列读段来重建原始的DNA序列。
这个过程需要利用算法来解决重
叠序列的拼接问题，从而得到尽可能完整的DNA序列。
最后，经过de novo组装得到的DNA序列会被进一步分析和注
释，以确定其中的基因、重复序列、非编码RNA等功能元件。
这些信息对于研究基因组结构、功能和进化具有重要意义。
总的来说，denovo测序的原理是通过高通量测序技术获取未知DNA序列的信息，并通过组装和分析来揭示其结构和功能。
这项技术在基因组学研究、生物多样性调查、疾病研究等领域具有广泛的应用前景。
全基因组重测序技术在紫花苜蓿基因组研究中的应用
全基因组重测序技术在紫花苜蓿基因组研究中的应用近年来，随着DNA测序技术的飞速发展，全基因组重测序技术越来越广泛应用于各种生物种的基因组研究中。
作为一种重要的草坪植物，紫花苜蓿因其在牧草生产中的重要性而备受关注。
全基因组重测序技术在紫花苜蓿基因组研究中也得到了广泛的应用，并成为推动紫花苜蓿基因组研究进程的重要手段。
一、全基因组重测序技术简介全基因组重测序技术是指对DNA样本进行高通量测序，得到完整的个体基因组序列。
与Sanger测序技术相比，全基因组重测序技术具有高通量、高准确性、高覆盖度和低成本等优点。
其中，高覆盖度是全基因组重测序技术的重要特征。
通过多次测序，可以得到高度重叠的DNA序列，从而消除测序误差，提高数据可靠性。
全基因组重测序技术在遗传疾病研究、生物进化研究、种群遗传学研究等方面发挥了重要作用。
二、全基因组重测序技术在紫花苜蓿基因组研究中的应用1.确定紫花苜蓿基因组组成全基因组重测序技术可以全面揭示紫花苜蓿基因组组成，包括基因数量、长度、可变剪接以及重复序列等特征。
通过这些特征，可以进一步了解紫花苜蓿基因组的基本特征，为进一步研究其基因功能和进化提供基础数据。
2.揭示紫花苜蓿种群遗传学特征全基因组重测序技术可以揭示紫花苜蓿种群遗传学特征，如种群分化、基因流、基因多样性等。
紫花苜蓿广泛分布于全球各地，因而在不同地区的紫花苜蓿种群之间存在不同的遗传结构和遗传差异。
通过全基因组重测序技术，可以比较各种群之间的遗传差异，为紫花苜蓿的种质分类和遗传改良提供依据。
3.挖掘紫花苜蓿基因组特征和功能全基因组重测序技术可用于挖掘紫花苜蓿基因组特征和功能，并鉴定关键基因。
通过比对序列和功能注释，可以快速鉴定出紫花苜蓿基因组中的基因家族、调控因子、信号传导通路等关键功能元件，从而为紫花苜蓿基因功能研究提供基础数据。
4.开展基因组选择研究全基因组重测序技术可用于开展基因组选择研究，并筛选出重要基因。
通过比较不同种群之间的基因表达差异，可以筛选出与环境适应性和产量性状相关的基因。
De novo测序
百泰派克生物科技
De novo测序
De novo测序，又称从头测序，是一项不依赖于任何已知或参考序列的测序技术，它利用生物信息学分析技术将序列片段进行拼接、组装以实现整个序列的鉴定，可用于未知基因组、转录组和蛋白质的全序列分析。
从头测序最重要、最关键的就是对已测得的小片段进行拼接、组装，如果在这个过程中发生拼接错误，那么将会导致整个测序结果不准确。
因此，在测序前将待测样品进行多重酶切以及对序列进行反向验证是保证片段全覆盖以及测序结果准确性的关键因素。
百泰派克生物科技采用高通量质谱平台提供快速准确的蛋白De novo测序服务，包括蛋白质、多肽、单克隆抗体从头测序以及蛋白突变检测等，还可提供定制化的序列分析服务，满足不同的实验需求，欢迎免费咨询。
全基因组从头测序(de novo测序)
全基因组从头测序(de novo测序)/view/351686f19e3143323968936a.html从头测序即de novo 测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。
利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。
一个物种基因组序列图谱的完成，意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。
全基因组序列图谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序列信息。
华大科技利用新一代高通量测序技术，可以高效、低成本地完成所有物种的基因组序列图谱。
包括研究内容、案例、技术流程、技术参数等，摘自深圳华大科技网站/service-solutions/ngs/genomics/de-novo-sequencing/技术优势:高通量测序：效率高，成本低；高深度测序：准确率高；全球领先的基因组组装软件：采用华大基因研究院自主研发的SOAPdenovo软件；经验丰富：华大科技已经成功完成上百个物种的全基因组从头测序。
研究内容: 基因组组装■K-mer分析以及基因组大小估计；■基因组杂合模拟（出现杂合时使用）；■初步组装；■GC-Depth分布分析；■测序深度分析。
基因组注释■Repeat注释；■基因预测；■基因功能注释；■ncRNA注释。
动植物进化分析■基因家族鉴定（动物TreeFam；植物OrthoMCL）；■物种系统发育树构建；■物种分歧时间估算（需要标定时间信息）；■基因组共线性分析；■全基因组复制分析（动物WGAC；植物WGD）。
微生物高级分析■基因组圈图；■共线性分析；■基因家族分析；■CRISPR预测；■基因岛预测（毒力岛）；■前噬菌体预测；■分泌蛋白预测。
熊猫基因组图谱Nature. 2010.463:311-317.案例描述大熊猫有21对染色体，基因组大小2.4 Gb，重复序列含量36%，基因2万多个。
全基因组重测序数据分析
全基因组重测序数据分析1. 简介(Introduction)通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。
我们将在基因组学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。
实验设计与样本（1）Case-Control 对照组设计；（2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）；初级数据分析1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。
2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。
3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。
并根据参考基因组信息对检测到的变异进行注释。
4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。
在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。
对于每个InDel的检测，至少需要3个Paired-End序列的支持。
5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。
全基因组从头测序(de novo测序)
[3] Junjie Qin, Yujun Cui, et al. Open-Source Genomic Analysis of Shiga-Toxin–Producing E. coli O104:H4. N Engl J Med. 2011 Aug 25; 365(8): 718-24.
从头测序（de novo 测序）
从头测序即 de novo 测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分 析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得 动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。一个物种基因组序列图谱的完成， 意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。全基因组序列图 谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；为后 续的基因挖掘、功能验证提供 DNA 序列信息。华大科技利用新一代高通量测序技术，可以高效、低 成本地完成所有物种的基因组序列图谱。
Medicine，NEJM）上在线发表。德国致病性大肠杆菌研究项目首次展示了快速的基因组测序
技术和及时的数据共享给全球各科研领域所带来的巨大贡献，证实了信息数据的快速共享在
公共卫生事件中可发挥至关重要的作用，同时也为应对全球重大突发性紧急公共卫生事件提
供了一个全新的解决思路。
德国肠出血性大肠杆菌项目进展时间轴
全基因组测序从头测序（denovosequencing）重测序（re
全基因组测序从头测序（denovosequencing）重测序（re展开全文全基因组测序全基因组测序分为从头测序(de novo sequencing)和重测序(re-sequencing)。
从头测序(de novo)不需要任何参考基因组信息即可对某个物种的基因组进行测序，利用生物信息学分析方法进行拼接、组装，获得该物种的基因组序列图谱，从而推进该物种的后续研究。
基因组重测序是对有参考基因组物种的不同个体进行的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
基因组重测序主要用于辅助研究者发现单核苷酸多态性位点(SNPs)、拷贝数变异(CNV)、插入/缺失(Indel)等变异类型，以较低的价格将单个参考基因组信息扩增为生物群体的遗传特征。
全基因组重测序在人类疾病和动植物育种研究中广泛应用。
技术路线生物信息分析案例解析1.比较基因组分析采用progressiveMauve软件比对9株大肠杆菌O104:H4分离株的染色体序列，展示可移动遗传元件和基因组可变区域信息，利用核心SNP位点信息构建最大似然进化树揭示菌株间的亲缘关系。
2.重复序列分析采用从头预测和基于数据库比对的两种方法对纳塔尔大白蚁和湿木白蚁的基因组序列进行转座子(TEs)分析，利用RepeatModeler软件对两种方法的结果进行整合分析并构建转座子序列数据库，使用RepeatClassifier软件对转座子进行分类，计算两种白蚁基因组中转座子的序列变异速率，揭示基因组扩张的可能机制。
3.代谢通路重建根据限制性脱氯细菌(PER-K23)基因组注释信息，预测类咕啉的生物合成包含4种代谢途径。
4.基因进化分析利用117个单拷贝编码蛋白的基因序列构建Mollicutes、Haloplasma和Firmicutes菌株的最大似然物种进化树，揭示不同菌株基因组中mreB和fib基因的获得与丢失。
测序策略及数据量测序策略：PE125或PE150建议数据量：根据基因组大小进行30×或50×的测序。
大刍草苗期转录组RNA—Seq数据的denovo拼接
玉米 属 于 禾本 科 （ Ｐ ｏ ａ ｃ ｅ ａ ｅ ） 玉蜀黍属 （ Ｚ ｅ ａ ） ， 玉 义上 包 括 了 ｍＲＮＡ、 ｎ ｏ ｎ － ｃ ｏ ｄ ｉ ｎ ｇ ＲＮＡ 等 ） ， 进 而 推
蜀黍 属 又 被 划 分 成 ５个 种 ， 分别是 Ｚ ． ｄ ｉ ｐ ｌ ｏ ｐ ｅ ｒ ｅ ｎ — 断完整的基因结构， 确定选择性剪切事件 ， 研究在不
比对研 究 。结 果 表 明 ： 转 录组 测 序 共 得 到 了 ４ ６ ． ４ Ｇ Ｂ的原始数据， 归并 整理后 获得长 ７ ６ ｂ ｐ的序 列 有
１ ７ ５ １ ０ １ ２ ５ ０ 条， 经 质量控制 和 ｄ ｅ 舢ｌ Ｕ ｏ拼接后 ， 共获得 了 ５ ８ １ ４ ７条大刍 草转 录本 ， 其平均长 度为 １ ３ ３ ５ ｂ ｐ 。比对 分 析发现其中 ９ ４ ． ３ ％的转录本和玉米 Ｂ ７ ３自交系 的 ｃ Ｄ ＮＡ序 列有较好 的匹配 ， 与水 稻 匹配 的有 ８ ４ ． １ ， 高粱
Ｚ ． ｍａ ｙ ｓ ｓ ｓ ｐ ． ｍｅ ｘ ｉ ｃ ａ ｎ ａ和 Ｚ． ｍａ ｙ ｓ ｓ ｓ ｐ ． ｍａ ｙ ｓ聚在 本 ； 而 基 于 高 通 量 测 序 的 ＲＮＡ— Ｓ ｅ ｑ技 术 则 可 以较
一
类， 后续 对 叶绿体 、 核糖 体 的研 究也 得 到 了相 似结 为全 面地 、 对 几乎 全部 的 Ｒ ＮＡ 转 录本 进行分 析 。 根据 所 研 究 的 物 种 是 否 有 参 考 基 因 组 信 息 ， 的序 列拼 接 和 ｄ ｅ ｎ Ｏ Ｖ Ｏ序 列 拼接 ， 或 当基 因组 信 息
ｎ ｉ ｓ 、 Ｚ ． ｐ ｅ ｒ ｅ ｎ ｎ ｉ ｓ 、 Ｚ ． １ ｕ ｘ ｕ ｒ ｉ ａ ｎ ｓ 、Ｚ ． ｎ ｉ ｃ ａ ｒ ａ ｇ ｕ ｅ ｎ ｓ ｉ ｓ 和 同组 织 、 不 同发育 阶段 、 不 同实验 处 理 中的相关 基 因
Ion torrent De novo测序文库构建方法 De-novo library
De novo测序文库构建方法一、De novo测序的原理De novo测序不需要任何参考序列，即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。
利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、微生物的全基因组序列，从而推进该物种的研究。
De novo测序没有参考序列，需要建立不同片段大小及类型的测序文库，测序后的信息需要组装和拼接。
拟构建200bp和400bp Ion测序文库，以及Ion mate-pair测序文库。
二、文库构建技术路线1. Ion 200 or 400-base-read libraryWorkflow基因组DNA提取↓OD260/280检测，凝胶电泳检测，基因组大小评估，基因组定量↓超声波打断↓末端修复↓片段纯化接头连接↓纯化文库片段筛选（E-Gel胶回收）↓文库片段扩增↓纯化Agilent检测，Qubit定量↓OneTouch、ES↓上机测序2. Ion mate-pair library基因组DNA提取↓基因组定量检测↓DNA破碎（HydroShear DNA Shearing Device）（压力挤压破碎大片段DNA）↓末端修复↓文库片段选择（凝胶电泳，SOLiD凝胶回收试剂盒纯化）↓文库片段定量↓MP接头连接（SOLiD MP接头连接试剂盒）↓纯化Qubit定量↓确定DNA回收量，确定回收到的片段含量（含量不同，使用的试剂量不同）↓DNA片段环化↓分离纯化环状DNA↓定量↓环化DNA缺口修复及SOLiD文库试剂盒纯化↓T7核酸外切酶、S1核酸酶酶切↓纯化末端修复↓文库片段于链霉素亲和素微珠相连↓连接Ion接头↓缺口修复、与扩增凝胶条带检测（确定循环数）↓片段扩增↓SOLiD试剂盒纯化片段切胶回收↓Agilent检测↓Q-PCR定量↓文库构建完成三、文库构建用到的试剂盒Ion Library Adaptors and Primers and 5500 SOLiD Mate-Paired Library Kit Mate-Paired Library Enzyme ModuleMate-Paired Library Amplification ModuleMate-Paired Library Oligo moduleLibrary Micro Column Purification KitAgencourt AMPure XP 60 mL KitQubit 2.0 Fluorometer及相应的试剂Agilent 2100 及相应的试剂四、400bp测序文库构建步骤1.细菌基因组DNA的提取要求客户提供足量菌体。
全基因组重测序数据分析详细说明
全基因组重测序数据分析1. 简介(Introduction)通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。
我们将在基因组学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。
实验设计与样本（1）Case-Control 对照组设计；（2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）；初级数据分析1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。
2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。
3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。
并根据参考基因组信息对检测到的变异进行注释。
4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。
在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。
对于每个InDel的检测，至少需要3个Paired-End序列的支持。
5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。
高通量名词解释
高通量测序常用名词汇总一代测序技术：即传统的Sanger测序法，Sanger法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，通过检测得到DNA碱基序列。
二代测序技术：next generation sequencing（NGS）又称为高通量测序技术，与传统测序相比，二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定，从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序（Deep sequencing）。
NGS主要的平台有Roche（454 & 454+），Illumina（HiSeq 2000/2500、GA IIx、MiSeq），ABI SOLiD等。
基因：Gene，是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。
基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。
DNA：Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸，一个脱氧核苷酸分子由三部分组成：含氮碱基、脱氧核糖、磷酸。
脱氧核糖核酸通过3',5'-磷酸二酯键按一定的顺序彼此相连构成长链，即DNA链，DNA链上特定的核苷酸序列包含有生物的遗传信息，是绝大部分生物遗传信息的载体。
RNA：Ribonucleic Acid，，核糖核酸，一个核糖核苷酸分子由碱基，核糖和磷酸构成。
动植物Denovo测序知识大讲解
动植物Denovo测序知识⼤讲解⾼通量测序的技术开起我们探索动植物基因组奥秘的步伐，提到动植物基因组测序，这就不得不提⼀个概念——de novo测序。
那么什么是de nove测序呢，它与重测序有什么区别呢？De nove测序中Read、Contig和Scaffold等⼜代表什么呢？De nove测序中为什么要建不同⼤⼩⽚段的梯度⽂库？基因注释⼜是注释哪些内容？各位客官别急，且听⼩编给您细细讲来。
1De novo测序概念De novo是⼀个拉丁⽂，代表从头开始的意思，⽽de nove测序则是指在不需要任何参考序列的情况下对某⼀物种进⾏基因组测序，然后将测得的序列进⾏拼接、组装，从⽽绘制该物种的全基因组序列图谱。
由于⾼通量测序长度的限制，⽬前测序策略是先将基因组打断⼩的⽚段，然后再对测出序列⽚段进⾏拼接，最终得到物种的序列图谱如图1所⽰。
图1 ⾼通量测序模式图2De novo测序与重测序区别重测序概念：重测序是全基因组重新测序的简称，是指是对已知基因组序列的物种进⾏不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进⾏差异性分析。
从概念上来看两者的区别在于de nove测序是对没有参考基因组的物种进⾏测序，⽽重测序是对已有基因组的物种进⾏测序，这只是它们区别很⼩的⼀部分。
从原理上来看de nove测序和重测序最根本的区别在于de nove测序需要对测序得到的Reads进⾏拼接组装，⽽重测序得到的数据则是没有组装的短的Reads序列。
值得注意的是，随着测序成本的降低以及组装算法的改进,de nove测序成本越来越低，⽬前来说de nove测序不只对于没有参考基因组物种进⾏测序，还可以对⼀些特有的亚种、品种以及变种等进⾏测序。
3Reads Conting Scaffold概念Reads：即我们通常说的读长的意思，它是指⾼通量测序平台直接产⽣的DNA序列。
Contig：是指Reads基于Overlap关系，拼接获得的长的序列；Scaffold：是指将获得的Contig根据⼤⽚段⽂库的Pair-end关系，将Contig进⼀步组装成更长的序列；关于三者之间的关系如图2所⽰，注意的是Contig是⽆Gap的连续的DNA序列，⽽Scaffold是存在Gap的DNA序列。
基因组denovo深度
基因组denovo深度基因组de novo深度是一种重要的研究方法，可以帮助我们理解生物体的遗传信息。
在这篇文章中，我将以人类的视角来描述这一方法的原理和应用。
让我们来看看什么是基因组de novo深度。
简单来说，它是一种通过测序技术从头开始组装一个生物体的基因组的方法。
与传统的测序方法不同，de novo深度测序可以直接获得一个生物体的全基因组信息，而不需参考已有的相关序列。
那么，为什么我们需要基因组de novo深度呢？这是因为在许多研究中，我们需要了解一个生物体的完整基因组信息，尤其是对于那些没有已知参考基因组的物种来说。
通过de novo深度测序，我们可以获得这些物种的全基因组序列，从而更好地理解它们的遗传特性和进化历史。
在进行基因组de novo深度测序时，首先需要将生物体的DNA提取出来，并进行高通量测序。
然后，利用生物信息学的方法将这些测序数据进行组装，得到一个生物体的基因组序列。
这个过程中，需要借助大量的计算资源和算法，以及对基因组结构和功能的理解。
基因组de novo深度的应用非常广泛。
例如，它可以帮助我们研究物种的进化关系、基因组结构的变异以及基因与表型之间的关系。
同时，它也可以用于研究人类疾病的遗传基础，例如发育异常、遗传疾病和癌症等。
尽管基因组de novo深度是一项复杂的技术，但它为我们揭示了生命的奥秘提供了重要的工具。
通过这种方法，我们可以更好地理解生物体的基因组，为生物学研究和医学应用提供更多的可能性。
基因组de novo深度是一种重要的研究方法，它可以帮助我们获得生物体的完整基因组信息，从而更好地了解生物体的遗传特性和进化历史。
它的应用范围广泛，可以用于研究进化、遗传疾病等领域。
通过不断地改进和发展，基因组de novo深度将为我们揭示生命的奥秘提供更多的突破。
高通量测序技术及其在农业上的应用.ppt
3.4 外显子组测序
外显子组是指全部外显子区域的集合，该区域包含 合成蛋白质所需的重要信息，涵盖了与个体表型相关的绝 大部分功能性变异，能够直接发现与蛋白质功能变异相关 的遗传突变 。
3.5小分子RNA测序
小分子RNA是一类长约20～30个核苷酸的非编码 RNA分子，其介导的转录后基因调控是植物中的一种新型 基因调控机制。
3.1 全基因组重测序
全基因组重测序是对已知基因组序列的物 种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对 个体或群体进行差异性分析。全基因组重测序的 个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸 多态性位点( SNP) 、插入缺失位点( InDel， Insertion/Deletion) 、结 构 变 异 位 点( SV ，Structure Variation) ， 通过生物信息学手 段，分析不同个体基因组间的结构差异，同时完 成注释。
Moxon等利用454－FLX法分析了番茄叶片和果实 中的小分子RNA表达情况，结果表明: 番茄miR390 和 miR1917在果实中的表达量远高于在叶片中，而且 miR1917的靶基因LeCTR1在番茄成熟过程中应答乙烯 时表达量显著下调，因此认为这2个miRNA可能参与了番 茄果实的发育过程。
• 454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序 列拼接工作更加高效、准确。
Illumina Solexa简介
• 桥式PCR • 边合成边测序 • 可逆终止物
HiSeq 2000
Solexa 的特点与主要应用
• 读长较短，100－150bp • 通量高，25G每天，120-150G每Run • 主要应用：RNA测序、表观遗传学研究
3.1.2 利用重测序技术鉴定突变体突变基因
全基因组重测序数据分析
全基1. 简通过变（d 的功况，dise 比较实验（1）（2）基因组重测序简介(Introduc 过高通量测序识deletioin, du 功能性进行综合杂合性缺失ease （cance 较基因组学，群验设计与样本Case-Contr）家庭成员组序数据分析ction)识别发现de plication 以及合分析；我们（LOH ）以及r ）genome 中群体遗传学综ol 对照组设计组设计：父母novo 的som 及copy numb 们将分析基因及进化选择与中的mutation 综合层面上深计 ；-子女组（4人matic 和germ ber variation 因功能（包括与mutation 之n 产生对应的深入探索疾病基人、3人组或m line 突变，）以及SNP miRNA ），重之间的关系；以的易感机制和基因组和癌症多人）；结构变异-SN 的座位；针对重组率（Rec 以及这些关系功能。
我们将症基因组。
NV ，包括重排对重排突变和combination ）系将怎样使得将在基因组学排突SNP）情在学以及初级数据分析1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。
2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。
3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。
并根据参考基因组信息对检测到的变异进行注释。
4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。
在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。
对于每个InDel的检测，至少需要3个Paired-End序列的支持。
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已发表品种 基因集合
全基因组 序列比对
基因家族 聚类分析
变异检测
小的插入 缺失 SNP
倒位 易位 大的插入 缺失
转录组 遗传图谱等 辅助验证
重要农艺 性状解析
基因挖掘
新基因鉴定 拷贝数扩增基因
基因丢失 正选择基因鉴定
诺禾致源的项目经验
诺禾致源在动植物全基因组测序领域一直处于领先地位， 以第一通讯作者发表基因组文章5篇（影响因子累计152.474），其中2篇为杂志封面文章。
物种
水稻 葡萄 猪
品种
栽培水稻（粳稻） 栽培水稻（籼稻） 短花药野生稻 非洲栽培稻 五种野生稻 三种栽培稻 葡萄 丹娜葡萄 杜洛克猪 藏猪
发表杂志（年份）
Science (2002) Science (2002) Nature Communications (2013) Nature Genetics (2014) PNAS (2015) Genome Biology (2014) Nature (2007) Plant Cell (2013) Nature (2012) Nature Genetics (2013)
性状解析方案设计
通过对重要品种高深度(>100X)测序，并进行基因组组装注释： 找到传统测序无法鉴定的高度变异位点，找到更多更准确的SNP位点；找到参考基因组中
所不存在的基因——品种特gt;100X)
基因组 组装 注释
已发表品种 基因组序列
所研究品种 基因组序列
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参考文献
[ 1 ] Li Y, Zhou G, Jiang W, et al. De novo assembly of soybean wild relatives for pan-genome analysis of diversity and agronomic traits[J]. Nature biotechnology, 2014, 32(10): 1045-1052.
另一方面，性状相关基因处于基因组快速进化区域，变异极大，传统测序手段难以鉴定。 目前，de novo测序在有参品种重要性状探究方面的应用愈发广泛， 相关研究结果常见于国际顶级杂志上。
品种
栽培大豆 7种野生大豆 野生耐盐大豆 雷德氏棉 亚洲棉 陆地棉 栽培番茄 抗病番茄 栽培土豆 耐寒土豆
发表杂志（年份）
近年来，诺禾通过自主研发软件与技术革新， 成功地将项目周期压缩至14个月内，费用降低一半以上。
野生大豆泛基因组
特有基因检测 对 7 株代表性野生大豆品种进行全基因组 de novo 测序及 比较基因组分析，发现每个大豆品种中有 1,000~3,000 个品种特有的基因。
高变区变异检测 在传统测序方法中，将研究物种短 reads 比对参考基因组 无法检测到变异位点；在全基因组 de novo 方法中，将 组装后的超长序列比对参考基因组可准确识别高变区域内 的所有变异位点。
[ 3 ] Qi XP, Li M, et al. Identification of a novel salt tolerance gene in wild soybean by whole-genome sequencing. Nature Communica－ tions, 2014(5).
技术服务
领先的基因组学解决方案
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技术资料
基因组de novo、群体进化、变异检测、 遗传图谱、转录组、 ncRNA、
人类基因组、宏基因组、16S ……
硬件平台
中国最高通量基因测序中心
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阅读原文 >>
项目文章
100+文章，650+影响因子
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科技服务
基因组测序 转录调控测序 微生物基因组测序 人类基因组测序 建库测序
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2. 耐盐大豆耐盐基因的发现
2014 年，研究人员对一株耐盐大豆开展了全基因组 de novo 测序，并与栽培大豆基因组进行全基因组比对，通过一条跨过 长达 388 Kb 的重要功能区的 scaffold，发现了巨大的结构变 异，从而成功鉴定出耐盐基因。该基因在栽培大豆中被插入了 一个长达 3.4 Kb 的反转座子，影响了阳离子转运体功能，从 而使栽培大豆失去了耐盐能力。 传统的测序手段，采用的是短 reads 比对，因而对这类大的 结构变异检测精度差、灵敏度低、甚至难以实现检测，而全基 因组 de novo 测序则能很好的克服该问题。
Nature (2010) Nature Biotechnology (2014) Nature Communications (2014) Nature (2012) Nature Genetics (2014) Nature Biotechnology (2015) Nature (2012) Nature Genetics (2014) Nature (2011) Plant Cell (2015)
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重要品种
全基因组de novo 测序
挖掘特异基因 解析特有性状
物种
大豆 棉花 番茄 土豆
重要品种基因组的价值
一些物种，虽然已有参考基因组，但仍然无法找到性状关联基因。 一方面，参考基因组与研究物种差异太大；
[ 2 ] Da Silva C, Zamperin G, et al. The high polyphenol content of grapevine cultivar tannat berries is conferred primarily by genes that are not shared with the reference genome. Plant Cell, 2013, 25(12):4777-88.
阅读原文 >>
案例分享
1. 丹娜葡萄全基因组测序揭示高丹宁含量性状的 分子机制
丹娜葡萄被认为是丹宁含量最高的葡萄品种之一，由于富 含丹宁等抗氧化分子，被认为有延缓衰老的作用。通过对 其基因组测序，研究人员发现与丹宁合成有关的关键酶， 几乎都能找到新的基因。很显然，只依赖已有的参考基因 组，完全无法了解丹娜葡萄高丹宁含量这一性状的遗传基 础，而全基因组 de novo 测序则完美回答了该问题。