蛋白质双向电泳及质谱技术

• 金属螯合染料
– 与现代蛋白质组学研究相兼容的 – 专门与常用微量化学表征过程兼容 – 不包含戊二醛、甲醛或 Tween-20 等，很容易和集成化蛋白质组 学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切 仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合
凝胶的图像处理分析
典型流程
• • • • • • • 凝胶图像的扫描 图像加工 斑点检测和定量 凝胶配比 数据分析 数据呈递和解释 2-DE数据库的建立
用量
24g 尿素加入 25mL H2O 385mg DTT或 500uL 200mM TBP原液 2g 见下表 100uL 0.1% 原液 定容至50mL
IPG 用两亲性电解液的组成
IPG 胶 pH 范围 3-10 4-7 3-6 5-8 7-10
两亲性电 两亲性电 解液范围 解液浓度 (w/v) 3-10 40% 4-6 40% 5-7 40% 3-5 40% 4-6 40% 5-8 40% 7-9 40% 8-10 20%
DNA/RNA的去除
• 样品中含核酸的不利影响
– 能被银染色法染色 – 在凝胶酸性部分产生水平条纹 – 当样品到达IEF凝胶酸性端时，与蛋白质一同沉淀
• 去除方法
– – – – 蛋白沉淀法 DNase/RNase处理 超声(机械破坏)、超高速离心 DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿)
其他杂质的去除
• 脂质
增加样品溶解性的手段
•变性剂
– 改变氢键结构，使蛋白疏水中心暴露伸展 – 尿素、硫尿
•表面活性剂
– 溶解疏水基团 – 离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去 污剂CHAPS等
•还原剂
– 使变性蛋白进一步伸展溶解 – 含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，不带电荷的磷酸三丁酯(TPB)
• 固体杂质
– 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 – 过滤
样品的溶解
• 2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一 • 溶解的目标
– 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成 各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降） – 溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等 物质的去除 – 溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态
SDS 平衡液
50 mM 6M 30% 2% 微量 Tris-HCl 尿素 丙三醇 SDS 溴酚蓝
使被分离的 蛋白质与SDS 完整结合
SDS
IPG 胶条
标记纸片
向电泳缓冲液中加 0.5%的琼脂糖
SDS-PAGE
SDS-PAGE
SDS-PAGE
染色方法
• 胶体考马斯亮蓝染色
– 灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍 – 可实现PAGE的无背景染色 – 会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果
• 胺基黑染色
– 转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白质的染色 – 转印至硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色
• 银染
– 可减少胶内蛋白质产量 – 对某些种类的蛋白质染色效果差 – 对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响
银染色
50% 甲醇 25% 乙酸 4h ddH2O 洗3次 30min/次 ddH2O 30 sec
样品制备流程及注意事项
预处理
(清洗等)
破碎
富集
按溶解度分级
溶解
除杂
样品的破碎
原则－最小限度的减少蛋白水解和其它形式 的蛋白降解
样品的来源
易碎的细胞 坚硬的组织 植物细胞 真菌
温和
方法
剧烈
温和破碎法
• 渗透压冲击(培养的细胞)
– 低渗液中的悬浮细胞
• 反复冻融法(细菌)
– 液氮冷冻
3% Na2CO3 0.0185% 甲醛
0.004% DTT 溶液 30min
2.3M 柠檬酸
0.1% AgNO3 30min
5% 乙酸 25% 甲醇
染色方法
• 负染
– – – – –
– – – –
主要包括金属盐染料、锌－咪唑染料等的使用 能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率 速度快（5~15min）且能保持蛋白质的生物活性 不能用于膜上染色 适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析
• IPG胶条的pH范围
– – – – 预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长
第一向：等点聚焦
1. 放臵电极垫 (?) 2. 200 V 3. 500 V 维持 维持 1.5h 1.5h
支架盖 IPG 胶条 电极
电极垫
4. 1000 V 梯度上升
5. 8000 V 梯度上升 (?)
1500vh
为什么要进行样品制备 ？
目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质 点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上。 待研究样本(如临床样本)常是各种细胞和组织混 杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。
样品制备原则
1 保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰因素少
– 尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋 白）。 – 避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降 解等）。
样品溶液 样品溶液 体积 体积 (/5ml) (/5ml) 25l 250 l 12.5 l 125 l 12.5 l 125 l 25 l 250 l 12.5 l 125 l 25 l 250 l 12.5 l 125 l 25 l 250 l
• 关键-可溶性
– 获得可以重新溶解的蛋白
• 常用方法
– – – – – 硫酸铵沉淀 TCA沉淀 丙酮沉淀 TCA/丙酮沉淀 醋酸铵/甲醇/苯酚抽提
样品中杂质的去除
• 去除原则
– 尽量不丢失蛋白 – 减少蛋白的修饰
• 杂质的主要种类
– – – – DNA/RNA 脂质 多糖盐 离子去污剂
– 其他固体杂质
– 细胞在剪切力作用下破碎
• 研磨(固体组织，微生物)
– 液氮中将固体组织磨成细粉末
• 样品研磨器(用于少量样品的处理)
– 用于精确样品
• 珠磨法(胞悬液，微生物)
– 通过磨珠研磨破坏细胞壁
样品的沉淀
• 作用
– 去除杂质 – 浓缩样品 – 抑制蛋白酶活性
对于疏水性特别强的蛋白 如膜蛋白
– 硫脲 – SDS – 新型两性表面活性剂(如磺 基甜菜碱)
– 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 – 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可 检测性。 – 通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。
2 最大限度减少样品的损失
– – – – 低温保存样品(一般需低于-86℃) 尽量缩短处理时间 除盐，省略不必要的过程 保证样品在聚焦时不发生蛋白的聚集和沉淀。
主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等 高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质 灵敏度与PAGE胶内的银染类似 不用于胶内染色
• 胶体扩散染料
染色方法
• 有机荧光团染料
– 包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类，后者最为常用， 其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、 Orange、 Ruby等荧 光染料 – 可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色，约30~60min完成 – 灵敏度为2~10ng其线性范围为3个数量级 – 在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进 行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质
• 第二向采用梯度胶进行分离
• 去除高丰度蛋白，进行蛋白的分级处理，富集低丰度蛋白
蛋白质质谱技术
质谱基础
检测 电离
质量分选(过滤)
离子源
形成离子 (带电分子)
质量分析器
根据m/z分选离子
离子检测器
IPG 胶条支架
IPG 胶条 定位
泡涨目的：使样品能完全以可溶形式进入 IPG胶条内
蛋白载样量
IPG胶条对蛋白载样量的影响因素：
• 待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度 • 样品的复杂度
– 复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验 才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。
– 使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI – 丙酮沉淀
• 多糖
– 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 – TCA、硫酸铵或醋酸铵/甲苯/苯酚沉淀；超速离心和高pH
• 盐
– 使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生 – 透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮
• 离子去污剂
– 如SDS，使蛋白质带负电不能聚焦 – 丙酮沉淀；将含SDS的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如CHAPS，Triton X-100，NP-40等的缓冲液中并使SDS终浓度＜0.25%
2-DE 分离的可溶性 E. coli 蛋白
目前双向电泳需解决的问题
• 样品的制备及溶解
– 不溶性蛋白(膜蛋白及核内蛋白) – 难分离蛋白(如毛发及皮肤中的蛋白)
• • • • •
载样量的提高 初步分离 低丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白 定量分析 灵敏度及可重复性
对于双向电泳的建议
• 首先采用宽pH范围的胶条，确定蛋白的分布范围，通常采 用pH3-10的胶条 • 如果pH线性分布的胶条分离效果不好，可采用非线性胶条 • 加大蛋白上样量，提高局部蛋白的分辨率 • 采用窄pH范围的胶条，提高某pH范围蛋白的分辨率
• 去污剂降解(酵母、霉菌)
– 降解缓冲液(含尿素和去污剂) – SDS(应在IEF前去除)
• 酶降解(植物、细菌、真菌)
– 溶菌酶(细菌) – 纤维素酶，果胶酶(植物) – 溶壁酶(酵母)
剧烈破碎法
• 超声破碎(细胞悬浮液)
– 需以冰冷却避免过热
• 弗式细胞压碎器(French pressure cell，带壁微生物
•起载体作用的两性电解质
– 到达平衡位臵形成pH梯度，“运载”电流、pH – 捕获样品中少量盐分 – 浓度应小于0.2％（w/v，浓度过高会使IEF的速度降低)
样品液的准备
标准液： 试剂 8M 尿素 50mM DTT 或2mM TBP 4% CHAPS 0.2%两性电解质载体 0.0002%溴酚蓝 ddH2O
蛋白质双向电泳及质谱 技术
蛋白质双向电泳技术
双向电泳简介
2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千 种蛋白质的技术 。 第一向—等点聚焦(IEF)
– pH梯度载体 – pI
第二向—十二烷基硫酸钠-PAGE(SDS-PAGE)
– SDS作为变性剂和助溶剂 – 分子量
双向电泳的基本原理与流程示意
CH2 = CH-C-NH-R O
Biblioteka Baidu
聚丙烯酰胺凝胶
宽pH梯度及窄pH梯度
• 宽pH梯度用于：
全部蛋白(确定感兴趣蛋白 的大致位臵)
• 窄pH梯度用于：
提高分辨率 增加载样能力以检测、分析 更多蛋白
IPG 胶的重泡涨及上样
2-DE 样品 重泡涨溶液
重泡涨溶液：
8M 2% 2% 0.28% 微量 尿素 NP-40 或 CHAPS IPG缓冲液 (两亲性电解液) DTT 溴酚蓝
36000vh
电压
时间
IPG 胶条的平衡
• 平衡液
– 6 M 尿素和30% 甘油 – 减少电内渗
• 第一步平衡
– 加DTT – 使变性的非烷基化蛋白处于还原状态
• 第二步平衡
– 加碘乙酰胺 – 使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化
第二向: SDS-PAGE
• SDS 平衡 • SDS-PAGE
样品制备注意事项
• 蛋白质水解
– 低温 – Tris碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质 – 蛋白抑制剂
• 特殊样品的制备
– 低丰度蛋白的分离
• 预分级 • 窄pH胶(<2个pH单位)
– 强碱性蛋白(如核糖体)的处理
• 预处理富集 • 特殊pH梯度的IPG胶条（如pH3－12、4-12或10-12）进行等电聚焦
两性电解质
pH 9 聚丙烯酰胺 pH 3 +
样品
-
等点聚焦 (第一向)
第二向
分子量
SDS-PAGE
pH 梯度(pI)
双向电泳具体步骤
• 样品制备
– 缓冲液的配制
• IPG条重泡涨及上样 • 第一向：IEF • IPG条平衡
– 平衡缓冲液Ⅰ(还原) – 平衡缓冲液Ⅱ(巯烷基化)
• 第二向：SDS-PAGE • 胶条染色 • 成像及图像分析
– 极端分子量蛋白的处理
• 小于8kD 对流混合，产生绒毛状或模糊的带 • 大于200kD的蛋白，变性为多肽
固定pH梯度(Immobilized pH Gradient, IPG)胶条的制备
梯度器
A
酸 碱
塑料支持膜
D
B
E
C
F
pH 3
pH 10
固定pH 梯度(IPG)示意图
丙烯酰胺单体 酸缓冲基团：COOR 碱缓冲基团： NH3+