原代肝细胞培养
原代细胞培养：原代肝细胞
【嘉美生物】肝是生物转化和蛋白质合成的主要器官，也是药物毒性作用发挥的主要场所。
因此许多的体外测试都选用肝细胞来研究药物间的相互作用和其他一些生化过程。
嘉美生物用于培养原代细胞的组织采集于各大医院（包括协和医院、301医院、北三医院等），采集根据美国IRB 和HIPAA批准的方案进行。
这些原代细胞均来自新鲜组织，并采用公司专利的技术来优化目的细胞生长条件，降低杂细胞（如脂肪细胞、纤维细胞等）的污染。
分离的细胞经过短暂培养、传代，然后迅速冻存。
这些保持分化状态的细胞可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。
嘉美生物原代肝细胞产品均经过严格的QA/QC检测，可以直接用于药物优化和筛选、基因克隆、表达图谱分析以及各种分子生物学和药物学实验的研究。
凭借着先进的技术设备和资深的专业经验，嘉美生物能为您提供高品质的原代细胞产品和特殊的定制服务：1、各种新鲜原代肝细胞嘉美生物除提供多种人、小鼠、大鼠、猴等新鲜肝细胞产品外，嘉美生物还可以为您提供特定动物、特定组织、特定年龄的新鲜肝细胞定制服务。
2、各种原代细胞提取物嘉美生物除提供的人、小鼠、大鼠、猴等四大类的肝微粒体、肝S9、CYP450酶和其他亚细胞提取物外，嘉美生物还可以为您提供专业的原代细胞提取物定制服务。
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目前，嘉美生物可以提供180多种来自小鼠、大鼠、狗、猴和人（正常和病变）原代肝细胞，同时嘉美生物可以根据您的需求，为您提供专业的原代肝细胞定制服务。
嘉美生物提供的原代肝细胞定制服务具有以下优势：1)、定制服务周期短：正常情况下，一般需要4-6周。
2)、肝细胞种类广：一般为小鼠、大鼠、狗、猴、人等，还可以根据您的具体需求提供特定动物的肝细胞。
心肌细胞或肝细胞原代培养的方法
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小鼠原代肝细胞培养
一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法1材料与方法1.1动物2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。
1.2试剂D-hank's液；消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）；小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。
1.3鼠肝组织块培养1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。
2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。
5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。
待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。
1.4鼠肝细胞单层培养动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。
小鼠原代肝细胞分离培养
小鼠原代肝细胞分离培养准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。
分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA 的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM 和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。
注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。
大鼠原代肝细胞分离和培养
小鼠原代肝细胞分离和培养原代肝细胞分离和培养试剂（1）无钙灌流液NaCl 8.3 gKCl 0.5 gHEPES 2.4 gEDTA 0.015 g青霉素105 U链霉素 0.1 g用适量超纯H2O溶解，1 mol·L-1NaOH或1 mol·L-1HCl调节pH至7.4，加超纯H2O定容至1 L。
（2）胶原酶溶液NaCl 8.0 gKCl 0.4 gCaCl20.56 gNa2HPO4·12H2O 0.134 gKH2PO4 0.06 gNaHCO30.35 g葡萄糖 1.00 gHEPES 5.96 g用适量超纯ddH2O溶解，1 mol·L-1NaOH或1 mol·L-1HCl调节pH至7.5-7.6，加超纯H2O定容至1 L每次酶灌流液用量25 mL，临用前加入IV型胶原酶12.5 mg。
（3）HBSS缓冲液NaCl 8.0 gKCl 0.4 gCaCl20.14 gMgSO4·7H2O 0.2 gNa2HPO4·12H2O 0.134 gKH2PO40.06 gNaHCO30.35 g葡萄糖 1.00 gHEPES 5.96 g用适量ddH2O溶解，1 mol·L-1NaOH或1 mol·L-1HCl调节pH至7.4，加超纯H2O定容至1 L。
以上溶液均过滤灭菌。
肝细胞的消化分散采用两步法：先用无钙灌流液作预灌流，目的在于冲去残积血，除去或减少肝细胞间的钙离子，以减小细胞间的粘着力。
然后再用含钙的胶原酶灌流液灌流，以消化细胞间质而分散肝细胞，具体步骤如下：①预灌流：健康SD大鼠（体重150～200 g），禁食8 h后，水合氯醛（10%）麻醉，四肢伸展腹部向上背部固定于操作台上，胸腹部酒精消毒。
小心打开腹腔，暴露分离肝门静脉，用留置针门静脉插管，动脉夹立即夹紧，剪断下腔静脉以37℃无钙灌流液以流速20 mL·min-1开放灌流，并迅速剪断下腔静脉以备灌流液顺畅流出。
小鼠原代肝细胞培养及细胞增殖的分子机制研究
小鼠原代肝细胞培养及细胞增殖的分子机制研究细胞增殖是生物体生长和发育的重要过程，也是生物体不断更新、修复和再生的关键环节。
肝脏是一个细胞增殖活跃的器官，在肝脏组织受到损伤时，原代肝细胞从G0期重新进入G1期，进行增殖复制，以恢复受损组织。
因此，研究原代肝细胞的培养和细胞增殖分子机制，对于治疗肝脏疾病和肿瘤有重要的意义。
一、小鼠原代肝细胞培养方法小鼠原代肝细胞培养可采取悬浮培养法或贴壁培养法，其中贴壁培养法是最常用的方法之一。
贴壁培养法分为单层培养和三维培养两种方式。
单层培养法是将小鼠肝细胞分离和培养在含有培养基和血清等营养物质的培养皿上，细胞可以黏附于培养皿底部形成单层肝细胞。
这种培养方法常用于细胞增殖和分化实验中。
三维培养法则是将肝细胞培养在类似于肝实质的支架中，使之形成三维结构，这种培养方法可用于肝脏疾病和肝细胞转化研究。
二、小鼠原代肝细胞增殖与细胞周期细胞增殖是一种高度有序的生物过程，受到一系列分子间相互作用的调节。
在小鼠原代肝细胞中，增殖过程主要分为细胞周期的四个时期：G1期、S期、G2期和M期。
其中，S期是DNA合成期，在这期间，DNA聚合酶启动并开始合成新的DNA链。
细胞周期主要受到细胞因子、信号转导途径和细胞周期蛋白等分子的调节。
其中CDK4和CDK6是G1期调节蛋白，它们与细胞周期蛋白D（CyclinD）结合，促进细胞从G1期进入S期。
细胞周期调节蛋白CDK1和CyclinB主要调节细胞从G2期进入M期。
同时，Tp53，Rb等一些肿瘤抑制蛋白也起到重要作用，它们在癌症等疾病中的失调造成了DNA损伤修复的延迟和细胞周期的异常。
三、小鼠原代肝细胞增殖的信号通路小鼠原代肝细胞增殖不仅受到细胞周期调节蛋白的调节，在信号通路的调节下也会发生变化。
目前已知的信号通路包括Wnt/β-catenin信号通路，TGF-β信号通路，VEGF信号通路等。
Wnt/β-catenin信号通路的激活可以促进小鼠原代肝细胞增殖，同时也与肝癌细胞的形成有关。
原代肝细胞培养方法
原代肝细胞培养方法原代肝细胞培养是一种重要的技术手段，它可以使我们更好地理解肝细胞的生物学特性和功能，同时也被广泛应用于药物筛选、毒性研究和肝脏疾病模型的建立。
本文将探讨原代肝细胞培养的方法。
原代肝细胞是从动物（如小鼠、大鼠、猪等）或人体新鲜肝组织中分离得到的肝细胞。
它们具有种独立性和细胞特异性功能，是进行体外研究的理想模型细胞。
原代肝细胞培养的主要步骤包括：肝组织的分离、肝细胞的分离和纯化、肝细胞的培养和维持。
首先，肝组织的分离是原代肝细胞培养的起始步骤。
一般来说，选择健康的动物或人体捐赠的新鲜肝组织，快速解剖分离，并将其置于含有冷蘸过消毒的生理盐水或缓冲液的离心管中。
然后，用小剪刀对肝组织进行切细，使其暴露于细胞分离液或酶溶液中。
常用的细胞分离液包括肝素-胰酶、胰酶、胶原酶、凝集酶及胰蛋白酶。
这些酶能够降解结缔组织，使肝细胞从肝组织中游离出来。
接下来，肝细胞的分离和纯化是确保原代肝细胞培养成功的关键一步。
一般而言，将细胞分离液转移至新离心管，并用对应的培养基对其停滞，使浮游的肝细胞顺应性地附着在组织培养器皿的底部。
在培养基的作用下，非肝细胞（如纤维细胞和非肝上皮细胞）会悬浮离开，而肝细胞则紧密附着在培养器皿上。
此时，我们可以通过控制等粘附时间、细胞数目、培养基的组分和浓度，使纯化程度达到最佳。
然后，肝细胞的培养和维持是原代肝细胞培养的持续关键步骤。
首先，选择合适的培养基是非常重要的。
常用的培养基包括DMEM、威利精简培养基和L-15培养基等。
这些培养基中会添加适量的营养物质（如葡萄糖、氨基酸和维生素）和生长因子（如胰岛素、胆固醇和转铁蛋白）。
其次，细胞密度的控制也非常重要。
通常，当细胞趋于稳定时，可以通过减少培养皿内细胞的数量来避免细胞互相竞争和过度分泌胺碱酸等蛋白质。
此外，保持培养环境的稳定也是原代肝细胞培养的重要环节。
温度、湿度、CO₂浓度和培养基的更新等因素都会对肝细胞的生长和功能有一定的影响。
肝细胞原代培养标准操作规程
细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程实验试剂培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。
D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存）0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃保存）)PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存）鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配）0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mLOverlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配）Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2•6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4•7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存）实验仪器CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）；Sigma高速离心机；IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）；DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）；液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）；Sigma5310离心机；ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。
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原代肝细胞培养
原代肝细胞培养
1．实验材料
灌流液：NaCl、KCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.H2O、NaHCO3、HEPES、EDTA、Glucose （国药或阿拉丁）。
消化液：Collagenase IV（Yeasen，翊圣生物，产品货号：40510ES60，100 mg ，279￥）、CaCl2。
Percoll：Percoll（GE Healthcare，17-0891-02）我买的是分装的100ml，450￥的17-0891-01-1。
麻醉剂：10%水合氯醛。
实验器材：200目细胞筛、20ml 注射器、头皮针、手术剪3把、手术镊3把（实验前灭菌），细胞培养皿2个，离心机，实验前备冰盒及水浴锅，鼠板及大头针（实验前酒精及紫外消毒）。
2. 实验前准备
1) 灌流液
Perfusion Solution
NaCl KCl NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.H2O NaHCO3 HEPES EDTA Glucose
离子）。
用前37℃温育。
每只老鼠消耗15ml灌流液。
2）消化液
100× CaCl2：560mg CaCl2，加入10 ml PBS/ ddH2O，分装-20℃保存。
10× CollagenaseIV：100 mgCollagenaseIV粉末溶于20 mlDMEM（无血清），0.22 uM滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装。
消化液：13.5 mlDMEM（无血清）加入150 μl100× CaCl2（终浓度5 mM），再加入1.5 ml10× CollagenaseIV（终浓度0.5 mg/ml），于37℃温育。
每只老鼠消耗15ml消化液。
3）40%Percoll
g/L 8.0 0.4 0.078 0.151 0.35 2.380 0.19 0.9
调节pH 7.2-7.4，配好后过滤除菌。
（不能高压灭菌，其中含葡萄糖及HCO3-
16.2 ml 100%percoll原液，加入1.8 ml10×PBS，再加入27ml 1×PBS，得45 ml。
（等渗溶液）
每只老鼠消耗5-6 ml40%Percoll。
4）1×PBS
1×PBS NaCl KCl Na2HPO4.12H2O
KH2PO4
HCl调节PH至7.4。
5）培养基
DMEM：含10%FBS，1%双抗。
实验前4℃预冷。
实验前一天准备所需手术器械高压灭菌。
实验前将鼠板及托盘置于超净台中紫外灭菌，准备水浴锅以及冰盒。
配置CollagenaseIV消化液，灌流液及消化液均于37℃温育。
C57BL/6或Babl/c小鼠麻醉后，于超净台内鼠板上固定，酒精消毒腹部皮肤。
g/L 8.0 0.2 3.62 0.151
3. 实验方法
剪刀小心剪开腹部皮肤分离至两侧，小心分离腹膜，将肠道移至一侧，于下腔静脉插
入头皮针，剪开门静脉，灌注15 ml灌流液（20ml注射器），后接着灌注15 ml消化液（肝本身有阻力，消化液灌注约3 min作用，灌注完成后消化即完成）。
准备培养皿，加入预冷的DMEM（含血清），将肝组织转移至培养皿，手术镊撕碎（可见一粒粒的肝细胞），用移液枪轻轻吹两下，经200目细胞筛滤至另一培养皿中（尽量不
要吸到肝组织），剩余肝组织再加入少量预冷DMEM，进一步将肝组织撕碎，同样方法滤至培养皿中。
500 rpm，3min，离心去除细胞碎片、死细胞、血细胞等，重复离心2遍。
准备15 ml离心管，底部先加3 ml 40%percoll，将上述离心好的细胞重悬（用6 mlDMEM），缓慢滴加加到Percoll上方（每管3ml）（注意不要将细胞悬液冲到percoll
下方）。
2000 rpm，5min，4℃，离心后弃上清以percoll，留底部肝细胞，DMEM重悬，500 rpm，5min，离心去除残余的percoll，重悬后得纯化的肝实质细胞。
每只小鼠的肝细胞可种2~3 块板。
7-8 h贴壁，次日加药。
实验周期不要超过3-4天。