原代肝细胞培养
原代细胞培养：原代肝细胞
【嘉美生物】肝是生物转化和蛋白质合成的主要器官，也是药物毒性作用发挥的主要场所。
因此许多的体外测试都选用肝细胞来研究药物间的相互作用和其他一些生化过程。
嘉美生物用于培养原代细胞的组织采集于各大医院（包括协和医院、301医院、北三医院等），采集根据美国IRB 和HIPAA批准的方案进行。
这些原代细胞均来自新鲜组织，并采用公司专利的技术来优化目的细胞生长条件，降低杂细胞（如脂肪细胞、纤维细胞等）的污染。
分离的细胞经过短暂培养、传代，然后迅速冻存。
这些保持分化状态的细胞可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。
嘉美生物原代肝细胞产品均经过严格的QA/QC检测，可以直接用于药物优化和筛选、基因克隆、表达图谱分析以及各种分子生物学和药物学实验的研究。
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目前，嘉美生物可以提供180多种来自小鼠、大鼠、狗、猴和人（正常和病变）原代肝细胞，同时嘉美生物可以根据您的需求，为您提供专业的原代肝细胞定制服务。
嘉美生物提供的原代肝细胞定制服务具有以下优势：1)、定制服务周期短：正常情况下，一般需要4-6周。
2)、肝细胞种类广：一般为小鼠、大鼠、狗、猴、人等，还可以根据您的具体需求提供特定动物的肝细胞。
心肌细胞或肝细胞原代培养的方法
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小鼠原代肝细胞培养
一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法1材料与方法1.1动物2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。
1.2试剂D-hank's液；消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）；小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。
1.3鼠肝组织块培养1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。
2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。
5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。
待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。
1.4鼠肝细胞单层培养动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。
小鼠原代肝细胞分离培养
小鼠原代肝细胞分离培养准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。
分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA 的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM 和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。
注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。
大鼠原代肝细胞分离和培养
小鼠原代肝细胞分离和培养原代肝细胞分离和培养试剂（1）无钙灌流液NaCl 8.3 gKCl 0.5 gHEPES 2.4 gEDTA 0.015 g青霉素105 U链霉素 0.1 g用适量超纯H2O溶解，1 mol·L-1NaOH或1 mol·L-1HCl调节pH至7.4，加超纯H2O定容至1 L。
（2）胶原酶溶液NaCl 8.0 gKCl 0.4 gCaCl20.56 gNa2HPO4·12H2O 0.134 gKH2PO4 0.06 gNaHCO30.35 g葡萄糖 1.00 gHEPES 5.96 g用适量超纯ddH2O溶解，1 mol·L-1NaOH或1 mol·L-1HCl调节pH至7.5-7.6，加超纯H2O定容至1 L每次酶灌流液用量25 mL，临用前加入IV型胶原酶12.5 mg。
（3）HBSS缓冲液NaCl 8.0 gKCl 0.4 gCaCl20.14 gMgSO4·7H2O 0.2 gNa2HPO4·12H2O 0.134 gKH2PO40.06 gNaHCO30.35 g葡萄糖 1.00 gHEPES 5.96 g用适量ddH2O溶解，1 mol·L-1NaOH或1 mol·L-1HCl调节pH至7.4，加超纯H2O定容至1 L。
以上溶液均过滤灭菌。
肝细胞的消化分散采用两步法：先用无钙灌流液作预灌流，目的在于冲去残积血，除去或减少肝细胞间的钙离子，以减小细胞间的粘着力。
然后再用含钙的胶原酶灌流液灌流，以消化细胞间质而分散肝细胞，具体步骤如下：①预灌流：健康SD大鼠（体重150～200 g），禁食8 h后，水合氯醛（10%）麻醉，四肢伸展腹部向上背部固定于操作台上，胸腹部酒精消毒。
小心打开腹腔，暴露分离肝门静脉，用留置针门静脉插管，动脉夹立即夹紧，剪断下腔静脉以37℃无钙灌流液以流速20 mL·min-1开放灌流，并迅速剪断下腔静脉以备灌流液顺畅流出。
小鼠原代肝细胞培养及细胞增殖的分子机制研究
小鼠原代肝细胞培养及细胞增殖的分子机制研究细胞增殖是生物体生长和发育的重要过程，也是生物体不断更新、修复和再生的关键环节。
肝脏是一个细胞增殖活跃的器官，在肝脏组织受到损伤时，原代肝细胞从G0期重新进入G1期，进行增殖复制，以恢复受损组织。
因此，研究原代肝细胞的培养和细胞增殖分子机制，对于治疗肝脏疾病和肿瘤有重要的意义。
一、小鼠原代肝细胞培养方法小鼠原代肝细胞培养可采取悬浮培养法或贴壁培养法，其中贴壁培养法是最常用的方法之一。
贴壁培养法分为单层培养和三维培养两种方式。
单层培养法是将小鼠肝细胞分离和培养在含有培养基和血清等营养物质的培养皿上，细胞可以黏附于培养皿底部形成单层肝细胞。
这种培养方法常用于细胞增殖和分化实验中。
三维培养法则是将肝细胞培养在类似于肝实质的支架中，使之形成三维结构，这种培养方法可用于肝脏疾病和肝细胞转化研究。
二、小鼠原代肝细胞增殖与细胞周期细胞增殖是一种高度有序的生物过程，受到一系列分子间相互作用的调节。
在小鼠原代肝细胞中，增殖过程主要分为细胞周期的四个时期：G1期、S期、G2期和M期。
其中，S期是DNA合成期，在这期间，DNA聚合酶启动并开始合成新的DNA链。
细胞周期主要受到细胞因子、信号转导途径和细胞周期蛋白等分子的调节。
其中CDK4和CDK6是G1期调节蛋白，它们与细胞周期蛋白D（CyclinD）结合，促进细胞从G1期进入S期。
细胞周期调节蛋白CDK1和CyclinB主要调节细胞从G2期进入M期。
同时，Tp53，Rb等一些肿瘤抑制蛋白也起到重要作用，它们在癌症等疾病中的失调造成了DNA损伤修复的延迟和细胞周期的异常。
三、小鼠原代肝细胞增殖的信号通路小鼠原代肝细胞增殖不仅受到细胞周期调节蛋白的调节，在信号通路的调节下也会发生变化。
目前已知的信号通路包括Wnt/β-catenin信号通路，TGF-β信号通路，VEGF信号通路等。
Wnt/β-catenin信号通路的激活可以促进小鼠原代肝细胞增殖，同时也与肝癌细胞的形成有关。
原代肝细胞培养方法
原代肝细胞培养方法原代肝细胞培养是一种重要的技术手段，它可以使我们更好地理解肝细胞的生物学特性和功能，同时也被广泛应用于药物筛选、毒性研究和肝脏疾病模型的建立。
本文将探讨原代肝细胞培养的方法。
原代肝细胞是从动物（如小鼠、大鼠、猪等）或人体新鲜肝组织中分离得到的肝细胞。
它们具有种独立性和细胞特异性功能，是进行体外研究的理想模型细胞。
原代肝细胞培养的主要步骤包括：肝组织的分离、肝细胞的分离和纯化、肝细胞的培养和维持。
首先，肝组织的分离是原代肝细胞培养的起始步骤。
一般来说，选择健康的动物或人体捐赠的新鲜肝组织，快速解剖分离，并将其置于含有冷蘸过消毒的生理盐水或缓冲液的离心管中。
然后，用小剪刀对肝组织进行切细，使其暴露于细胞分离液或酶溶液中。
常用的细胞分离液包括肝素-胰酶、胰酶、胶原酶、凝集酶及胰蛋白酶。
这些酶能够降解结缔组织，使肝细胞从肝组织中游离出来。
接下来，肝细胞的分离和纯化是确保原代肝细胞培养成功的关键一步。
一般而言，将细胞分离液转移至新离心管，并用对应的培养基对其停滞，使浮游的肝细胞顺应性地附着在组织培养器皿的底部。
在培养基的作用下，非肝细胞（如纤维细胞和非肝上皮细胞）会悬浮离开，而肝细胞则紧密附着在培养器皿上。
此时，我们可以通过控制等粘附时间、细胞数目、培养基的组分和浓度，使纯化程度达到最佳。
然后，肝细胞的培养和维持是原代肝细胞培养的持续关键步骤。
首先，选择合适的培养基是非常重要的。
常用的培养基包括DMEM、威利精简培养基和L-15培养基等。
这些培养基中会添加适量的营养物质（如葡萄糖、氨基酸和维生素）和生长因子（如胰岛素、胆固醇和转铁蛋白）。
其次，细胞密度的控制也非常重要。
通常，当细胞趋于稳定时，可以通过减少培养皿内细胞的数量来避免细胞互相竞争和过度分泌胺碱酸等蛋白质。
此外，保持培养环境的稳定也是原代肝细胞培养的重要环节。
温度、湿度、CO₂浓度和培养基的更新等因素都会对肝细胞的生长和功能有一定的影响。
肝细胞原代培养标准操作规程
细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程实验试剂培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。
D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存）0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃保存）)PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存）鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配）0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mLOverlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配）Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2•6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4•7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存）实验仪器CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）；Sigma高速离心机；IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）；DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）；液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）；Sigma5310离心机；ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。
原代肝细胞培养
试验动物:８～９周龄健康雌性小鼠１０只。
供试小鼠自由饮食，二级饲养，试验前２４ｈ禁食。
主要试剂:1.Solution C:480Mm KCL120Mm MgSO4120Mm KH2PO42.Buffer A(1L):NaCL 7gNaHCO3 2g1M HEPES Ph7.45 5mlSolution c 10mlGlucose 1gAdd ddw and adjust pH to 7.43.灌洗液A:Buffer A with 1Mm EGTA +PS 过滤，37度温浴待用4.灌洗液B（50ml）：Buffer A with 5Mm CaCL2, 25mg胶原酶IV + PS 过滤，37度温浴待用5.胶原酶Ⅳ，购自Ｓｉｇｍａ公司；6.ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养液7.透析胎牛血清（ＦＢＳ）8.青霉素－链霉素双抗9.0.4%的Trypan Blue：0.4g Trypan Blue to 100ml ddw用NaOH调PH值7.2-7.3, 4度储存。
步骤:1.经腹部注射巴比妥钠（50-100ｍｇ／ｋｇ）麻醉供试小鼠，5-10min。
70％乙醇消毒皮肤后，将小鼠移至超净工作台，固定于消毒的聚乙烯泡沫板上.2.剪开小鼠腹部，剥离皮肤，将静脉留置针插入肝脏门静脉，剪开下腔静脉，灌注预热（37 ℃）的灌注液A，保持灌注液流速为10～15ｍＬ／ｍｉｎ3.至小鼠肝脏完全变灰黄、下腔静脉已无血丝流出时，改用３７～３８℃预热的灌注液B继续灌注小鼠肝脏，同时在下腔静脉插入留置针，通过医用输液管收集消化酶液，循环灌注液B，保持灌注液流速为10～15ｍＬ／ｍｉｎ，持续灌注10～15min，使肝脏完全充盈消化酶液；4.剪下整个肝脏组织，将肝脏置于60mm培养皿中用10％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养液终止消化，撕去肝包膜，用移液管轻轻吹吸两次，经100目网过滤到50ml离心管中，去除未消化肝脏组织块，补至30ml，于室温下1500转/分钟（50-80g）离心5ｍｉｎ重复2-3次，收集纯化的小鼠肝细胞，将纯化的小鼠肝脏细胞重悬于10ｍＬＲＰＭＩ－１６４０培养液中。
小鼠原代肝细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握小鼠原代肝细胞的分离和培养方法；2. 了解肝细胞在体外培养过程中的生物学特性；3. 探讨肝细胞培养条件对细胞生长和功能的影响。
二、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠（体重20-25g）；2. 培养基：RPMI 1640培养基（含10%新生牛血清、1%双抗、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺）；3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、0.2%胶原酶、台盼蓝染色液；4. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、离心机、培养箱等。
三、实验方法1. 小鼠原代肝细胞的分离（1）处死小鼠，取出肝脏；（2）将肝脏放入含有RPMI 1640培养基的培养皿中，用剪刀剪成1mm³左右的小块；（3）加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化10min；（4）加入0.2%胶原酶，37℃水浴消化30min；（5）消化过程中每隔5min轻轻摇动培养皿，使肝细胞充分释放；（6）消化结束后，将消化液过滤，收集肝细胞悬液；（7）用RPMI 1640培养基洗涤肝细胞悬液2次，去除未消化的组织碎片；（8）将肝细胞悬液离心（1000r/min，5min），弃去上清液；（9）用RPMI 1640培养基重悬肝细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。
2. 肝细胞培养（1）将肝细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；（2）每隔2-3天更换新鲜培养基；（3）观察肝细胞的生长情况，记录细胞贴壁、伸长、伪足形成等过程；（4）利用台盼蓝染色法检测细胞存活率；（5）观察肝细胞在培养过程中的形态学变化。
3. 肝细胞功能检测（1）收集培养24h后的肝细胞，用RPMI 1640培养基洗涤2次；（2）加入0.5%台酚蓝染液，37℃水浴染色30min；（3）用RPMI 1640培养基洗涤细胞，去除未结合的染料；（4）用酶标仪检测吸光度（A）值，计算肝细胞对台酚蓝的摄取量。
四、实验结果1. 肝细胞分离与培养（1）分离得到的肝细胞形态为圆形、椭圆形或不规则形，细胞核清晰可见；（2）细胞存活率约为64.1%；（3）细胞在培养过程中呈典型的上皮样细胞形态，胞浆内有空泡和脂滴，相邻细胞伸长的伪足相互连接。
肝细胞的原代培养
肝细胞的原代培养1．准备工作及肝细胞的分离（1）对所要用的工具和器械进行高温高压消毒，对所要的培养液，平衡盐溶液，蛋白酶消化液用微孔滤膜过滤除菌（手术剪，镊子，止血钳，空针，解剖针，不锈钢呢绒晒网，培养皿，小烧杯，吸管，离心管，三角瓶，棉球，血细胞技术板）（2）工作台面取材前30分钟紫外线消毒，酒精棉球擦洗（3）操作者洗手着装（新洁尔灭浸泡前臂1min）（4）试验动物消毒（70％或75％乙醇浸泡）（5）切取动物组织，洗取血污，剔去多余部分，将所取组织放入不含Ca2＋的HEPES缓冲液（培养液）的培养皿中（6）将所取组织切碎，将组织块连同组织液用吸管吸至离心管中静置片刻待组织块下沉后吸去上清液（7）将组织块转移至一加入含0。
05％胶原酶－2和5mMCacl2的HEPES的小烧杯或小培养瓶中37C恒温床消化15－45min（也可加磁力棒）（8）用吸管吸去含酶溶液加入不含Ca2＋的HEPES 缓冲液并用吸管吹打使组织块刚好散开（9）用不锈钢筛网过滤，若未过滤组织块较多重复（7）（10）对过滤液离心，转速80－1000r /min 时间5－10min（50×g？）（11）弃上清液，将细胞沉淀用少量培养液重新悬浮（12）重复（10）（11）3次（13）用血细胞计数板计数密度（14）用培养液调节细胞悬液密度至期望密度（每75ml烧瓶8×106个细胞）准备接种2．培养(1) 培养基：75％Eagle MEM＋25％medium 199＋10nginsulin/m+0.2%bovin serum albumin+10%fetal calf serum(2) 将分离的肝细胞种在10ml培养基里(3) 过12小时换液(4) 以后每天换液且加入7×10-5 hydrocortisone hemisaccinate（去小牛血清加入1.5%的二甲基亚砜）。
小鼠肝细胞原代培养实验
一、实验材料准备1. 动物：小鼠。
2. 试剂：DMEM(含血清)、无血清DMEM 培养基、胰酶、PBS 。
3. 器械：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管(15/50 ml)、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器。
4. 准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
二、方法1. 将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS 的平皿中。
2. 剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS 液的平皿中。
实验方法原理 将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA ）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
实验材料 小鼠试剂、试剂盒 DMEM 无血清DMEM 培养基 胰酶PBS仪器、耗材 饭盒 纱布 剪子 镊子 烧杯 平皿 研磨玻片 滤网 离心管 6孔培养板 吸管移液管 手套 微量加样器2.3 用手术剪将脏器剪成小块(大小约1mm2)，玻片研磨，转到离心管，离心(1 000 rpm，5 min)。
4. 视组织或细胞量加入5-6倍(3-5 ml)胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5. 加入3-5 ml含血清的培养液以中止胰酶消化作用。
6. 用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。
7. 再次离心5 min，弃上清液。
8. 加入无血清培养液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9. 加入含血清的培养液1-2 ml(视细胞量)，血球计数板计数。
10. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。
肝细胞原代培养的相关研究
肝细胞原代培养的相关研究肝是人体内的重要器官，具有许多生理功能，如解毒、合成和分解代谢物、合成血浆蛋白等。
肝细胞是组成肝脏的主要细胞类型，对维持肝脏正常生理功能起着重要作用。
为深入了解肝细胞的生理功能及其发生的调控机制，需要进行肝细胞的原代培养研究。
本文将针对肝细胞原代培养的相关研究进行简述。
肝细胞原代培养是利用组织学和细胞学的基本原理，从新鲜切片的肝脏组织中分离出肝细胞，将其在培养基中进行培养而得到的肝细胞。
肝细胞的分离和培养需要一定的技术和耐心。
首先需要将新鲜的肝脏组织取出，去除其他组织，然后使用酶、胆汁等杂质酶类物质来加速细胞的分离。
在细胞培养的过程中，需要控制培养基的成分，如氧气浓度、温度、pH值，同时添加必要的营养物质和生长因子，有助于细胞的生长和分裂。
其中，细胞减数分裂和有性生殖对于原代培养的影响极大。
1. 培养基的成分对于肝细胞的原代培养，培养基的成分非常重要。
肝细胞培养基需保持生理环境，必须加入肝细胞生长所需要的基本营养成分和生长因子，如葡萄糖、氨基酸、维生素、铁、硒等。
同时，由于肝细胞的特殊形态和生理功能，培养基中还需添加肝细胞分泌的细胞因子，如HGF、EGF、FGF等。
其中，HGF是肝细胞的重要生长因子，对肝细胞的生长与分化起着重要作用。
2. 体外培养条件对肝细胞的原代培养过程中，体外培养条件也是非常重要的因素。
如气氛调节，CO2浓度、含量、温度的调节等都影响着肝细胞的培养效果。
另外，关于pH的控制和细胞生长周期的控制等方面的调节也会直接影响肝细胞的细胞生长和分裂情况。
3. 细胞来源不同来源的肝细胞在原代培养过程中，其存在的状况也不同，从而影响肝细胞的生长情况。
如来自肉蛋白中心的肝细胞经过长时间的衰老，其代谢能力会逐渐减弱，但经过短时间的逆转，其代谢能力会再次得到恢复。
4. 细胞密度肝细胞原代培养中，细胞密度也是影响肝细胞生长和培养的重要因素之一。
较低的细胞密度和过多的细胞都会影响细胞的生长和分化。
原代肝细胞培养技术研究现状及其新药研发中的应用
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1、细胞形态
通过倒置显微镜观察各细胞的形态学特征，结果显示肝原代肝细胞呈多角形 或圆形，胞质丰富，胞核较大；星状细胞呈长梭形或椭圆形，胞质伸出多个突起； 枯否细胞呈不规则形状，胞质丰富，胞核较小；肝窦内皮细胞呈长梭形或多角形， 形成单层细胞。
2、细胞数量和存活率
通过细胞计数和台盼蓝染色法测定细胞的存活率，结果显示各细胞类型的数 量和存活率均较高，肝窦内皮细胞的存活率略低于其他三种细胞。
1、克服技术瓶颈：目前，原代肝细胞培养技术仍存在一些技术瓶颈，如细 胞来源有限、个体差异大等。因此，未来需要进一步改进和完善培养技术，以获 得更高质量、更为稳定的肝细胞模型。
2、实现个性化治疗：通过原代肝细胞培养技术，可以研究不同个体之间的 差异以及影响因素，为实现个性化治疗提供技术支持。未来，可以通过进一步的 研究和实践，将该技术应用于制定更为精准的治疗方案。
在临床试验方面，原代肝细胞培养技术可以提供更为接近人体实际情况的模 型，用于评估新药在不同个体内的效果和安全性。同时，通过原代肝细胞培养技 术，还可以研究不同个体之间的差异以及影响因素，为新药的研发和应用提供更 为精准的数据支持。
四、未来展望
随着科技的不断进步和研究的深入，原代肝细胞培养技术将会得到进一步的 发展和应用。未来，原代肝细胞培养技术将可能面临以下几个方面的挑战和机遇：
原代肝细胞培养技术研究现状及其 新药研发中的应用
01 一、背景介绍
目录
02 二、研究现状
03 三、新药研发
04 四、未来展望
05 五、结论
06 参考内容
原代肝细胞培养技术的研究现状 及其新药研发中的应用
一、背景介绍
肝脏是人体最重要的代谢器官之一，承担着多种生理功能。然而，肝脏疾病 却常常威胁着人类的健康，如肝炎、肝硬化和肝癌等。为了更好地研究肝脏疾病 的发病机制、药物筛选和疗效评估等，原代肝细胞培养技术应运而生。原代肝细 胞培养技术具有保持肝细胞原有生理状态、利于药物筛选和毒性评估等优点，但 同时也存在细胞来源有限、个体差异大等不足之处。
牛肝细胞原代培养
牛肝细胞原代培养1材料1.1牛肝脏来源用于获得原代细胞的牛肝脏来自南京市郊某小牛血清制备厂，小牛年龄1–2d。
1.2 主要试剂II型胶原酶( collagenase II)和DMEM/F12培养基为Invitrogen公司产品，小牛血清为明海生物工程有限公司产品，HEPES sodium salt、两性霉素B、L-谷氨酰胺、EGTA、牛血清白蛋白(BSA)为Amresco公司产品，转铁蛋白、牛胰岛素、台盼蓝为Sigma公司产品，地塞米松为Promega公司产品，6孔细胞培养板为costar公司产品。
1.3 采肝脏、灌注消化及分离肝细胞所用的器械大号手术剪刀3把，小手术剪刀2把，止血钳4把，长镊子4把，手术刀柄2个，刀片2片，小镊子4个，乳胶手套4付，100 mL玻璃注射器2个，导液管3条，铝饭盒3个，500 mL、100 mL烧杯各2个，瓶皿2个，200目不锈钢网筛1个，50 mL塑料离心管2个，细胞计数板3个。
1.4 主要仪器普通光学显微镜，细胞培养箱，倒置显微镜，超净工作台，冰箱，电热恒温水浴锅，低速离心机，电子天平。
2 方法2.1 实验方案新生小牛采血结束→无菌采取一部分肝后叶→4 ℃冲洗液冲洗掉血液并保存于4 ℃运送回实验室→37 ℃冲洗液冲洗让肝脏升温→37 ℃水浴锅里灌注消化肝脏→撕开肝被膜分散肝细胞→过滤沉淀离心→获得纯化的肝细胞→细胞计数和计算即时存活率→稀释细胞接种于牛尾胶原包被的细胞板→置37 ℃、5% CO2加湿环境中培养→观察记录细胞生长情况。
2.2 工作溶液的配制2.2.1 冲洗液A分别称取8.588 g HEPES sodium salt、7.468 g NaCl、0.234 g KCl、0.228 g EGTA、0.250 g Na2HPO4·12H2O，用1.0 mol/L HCl 调pH至7.6，用去离子水定容至1000 mL，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，4 ℃贮存。
肝细胞原代培养实验方案
原代培养肝细胞是肝细胞移植、生物人工肝的最佳生物材料。
长期以来, 国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量的研究 , 但要获得高活率、功能好的肝细胞,至今仍非易事。
早期主要用非酶法分离肝细胞 ,包括机械法( 如匀浆法) 及螯合法。
机械法对肝细胞损伤大, 细胞活率低; 螯合法是用可结合 Ca2+ 、M g2 +的螯合剂(如枸橼酸盐或 EDTA) 分离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好 ,常需与酶法结合使用。
后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞 ,包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。
后者对酶浓度及作用时间要求十分严格, 且由于胰蛋白酶是一种强蛋白质消化酶, 对肝细胞膜破坏严重 , 因而易造成肝细胞死亡 , 导致分离失败。
胶原酶消化法对肝细胞损伤较小 , 虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害, 但经培养后可完全修复。
胶原酶在消化肝的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体, 使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生的细胞内、外环境及细胞间的各种改变。
这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要的促进作用 ,有利于肝细胞的培养。
这种适应性改变恰恰是机械分离法所没有的。
因此 ,要获取理想的肝细胞,酶消化这一重要环节不可缺少。
Seglen 二步灌注法为经典的胶原酶消化法,但所需设备较复杂 ,胶原酶消耗量大。
本研究在其基础上略加改进。
作者认为 ,采用胶原酶消化法 ,胶原酶的用量、作用时间及作用条件是分离成功与否的关键。
胶原酶的浓度过高 ,作用时间难以控制 ; 浓度过低 ,则作用时间过长、细胞活率降低。
事先用无Ca2 +、M g2+的灌注液进行预灌注, 去除 Ca2+依赖性粘附因子 ,使桥粒断裂; 然后用含 Ca2+的胶原酶消化 ,胶原酶的作用需要 Ca2+的活化 , 在 5 mmol/LCa2 +浓度下 ,用浓度为 500 mg/ L 的胶原酶 37 ℃条件下消化 15 min 最佳。
在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时 ,温度需保持在 0 ～4 ℃。
鸭胚原代肝细胞分离培养方法
鸭胚原代肝细胞分离培养方法鸭胚原代肝细胞是一种重要的细胞模型，常被用于研究肝细胞的生理和病理过程。
本文将介绍一种鸭胚原代肝细胞分离培养的方法，帮助科研人员顺利地获得高质量的细胞。
材料与试剂：1. 鸭胚（15-18天的胚龄）2. 70%乙醇3. 磁力搅拌器4. 50ml离心管5. 无菌PBS缓冲液6. 透明良液（胎牛血清/培养基=1：1）7. 原代培养基8. 胶原酶Ⅰ9. 钙镁自由Hanks平衡盐液10. 1%胰酶溶液11. 无菌生理盐水12. 0.1%胚胎牛血清白蛋白（BSA）步骤：1. 将鸭胚从孵化器中取出，用70%乙醇对表面进行消毒，并将其置于无菌操作室中。
2. 按照胚龄切下每个胚胎的肝脏部位，并移入50ml离心管中加入3ml Hanks平衡盐液，使用磁力搅拌器均匀悬浮。
3. 将悬浮液通过70μm的滤网过滤到新的离心管中，去除固定残渣和大块组织。
4. 将胆固醇缩合酶加入过滤后的细胞悬液中（20μl/ml），并与悬液搅拌混匀。
将其放在冰箱内，4°C下培养30-45min。
5. 把上清液移入50ml离心管中，加入同等体积的透明良液，轻轻混匀后配制成原代培养基。
6. 将经过以上处理的细胞悬液在无菌工作台中进行培养，加入10%FBS（final 8-10%）的原代培养基中，放回温度为37℃且5%CO2的细胞培养箱内培养。
7. 初始培养后24小时加入1%胰酶溶液（final 0.1%）静置20min，观测细胞体积萎缩并向外浮起，加入0.1%BSA（final 0.01%）使细胞暴露在酶液中加速酶解。
8. 用细胞崩解剂去除细胞表面上的胶原质，如可用0.25%胶原酶Ⅰ。
一般情况下，胶原酶活性需先用实验将胶原质提前转化，胶原质酶解比例可依所得细胞的特点和生长状态相应进行调整。
9. 加入0.5倍的原代培养基，抽取细胞液用离心机离心5min、1500rpm去掉明显的细胞碎块。
10. 用原代培养基重新悬浮细胞并从融合之前的根基上重新培养。
原代肝细胞
原代肝细胞分离培养与方法肝细胞的分离和培养是体外组合性生物人工肝研究的基础，但单纯机械分离法对肝细胞损伤较大，分离后的肝细胞体外培养的难度亦较大，方法复杂，成本较高体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞.1 非酶分离细胞法1．1 直接分离法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，剪成小块，通过机械方法(挤压、剪碎、震荡、吹打)得到单个细胞，多与 EDTA螯合法、灌注法相结合，即先用 EDTA溶液进行充分的灌流，再剪成组织小块，然后用各种机械的方法分离得到肝细胞。
该方法操作简单、流程短，不需要复杂仪器和昂贵的胶原酶。
但实验操作对细胞的损伤大，尤其是造成细胞表面蛋白不可逆的机械性损伤，导致细胞的获得率和存活率较低。
1．2 组织块培养法：用麻醉剂 (乙醚、戊巴比妥纳等 )将动物麻醉或直接断头处死，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。
的组织小块，充分洗涤后，以 0．5 cm的间隔接种于培养器皿中(25 m L的培养瓶中可接种 3O块 )，先加入少量的培养基，静置培养 12～ 24 h后再加入足量的培养基。
该操作过程短，污染少，损伤小，细胞成活率很高而成本低。
但纯度不高，且形成典型上皮细胞层所需时间较长，在细胞爬出后还需剔除组织块，易造成二次污染。
可能是因为成年动物的结缔组织比新生动物的结缔组织致密，肝细胞难以迁出，故此法多用于 1～ 6 d的新生动物或动物胚胎。
2．离体肝脏酶消化分离法2．1 胰蛋白酶、胶原酶消化法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。
的组织小块，充分洗涤后，在 37℃下用胰酶或 (和)胶原酶消化，待消化物成蓬松的絮状物后加入培养基终止消化，吹打均匀后经 200目不锈钢网筛过滤后，离心、重悬即可获得肝细胞。
胶原酶只消化细胞间质而对肝细胞机械性损伤较小，也能较完整地保存膜蛋白¨7]，分离效果好。
细胞传代培养-原代肝脏细胞
第一部分：细胞传代培养1.一般客户拿到细胞后，应该注意什么？客户收到细胞先不开盖,用酒精将整个细胞瓶外壁进行消毒，放在培养箱静置若干小时后（看细胞密度而定）在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收细胞时的培养基拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，显微镜下拍细胞100X，200X各两张），排除细胞本身污染的情况；收到细胞未开封，出现污染状况我们负责免费发送一株细胞。
2.何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，常规细胞2-3天更换培养基。
3.细胞何时进行传代较好？一般情况下细胞生长至完全汇合后就应该传代，所有细胞生长都有一个要求不宜生长过密（也就是常说的长老了），但有接触抑制的细胞，在汇合前就必须进行传代，这类细胞一般在密度70-80%就进行传代，否则会引起细胞分化。
4. 贴壁细胞如何进行传代？去掉原T25培养瓶里面的培养基，T25瓶加3-4ml PBS洗1-2次；弃PBS，再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化细胞，显微镜下观察，待细胞变圆，细胞间隙明显，部分细胞刚开始脱离瓶壁，加4 ml左右完全培养液混匀终止消化，将细胞小心吹打下来，1000 rpm/min室温离心5min；弃上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，按要求分瓶（视细胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6，1:6-1:8），每T25瓶补足培养基至5-6ml，37℃、5%CO2孵箱培养。
5. 悬浮性细胞应如何传代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，将细胞悬液移入离心管中，1000 rpm/min 室温离心5 min。
弃上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，按要求分瓶（视细胞密度而定1:4-1:8），每T25瓶加完全培养液至4-5ml，37℃、5%CO2孵箱培养。
有些悬浮细胞趋于成团生长，此时细胞生长状态良好，当补液时，需避免反复吹打。
6.贴壁细胞传代所使用胰酶浓度？胰酶如何处理？胰酶消化时间？一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.25%trypsin-0.53mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02mM EDTA.2Na。
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原代肝细胞培养
原代肝细胞培养
1．实验材料
灌流液：NaCl、KCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.H2O、NaHCO3、HEPES、EDTA、Glucose （国药或阿拉丁）。
消化液：Collagenase IV（Yeasen，翊圣生物，产品货号：40510ES60，100 mg ，279￥）、CaCl2。
Percoll：Percoll（GE Healthcare，17-0891-02）我买的是分装的100ml，450￥的17-0891-01-1。
麻醉剂：10%水合氯醛。
实验器材：200目细胞筛、20ml 注射器、头皮针、手术剪3把、手术镊3把（实验前灭菌），细胞培养皿2个，离心机，实验前备冰盒及水浴锅，鼠板及大头针（实验前酒精及紫外消毒）。
2. 实验前准备
1) 灌流液
Perfusion Solution
NaCl KCl NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.H2O NaHCO3 HEPES EDTA Glucose
离子）。
用前37℃温育。
每只老鼠消耗15ml灌流液。
2）消化液
100× CaCl2：560mg CaCl2，加入10 ml PBS/ ddH2O，分装-20℃保存。
10× CollagenaseIV：100 mgCollagenaseIV粉末溶于20 mlDMEM（无血清），0.22 uM滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装。
消化液：13.5 mlDMEM（无血清）加入150 μl100× CaCl2（终浓度5 mM），再加入1.5 ml10× CollagenaseIV（终浓度0.5 mg/ml），于37℃温育。
每只老鼠消耗15ml消化液。
3）40%Percoll
g/L 8.0 0.4 0.078 0.151 0.35 2.380 0.19 0.9
调节pH 7.2-7.4，配好后过滤除菌。
（不能高压灭菌，其中含葡萄糖及HCO3-
16.2 ml 100%percoll原液，加入1.8 ml10×PBS，再加入27ml 1×PBS，得45 ml。
（等渗溶液）
每只老鼠消耗5-6 ml40%Percoll。
4）1×PBS
1×PBS NaCl KCl Na2HPO4.12H2O
KH2PO4
HCl调节PH至7.4。
5）培养基
DMEM：含10%FBS，1%双抗。
实验前4℃预冷。
实验前一天准备所需手术器械高压灭菌。
实验前将鼠板及托盘置于超净台中紫外灭菌，准备水浴锅以及冰盒。
配置CollagenaseIV消化液，灌流液及消化液均于37℃温育。
C57BL/6或Babl/c小鼠麻醉后，于超净台内鼠板上固定，酒精消毒腹部皮肤。
g/L 8.0 0.2 3.62 0.151
3. 实验方法
剪刀小心剪开腹部皮肤分离至两侧，小心分离腹膜，将肠道移至一侧，于下腔静脉插
入头皮针，剪开门静脉，灌注15 ml灌流液（20ml注射器），后接着灌注15 ml消化液（肝本身有阻力，消化液灌注约3 min作用，灌注完成后消化即完成）。
准备培养皿，加入预冷的DMEM（含血清），将肝组织转移至培养皿，手术镊撕碎（可见一粒粒的肝细胞），用移液枪轻轻吹两下，经200目细胞筛滤至另一培养皿中（尽量不
要吸到肝组织），剩余肝组织再加入少量预冷DMEM，进一步将肝组织撕碎，同样方法滤至培养皿中。
500 rpm，3min，离心去除细胞碎片、死细胞、血细胞等，重复离心2遍。
准备15 ml离心管，底部先加3 ml 40%percoll，将上述离心好的细胞重悬（用6 mlDMEM），缓慢滴加加到Percoll上方（每管3ml）（注意不要将细胞悬液冲到percoll
下方）。
2000 rpm，5min，4℃，离心后弃上清以percoll，留底部肝细胞，DMEM重悬，500 rpm，5min，离心去除残余的percoll，重悬后得纯化的肝实质细胞。
每只小鼠的肝细胞可种2~3 块板。
7-8 h贴壁，次日加药。
实验周期不要超过3-4天。