原代肝细胞培养

原代肝细胞培养

原代肝细胞培养

1．实验材料

灌流液：NaCl、KCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.H2O、NaHCO3、HEPES、EDTA、Glucose （国药或阿拉丁）。

消化液：Collagenase IV（Yeasen，翊圣生物，产品货号：40510ES60，100 mg ，279￥）、CaCl2。

Percoll：Percoll（GE Healthcare，17-0891-02）我买的是分装的100ml，450￥的17-0891-01-1。麻醉剂：10%水合氯醛。

实验器材：200目细胞筛、20ml 注射器、头皮针、手术剪3把、手术镊3把（实验前灭菌），细胞培养皿2个，离心机，实验前备冰盒及水浴锅，鼠板及大头针（实验前酒精及紫外消毒）。 2. 实验前准备

1) 灌流液

Perfusion Solution

NaCl KCl NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.H2O NaHCO3 HEPES EDTA Glucose

离子）。用前37℃温育。

每只老鼠消耗15ml灌流液。 2）消化液

100× CaCl2：560mg CaCl2，加入10 ml PBS/ ddH2O，分装-20℃保存。10× CollagenaseIV：100 mgCollagenaseIV粉末溶于20 mlDMEM（无血清），0.22 uM滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装。

消化液：13.5 mlDMEM（无血清）加入150 μl100× CaCl2（终浓度5 mM），再加入1.5 ml10× CollagenaseIV（终浓度0.5 mg/ml），于37℃温育。

每只老鼠消耗15ml消化液。 3）40%Percoll

g/L 8.0 0.4 0.078 0.151 0.35 2.380 0.19 0.9

调节pH 7.2-7.4，配好后过滤除菌。（不能高压灭菌，其中含葡萄糖及HCO3-

16.2 ml 100%percoll原液，加入1.8 ml10×PBS，再加入27ml 1×PBS，得45 ml。（等渗溶液）

每只老鼠消耗5-6 ml40%Percoll。

4）1×PBS

1×PBS NaCl KCl Na2HPO4.12H2O

KH2PO4

HCl调节PH至7.4。 5）培养基

DMEM：含10%FBS，1%双抗。实验前4℃预冷。实验前一天准备所需手术器械高压灭菌。

实验前将鼠板及托盘置于超净台中紫外灭菌，准备水浴锅以及冰盒。配置CollagenaseIV消化液，灌流液及消化液均于37℃温育。

C57BL/6或Babl/c小鼠麻醉后，于超净台内鼠板上固定，酒精消毒腹部皮肤。

g/L 8.0 0.2 3.62 0.151

3. 实验方法

剪刀小心剪开腹部皮肤分离至两侧，小心分离腹膜，将肠道移至一侧，于下腔静脉插

入头皮针，剪开门静脉，灌注15 ml灌流液（20ml注射器），后接着灌注15 ml消化液（肝本身有阻力，消化液灌注约3 min作用，灌注完成后消化即完成）。

准备培养皿，加入预冷的DMEM（含血清），将肝组织转移至培养皿，手术镊撕碎（可见一粒粒的肝细胞），用移液枪轻轻吹两下，经200目细胞筛滤至另一培养皿中（尽量不

要吸到肝组织），剩余肝组织再加入少量预冷DMEM，进一步将肝组织撕碎，同样方法滤至培养皿中。500 rpm，3min，离心去除细胞碎片、死细胞、血细胞等，重复离心2遍。

准备15 ml离心管，底部先加3 ml 40%percoll，将上述离心好的细胞重悬（用6 mlDMEM），缓慢滴加加到Percoll上方（每管3ml）（注意不要将细胞悬液冲到percoll

下方）。2000 rpm，5min，4℃，离心后弃上清以percoll，留底部肝细胞，DMEM重悬，500 rpm，5min，离心去除残余的percoll，重悬后得纯化的肝实质细胞。

每只小鼠的肝细胞可种2~3 块板。7-8 h贴壁，次日加药。实验周期不要超过3-4天。