噬菌体抗体库技术

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噬菌体展示技术和其应用ppt课件

2024/3/30
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应用举例：
部分做过的工作
2024/3/30
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一、半合成噬菌体抗体库的构建
构建一个半合成抗体库，不经免疫制备人源抗Tie2 Fab抗体。通过RT-PCR方法，从人脐带血淋巴细胞总 RNA 扩增轻链基因及重链VH段基因，将轻链基因插入pCOMb3载体中，得人轻链质粒库；从乙肝表面抗体（HBsAb）的Fd段基因制备含有不同长度随机化 CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后将VH段基因与随机化的CDR3融合，得到Fd基因片段，再将其插入轻链质粒库中，得半合成人Fab质粒库。
成3节段
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M13噬菌体
丝状噬菌体
λ噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体
蝌蚪形噬菌体
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T7与M13相比优势明显
T7Select的优势解释
是在细胞质中表达的裂解性噬菌体
C-端融合
与M13不同，T7是裂解性的，其展示的蛋白无需分泌。
插入序列被克隆到T7Select载体基因10 的C-端，可以使带有终止密码子的插入子得以表达和展示。
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34人源噬菌体Fab抗体半合成的构建将酶切纯化的重链重叠PCR产M13的超感染下，繁殖出表算出κ＋Fd（包括CDR3-5个菌落，涂格，过夜培养后菌落PCR：其中6个克隆中有轻链也有重链。双链插入率为60％左右。
κ 链文库的容量为 5.03×106,λ 链文库的容量为 6.8×106(多次建库混合后的库容量)。
从平板上随机挑取10个菌落，涂为70％。
载体克隆容量大 T7载体比M13克隆容量大，而任何克隆到M13上大于1 kbp的片段都不稳定。

抗体制备技术的发展和医学应用

抗体制备技术的发展及其医学应用抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。

它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应（生理效应）的球蛋白。

国际卫生组织将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的一类蛋白统一命名为免疫球蛋白，它与抗体都是指同一类蛋白质。

抗体的2条重链和2条轻链根据氨基酸序列变化程度分为V区和C区，其抗原结合特异性主要由V区中高度变异的超变区决定，3 个超变区共同形成1个抗原决定簇互补的表面，故又称为互补决定区( comp lementarity determining region，CDR)。

常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。

一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。

即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。

因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb），简称多抗。

多克隆抗体是由多克隆B细胞群产生的、针对多种抗原决定簇的混合抗体。

因为天然抗原是由多种抗原分子组成的，每种抗原分子又含有许多抗原决定簇，每一种抗原决定簇可激活相应的B细胞克隆，进而分化、成熟并合成相应的抗体。

由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。

因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。

随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。

1 抗体的发展抗体的研究过程经历了免疫血清学研究、单克隆抗体研究和基因工程抗体研究3个不同阶段。

1.1 免疫血清学研究阶段免疫动物产生的抗体是多种抗体的混合物，所以早期制备的抗体是多克隆抗体. 多克隆抗体是人类有目的地利用抗体的第1步，其在生物医学等方面的应用已有上百年的发展历史. 但多克隆抗体具有不均一性，特异性差且动物抗体注入人体会产生严重的过敏反应等特性，限制了其在疾病诊断和治疗中的应用。

噬菌体展示技术的原理及应用

8、 DNA结合蛋白：
锌指蛋白是一类 DNA 结合小肽结构物，这些结构含有锌，能用于构建一个大的蛋白区域，去识别和结合特殊的 DNA 序列。噬菌体展示技术也可以用于创造一个大的、具有识别不同 DNA 序列的锌指的多肽库。利用这个多肽库，可以研究有关氨基酸序列与 DNA 结合位点之间的识别规则，可以通过设计锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小鼠细胞系中的癌基因，也可以启动表达质粒的基因，或干扰病毒感染插入的片段是从某些组织或细胞中抽提的mRNA 的互补DNA 片段,它用来筛选与受体特异性结合的片段。一般可利用M13 噬菌体或其他表达一部分真核蛋白,而M13 噬菌体和其他E. coli噬菌体所能表达的真核蛋白更少。研究表明,没有一个展示系统能够表达所有的真核细胞蛋白。无论如何,噬菌体表面cDNA 库的表达将是研究蛋白质之间相互作用的有用工具。cDNA 库的噬菌体展示提供了一个应用免疫学方法进行酶：
例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类，等等
6、底物与抑制剂：
主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。
7、信息传递研究:
利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一个 Hantaviral 受体；受体的配体，如血管促生素、 αbungarotoxin，和一些大蛋白分子中的折叠区域，如 SH2、SH3 和 WW 区域。从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的多肽, 因此用完整细胞可以从多肽库中找到受体的高选择性配体。在不知道任何有关的受体和配体信息的情况下，用完整细胞和组织或动物，可筛选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白。
一、发展简史

Dulbecco等提出了在病毒表面展示外源抗原决定簇和肽的概念。 1985年Smith — 首次利用基因工程技术将 EcoRⅠ内切酶的部分基因片段(171 bp和132 bp)与 pⅢ基因融合，获得的重组噬菌体可在体外稳定增生，表达产物能被抗EcoRⅠ内切酶抗体所识别.。 1988年Parmley — 将已知抗原决定簇与噬菌体 PⅢ N端融合呈现在其表面，并提出通过构建随机肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想.。 1990年McCafferty — 用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一个广泛应用的时代。

天然人源IgG Fab噬菌体抗体库的构建及多样性分析

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红霞等
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免疫学技术与方法・
天然人源ＩＧａｇＦｂ噬菌体抗体库的构建及多样性分析①
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从鼠源到全人源单克隆抗体制备技术及改造策略的研究进展

从鼠源到全人源单克隆抗体制备技术及改造策略的研究进展摘要：近年来，单克隆抗体是生物制药领域研究和发展最快的领域之一，单克隆抗体具有地耐药性、高效性、专一性等多种优越特性而受到各界关注，随着单克隆抗体制备技术的不断出现，对其稳定性和亲和力提出了更高的要求，本项目从全人源单克隆技术出发，探讨其改造策略以及未来发展方向关键字：鼠源，全人源，单克隆抗体单克隆抗体是一种由人类通过采用各种化学技术或者人工方式制备，由单一b 受体细胞的单克隆抗体细胞产生的一种抗体。

其高度均一，且仅针对某一特定受体抗原上的表位。

单克隆免疫抗体的制备方法主要具有产物纯度高、交叉免疫反应少、制备时间和成本低、结构均一、特异性强等特点，其主要生物学机理功能主要特点是与抗原分子结合后不能产生间接免疫受体分子或直接阻断配体。

当前已有40多种单抗体克隆免疫抗体被广泛用于自身自体免疫功能性疾病、肿瘤和器官移植等各个方面，效果显著。

1全人源单克隆抗体制备技术自从1975年，KOHLER等人通过杂交瘤技术成功获得了具有抗原特异性的鼠源性单克隆抗体，从而开启了单克隆抗体开发的新纪元。

随着多年发展，单克隆抗体已经成为人们疾病诊治的重要工具。

而鼠源性抗体来源于小鼠，在对人体使用时，存在着诸多缺陷，为解决此类问题，全人源单克隆抗体被提出，是未来单克隆抗体的主要研究方向之一，目前使用较为广泛的全人源单克隆抗体制备技术有以下几种：1.1噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术至1990年成功实施以来，经过30年的发展，已经成为该领域应用最广的制备技术之一。

噬菌体抗体库技术的应用原理是使用PCR技术（聚合酶链式反应技术），将人体抗体编码的基因序列通过技术进行扩增，然后将抗体的基因序列插入到噬菌体中的适当位置，并通过建立一个噬菌体抗体库，让人体抗体和另一个噬菌体外壳上的蛋白进行相融，将两者互相融合的蛋白质形式展示在噬菌体的表面。

噬菌体抗体库技术将通过构建好的抗体库与抗原进行结合，并通过抗原与抗体的差异性相互结合的基因组原理，通过筛选，挑出一种能与目的抗原进行结合的噬菌体，在通过噬菌体基因测序，得到一种新的基因序列,并将其通过基因组技术应用于全人源抗体中。

人源乳腺癌噬菌体抗体库的构建及初步筛选

ＭＣ＿结合活性癌噬菌体抗体库中筛选到６特异性噬菌体抗体，下一步进行单链抗体的株为
乳腺癌放射性核素显影及治疗奠定了基础。
关键词：腺癌；菌体抗体库；乳噬筛选；链抗体单中图分类号：７７９Ｒ３．４Ｒ３．；７０４文献标识码：Ａ文章编号：６１８４（ＯＯ０ —５６Ｏ１７－３８２１）５０１一３
ＴＡＮＧｈ — ｉ，ｈｏｌｎ，ＳｕｂｎＬＩＳａ —ｉＰＥＮＧｅｅ１Ｊｉ，ｔ．ａ
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噬菌体展示

噬菌体展示
简介
噬菌体是一种能够感染细菌并在其中繁殖的病毒。

它被广泛用于生物学研究和生物技术应用中，特别是在基因工程和基因治疗领域。

噬菌体展示技术是一种将特定蛋白质或肽段展示在噬菌体表面的方法。

通过选择与目标蛋白质相互作用的噬菌体克隆，可以筛选出具有特定功能的蛋白质或肽段。

本文将介绍噬菌体展示技术的原理、应用和优点。

原理
噬菌体展示技术依赖于噬菌体基因组中的一个外源基因，该基因编码目标蛋白质或肽段。

这个外源基因通常被插入到噬菌体的毒力因子基因中，例如毒力因子III基因。

插入后，目标蛋白质或肽段会与细菌细胞的表面结合。

噬菌体携带的基因信息会导致细菌细胞表面展示目标蛋白质或肽段。

通过这种方式，科研人员可以通过筛选和选择的方法找到与目标蛋白质或肽段相互作用的噬菌体克隆。

应用
噬菌体展示技术在生物学研究和生物技术应用中有广泛的应用。

以下是一些常见的应用领域：
抗体库筛选
噬菌体展示技术可用于抗体库筛选，以寻找与特定抗原相互作用的抗体。

通过将抗原展示在噬菌体表面，科研人员可以筛选出具有高亲和力和特异性的抗体，用于治疗和诊断应用。

肽库筛选
噬菌体展示技术也可用于肽库筛选，以寻找具有特定功能的肽段。

通过将肽段展示在噬菌体表面，科研人员可以筛选出与特定靶点相互作用的肽段，用于药物开发和治疗应用。

蛋白质互作网络研究
噬菌体展示技术可以用于研究蛋白质互作网络。

通过将一种蛋白质展示在噬菌体表面，并将其用作识别其他与其相互作用的蛋白质的。

噬菌体抗体库筛选操作流程tomlinsonij

噬菌体抗体库筛选操作流程tomlinsonijtheLibrariesGeneral Introduction toOver the past 10 years Greg Winter’s lab at the MRC Laboratory of Molecular Biology and the MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, UK) has created a number of artificial libraries of antibodies that can be used to derive binders to almost any target molecule using phage display and selection. These binders can be used for all the same applications as conventional monoclonal antibodies (ELISA, Western blotting, FACS, immunohistochemistry etc) but can be isolated in a fraction of the time and without the need for animal immunisation. To date these so called “na?ve” or “single pot” phage-antibody libraries have been used successfully in hundreds of molecular biology labs world-wide to derive highly specific antibody reagents to a wide range of different proteins, peptides or small molecule compounds.The latest libraries (Tomlinson I and J) that are being distributed by the MRC HGMP Resource Centre each comprise over 100 million different scFv fragments cloned in an ampicillin resistant phagemid vector and transformed into TG1 E. Coli cells (scFv fragments comprise a single polypeptide with the VH and VL domains attached to one another by a flexible Glycine-Serine linker). By carefully following the protocol provided, large numbers of phagemids can be produced and used to select specific binders to target molecules that are attached to the surface of a tube or biotinylated and captured by streptavidin coated beads (so called “panning”). After each round of panning, the non-binders are washed away and the phagemids bound to the target molecule/s are eluted and amplified by infection into fresh TG1 cells. After producing new phagemids from the previous round of panning, the process can be repeated. Typically two or three rounds of panning are required to ensure that more than half the different scFvs in the selected population bind to the target molecule. The monoclonal scFvs can then be screened for binding (using a simple ELISA based protocol) and then used for further analysis of the target molecule. Since all the functional scFvs in the Tomlinson I and J libraries bind Proteins A and L, either of these secondary reagents can be used for detection, purification or immobilisation. Alternatively, secondary reagents that bind the attached myc or HIS6 tags can be used, although in our experience it is better to use the Protein A or L reagents.Finally, we would like to emphasise that these libraries represent a valuable resource. Whether you are familiar with phage display or not we recommend that you perform test selections and subsequent ELISA screening using the anti-bovine serum albumin and anti-bovine ubiquitin controls provided. Only when these experiments have been successfully carried out should you defrost the libraries and start preparing library phage.Derivation of librariesBoth libraries are based on a single human framework for V H (V3-23/DP-47 and J H 4b) and V κ (O12/O2/DPK9 and J κ1) with side chain diversity incorporated at positions in the antigen binding site that make contacts to antigen in known structures and are highly diverse in the mature repertoire. The canonical structure (V H : 1-3, V κ: 2-1-1) encoded by this framework is by far the most common in the human antibody repertoire. The CDR3 of the heavy chain was designed to be as short as possible yet still able to form an antigen binding surface. Both libraries can be selected and affinity matured without knowing the sequences of selected clones. Libraries are in phagemid/scFv format and have been pre-screened for binding to Protein A and Protein L so that the majority of clones in the unselected libraries are functional.Constructed in pIT2 (HIS myc tag). Diversified (DVT) side chains based mainly on those positions which are diverse in the primary repertoire (total of 18 residues - H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 and L96). After selection, can be matured by incorporating additional diversity based on somatic mutation. Library size (with insert): 1.47 x 108 Percentage insert: 96%As above but with NNK side chains. Library size (with insert): 1.37 x 108 Percentage insert: 88%1. Check that you have received:a tube of Library I (~500 µl)a tube of Library J (~500 µl)a glycerol stock of a positive control anti-ubiquitin ScFv in bacterial strain TG1 (labeled TG1-antiubi)a glycerol stock of a positive control anti-BSA ScFv in bacterial strain TG1 (labeled 13CG2)a glycerol stock of T-phage resistant E. Coli. TG1 for propagation of phage (labeled TG1Tr)(lac-proAB) supE thi hsdD5/F' traD36 proA+B lacI q lacZM15)(K12a glycerol stock of E. Coli. HB2151 for expression of antibody fragmentsara ?(lac-proAB) thi/F' proA+B lacI q lacZ?M15)(K12KM133 (~100 µl with 107 pfu/ml)Phage2. Check the library is still frozen and make sure you keep it frozen at -70°C until needed.3. Make stock of KM13 according to Protocol G.4. Run through the protocols using the control clones before you use the library: Streak the controlson TYE plates containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose. After overnight growth at 37°C in an incubator pick a single colony from each and grow these overnight (shaking at 37°C) in 5 ml 2xTY1 containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose. Make phage for the positive and negative controls separately (use 500 µl of overnight in D1-D10). Use a 1:100 mixture of phage produced from the positive and the negative controls and perform one round of selection (C1-C11) using 100 µg/ml of ubiquitin2 in PBS for coating. Check for enrichment of ubiquitin binders (should be over 50% after one round of selection) by monoclonal phage ELISA (E9-E14).5. Wherever possible use devoted pipettes and disposable plastic ware. The use of polypropylenetubes is recommended as phage may adsorb non-specifically to other plastics.6. For efficient infection of phage, E. coli must be grown at 37°C and be in log phase (OD at 600 nmof 0.4). To prepare this:i. Transfer a bacterial colony from a minimal media plate into 5 ml of 2xTY medium (no antibioticsor glucose). Grow shaking overnight at 37°C.ii. Next day dilute overnight 1:100 into fresh 2xTY medium. Grow shaking at 37°C until OD 600 is0.4 (1.5-2 hrs)7. All centrifugations, except those performed in a micro centrifuge, are performed at 4°C.8.Libraries I and J must be used separately and preferably in parallel. This will ensureselecting the most antigen binding clones.In advanceGather all equipment and reagents (product details are given in the notes at the end of all the protocols). Make sure you have all the necessary media and plates for bacterial growth (the large Bio-Assay plates need to be air-dried in a sterile environment for 2 hrs before use).Plan your time - most of the daily procedures can be performed simultaneously, so read through each protocol carefully before starting.StepsProcedureDay 1 (5 hrs) A1-A6 Grow libraries I and J and make phageB1-B3 Make secondary stock of librariesDay 2 (6 hrs) A7-A12 Grow libraries I and J and make phage (cont.)C1 Coat immunotubes for 1st round of selectionDay 3 (6.5 hrs) C2-C11 1st round of selectionDay 4 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 1st round of selectionC1 Coat immunotubes for 2nd round of selectionDay 5 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 1st round of selection (cont.)C2-C11 2nd round of selectionDay 6 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 2nd round of selectionC1 Coat immunotubes for 3nd round of selectionDay 7 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 2nd round of selection (cont.)C2-C11 3rd round of selectionDay 8 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 3rd round of selectionE1 Coat 96 well plate for polyclonal phage ELISADay 9 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 3rd round of selection (cont.)E2-E8 Polyclonal phage ELISAFurther characterisation of individual clones can be performed by monoclonal phage ELISA (protocol E), monoclonal ELISA using soluble scFv fragments (protocol F), PCR screening (to check for insert, protocol H) and sequencing (protocol I).1. Add the library stock to 200 ml pre-warmed 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin and 1 %glucose.2. Grow shaking at 37°C until the OD 600 is 0.4 (1-2 hrs).3. Take 50 ml of this and add 2x1011 KM13 helper phage3. (Use the remaining 150 ml to make asecondary bacterial stock of the library by following protocol B).4. Incubate without shaking in a 37°C water bath for 30 min.5. Spin at 3,000 g for 10 min (3,600 rpm in Centra 8 or equivalent). Resuspend in 100 ml of 2xTYcontaining 100 µg/ml ampicillin, 50 µg/ml kanamycin and 0.1% glucose.6. Incubate shaking at 30°C overnight.7. Spin the overnight culture at 3,300 g for 30 min (4,000 rpm in Centra 8 or equivalent).8. Add 20 ml PEG/NaCl (20 % Polyethylene glycol 6000, 2.5 M NaCl)to 80 ml supernatant. Mix welland leave for 1 hr on ice.9. Spin 3,300 g for 30 min (4,000 rpm in Centra 8 or equivalent). Pour away PEG/NaCl. Respinbriefly and aspirate any remaining dregs of PEG/NaCl.10 Resuspend the pellet in 4 ml PBS and spin at 11,600 g for 10 min in a micro centrifuge to removeany remaining bacterial debris.11. Store the phage at 4°C for short term storage or in PBS with 15 % glycerol for longer termstorage at -70°C.12. To titre the phage stock dilute 1µl phage in 100µl PBS, 1µl of this in 100µl PBS and so on untilthere are 6 dilutions in total. Add 900µl of TG1 at an OD 600 of 0.4 to each tube and incubate at 37°C in a waterbath for 30 mins. Spot 10 µl of each dilution on a TYE5 plate containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose and grow overnight at 37°C. Phage stock should be 1012-1013/ml, enough for at least 10 selections.1. Grow the remaining 150 ml from A3 for a further 2 hr shaking at 37°C.2. Spin down the cells at 10,800 g for 10 min. Resuspend in 10 ml of 2xTY containing 15 % glycerol.3. Store this secondary stock in 20x 500 µl aliquots at -70°C. Use one aliquot for each phagepreparation according to protocol A - this will only be necessary if you wish to do more than 10 selections.(Alternatively, phage can be selected using biotinylated antigen in solution or affinity chromatography. For details see Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol.12, 433)immunotube6 overnight with 4 ml of the required antigen. The efficiency of coating can1. Coatdepend on the antigen concentration, the buffer and the temperature. Usually 10-100 µg/mlantigen in PBS is used.2. Next day wash tube 3 times with PBS (pour into the tube and then pour it immediately out again).3. Fill tube to brim with 2 % MPBS (2 % Marvel milk powder7 in PBS). Incubate at rt. Standing onthe bench for 2 hr to block.4. Wash tube 3 times with PBS.1012 to 1013 phage from A11 in 4 ml of 2 % MPBS. Incubate for 60 min at rt. rotating using 5. Addan under-and-over turntable and then stand for a further 60 min at rt. Throw away supernatant.6. Wash tubes 10 (round 1)-20 (rounds 2 and 3) times with PBS containing 0.1 % Tween 20.7. Shake out the excess PBS and elute phage by adding 500 µl of trypsin-PBS (50 µl of 10mg/mltrypsin stock solution8 added to 450 µl PBS) and rotating for 10 min at rt using an under-and-over turntable.8. Take 1.75 ml of TG1 at an OD 600 of 0.4 and add 250 µl of the eluted phage (the remaining 250µl should be stored at 4°C). Incubate for 30 min at 37°C in a water bath without shaking.µl, 10 µl of a 1:102 dilution and 10 µl of a 1:104 dilution on TYE plates containing 1009. Spot10µg/ml ampicillin and 1 % glucose and grow overnight at 37°C to titre the phage.10. In round 1 if using a complex antigen (eg cells, cell lysates etc): take the remaining TG1 cultureand spin at 11,600 g in a micro centrifuge for 5 min. Resuspend the pelleted bacteria in 1 ml of 2xTY and plate on a large square Bio-Assay dish9 containing TYE, 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose.In round 1 if using a single hapten, carbohydrate or protein antigen and in subsequent rounds for all antigens: take the remaining TG1 culture and spin at 11,600 g in a micro centrifuge for 5 min.Resuspend the pelleted bacteria in 50 µl of 2xTY and plate on a regular TYE plate containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose.11. Grow plates at 37°C overnight.The first round of selection is the most important. Any errors made at this point will be amplified in subsequent rounds of selection. After each round you should get back at least 100 infective phage. If you get less than this it is probable that a mistake has occurred. If so, try repeating the infection with a freshly grown TG1 culture (from a new overnight) at an OD 600 of 0.4 using the remaining 250 µl of eluted phage from C7. If this still yields less than 100 phage, repeat the selection starting at C1.1. After overnight growth add 7 ml of 2xTY 15 % glycerol to the large square Bio-Assay dish or 2mlsto the regular plates and loosen the cells with a glass spreader, mixing them thoroughly. After inoculating 50 µl of the scraped bacteria to 50 ml of 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose, store 1 ml of the remaining bacteria at -70°C in 15% glycerol.2. Grow shaking at 37°C until the OD 600 is 0.4 (1-2 hrs).3. Take 10 ml of this culture and add 5x1010 helper phage.4 Incubate without shaking in a 37°C water bath for 30 min.5. Spin at 3,000 g for 10 min. Resuspend in 50 ml of 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin, 50 µg/mlkanamycin and 0.1% glucose.6. Incubate shaking at 30°C overnight.7. Spin the overnight culture at 3,300 g for 15 min.8. Add 10 ml PEG/NaCl (20 % Polyethylene glycol 6000, 2.5 M NaCl)to 40 ml supernatant. Mix welland leave for 1 hr on ice.9. Spin 3,300 g for 30 min. Pour away PEG/NaCl. Respin briefly and aspirate any remaining dregsof PEG/NaCl.10. Resuspend the pellet in 2 ml PBS and spin at 11,600 g for 10 min in a micro centrifuge to removethe remaining bacterial debris.11. Use 1 ml of this phage for the next round of selection (protocols C and D) and store 1 ml at 4°C.12. Repeat selection for another 2 rounds.Populations of phage produced at each round of selection can be screened for binding by ELISA to identify "polyclonal" phage antibodies. Phage from single colonies can then be screened by ELISA to identify "monoclonal" phage antibodies. Alternatively, after a polyclonal phage ELISA you could proceed directly to making monoclonal soluble antibody fragments, see protocol F. In general, we have found that 2% Marvel in PBS is best for blocking during phage ELISA whereas 3% BSA in PBS is best for blocking during scFv ELISA.1. Coat a 96 well flexible assay plate10 overnight with 100 µl per well of antigen in the same bufferand at the same concentration as used for selection.2. Wash wells 3 times with PBS. Plates can be immersed in a shallow bath containing PBS but youshould check that all wells fill with wash solution (if they do not you may create false positivesduring later washes). Discard liquid by flipping plate over and then shaking it. Add 200 µl per well of 2 % MPBS (2 % Marvel in PBS) or 3% BSA-PBS (3% bovine serum albumin in PBS) to block and incubate for 2 hr at rt.3. Wash wells 3 times with PBS. Add 10 µl PEG precipitated phage from the end of each round ofselection in 100 µl 2 % MPBS (or 3 % BSA-PBS).4. Incubate for 1 hr at rt. Discard phage solution and wash 3 times with PBS-0.1 % Tween 20.5. Add 1 in 5000 dilution of HRP-anti-M1311 in 2 % MPBS (or 3 % BSA-PBS). Incubate for 1 hr atrt., wash 3 times with PBS-0.1 % Tween 20.µl of substrate solution (100 µg/ml TMB12 in 100 mM sodium acetate, pH 6.0. with10 µl 1006. Addof 30 % hydrogen peroxide added to 50 ml of this solution directly before use) to each well and leave at rt. for 2-15 min. A blue colour should develop.7. Stop the reaction by adding 50 µl 1 M sulphuric acid. The blue colour should turn yellow.9. Inoculate individual colonies from the titration plates from each round of selection (see C11) into100 µl 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose in 96 cell-well plates13. Growshaking (250 rpm) overnight at 37°C.10. Use a 96 well transfer device14 to transfer a small inoculum (about 2 µl) from this plate to asecond 96 cell-well plate containing 200 µl of 2xTY with 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose per well. Grow shaking (250 rpm) at 37°C for 2 hr. (Make glycerol stocks of the original 96-well plate, by adding glycerol to a final concentration of 15 %, and then storing the plates at -70°C).11. After 2 hr incubation (of the second plate) add 25 µl 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin, 1 %glucose and 109 helper phage.12. Shake (250 rpm) at 37°C for 1 hr. Spin 1,800 g for 10 min, then aspirate off the supernatant.13. Resuspend pellet in 200 µl 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin and 50 µg/ml kanamycin. Growshaking (250 rpm) overnight at 30°C.14. Spin at 1,800 g for 10 min and use 50 µl of the supernatant in phage ELISA as detailed above.Individual colonies picked from the various rounds of selection (as plated on the dilution series) can be induced in TG-1 to produce soluble scFv (F2-F6). This will ensure the expression of all selected clones including those in which the scFvs contain TAG stop codons (TG-1 as able to suppress termination and introduce a glutamate residue at these positions). Unfortunately, since the TAG stop codon between the scFv and the gIII gene is also suppressed this leads to co-expression of the scFv-pIII fusion which tends to lower the overall levels of scFv expression, even in clones where there are no TAG stop codons in the scFv itself. To circumvent this problem, the selected phage can be used to infect HB2151 (a non-suppresor strain) which is then induced to give soluble expression of antibody fragments (scFv genes that do not contain TAG stop codons will now yield higher levels of soluble scFv than in TG-1, but those that contain TAG stop codons will not produce any soluble scFv) (F1-F6). The expressed scFvs can then be used in ELISA. Detection of bound scFv can be performed using either Protein A-HRP15 or Protein L-HRP16 conjugates.1. From each selection take 10 µl of eluted phage and infect 200 µl exponentially growing HB2151bacteria (OD 600 of 0.4) for 30 min at 37°C in a water bath. Plate 50 µl, 50 µl of a 1:102 dilution,50 µl of a 1:104 dilution and 50 µl of a 1:106 dilution on TYE plates containing 100 µg/mlampicillin and 1 % glucose and grow overnight at 37°C.2. Pick individual colonies into 100 µl 2xTY 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose in 96 cell-wellplates and grow shaking (250 rpm) overnight at 37°C./doc/d1ca22bb960590c69ec376eb.html e a 96 well transfer device14 to transfer a small inocula (about 2 µl) from this plate to a second96 cell-well plate containing 200 µl 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin and 0.1 % glucose perwell. Grow shaking (250 rpm) at 37°C until the OD 600 is approximately 0.9 (about 3 hr). (A stock can be made of the first plate, by adding glycerol to a final concentration of 15 % and storing at -70°C).4. Once OD 0.9 is reached (wells look quite cloudy) add 25 µl 2xTY containing 100 µg/ml ampicillinand 9 mM IPTG (isopropyl β-D-thiogalactoside, final concentration 1 mM IPTG). Continueshaking (250 rpm) at 30°C overnight.5. Coat a 96 well flexible assay plate overnight with 100 µl per well of antigen in the same buffer andat the same concentration as used for selection.6. Spin the plate from step F4 at 1,800 g for 10 min and use 50 µl of the supernatant (take care notto transfer any bacteria) for ELISA in 3% BSA-PBS (final concentration) (protocol E) except usinga 1:5000 dilution of Protein A-HRP15 or Protein L-HRP16 to detect binding in step E5.µl TG1 at an OD 600 of 0.4 with 10 µl of 100-fold serial dilutions of KM13 helper 2001. Infectphage3 (in order to get well separated plaques) in a 37°C water bath (without shaking) for 30 min.Add to 3 ml molten H-top agar (42°C) and pour onto warm TYE plates (no antibiotics). Allow to set and incubate overnight at 37°C.2. Pick a small plaque into 5 ml of fresh TG1 at an OD 600 of 0.4. Grow for about 2 hr shaking at37°C.3. Add to 500 ml 2xTY in a 2 litre flask and grow shaking at 37°C for 1 hr. Add kanamycin to a finalconcentration of 50 µg/ml (no glucose). Grow overnight shaking at 30°C.4. Spin overnight culture at 10,800 g for 15 min. Add 100 ml PEG/NaCl (20 % polyethylene glycol6000, 2.5 M NaCl) to 400 ml supernatent and leave for 1 hr on ice.5. Spin 10,800 g for 30 min. Pour away PEG/NaCl.6. Resuspend the pellet in 8 ml PBS and add 2 ml PEG/NaCl. Mix well and leave for 20 minutes onice.7. Spin 3,300 g for 30 min. Respin briefly and aspirate any remaining dregs of PEG/NaCl.8. Resuspend pellet in 5 ml PBS and spin at 11,600 g for 10 min in a micro centrifuge to remove anyremaining bacterial debris.9. Store the helper phage at 4°C for short term storage or in PBS with 15 % glycerol for longer termstorage at -70°C.10. To titre the helper phage take 45µl phage and add 5µl trypsin stock solution. Incubate for 30 minsat 37 °C. Dilute 1µl of trypsin treated phage in 1ml PBS and make five 100 fold serial dilutions of this in 1ml aliquots of PBS. Add 50µl of the six dilutions to six separate tube containing 1ml of TG1 at an OD 600 of 0.4. Mix, add 3 ml molten H-Top and pour evenly onto TYE plates.Perform the same dilution series using 1µl of non-trypsin treated phage. The titre of the trypsin treated phage should be 105-108 lower than for the non-trypsin treated phage. If not, pickanother plaque and repeat helper phage preparation.Once the libraries have been selected you may wish to check individual clones for the presence of full length VH and Vκinsert. All PCRs are at annealing temperature of 55°C. 1 min extension for V H or Vκon their own, 2 min extension for V H and Vκ together.For V H only use LMB3: CAG GAA ACA GCT ATG AClink seq new: CGA CCC GCC ACC GCC GCT Gwith insert = 527 bpwithout insert = 227 bpFor Vκ only use DPK9 FR1 seq: CAT CTG TAG GAG ACA GAG TCpHEN seq: CTA TGC GGC CCC ATT CAwith insert = 368 bpwithout insert = no bandFor V H and Vκ use LMB3: CAG GAA ACA GCT ATG ACpHEN seq: CTA TGC GGC CCC ATT CAwith insert = 935 bpwithout insert = 329 bpFor sequencing of selected clones the following primers are recommended.For V H use link seq new CGA CCC GCC ACC GCC GCT GFor Vκ use pHEN seq CTA TGC GGC CCC ATT CAXhoI NotIRBS CAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCAAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCATA ATG AAA TAC CTA ----------------> M K Y L LMB3SfiI __NcoI__TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG TTT L P T A A A G L L L L A A Q P A M A E V F XhoI linkerGAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCG AGC GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGTD Y W G Q G T L V T V S S G G G G S G G GSalI NotI HIS-tag GGC AGC GGC GGT GGC GGG TCG ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG GCG GCC GCA CAT CAT CAT CACG S G G G G S T D I Q M T Q A A A H H H H<------------------------link seq newmyc-tagCAT CAC GGG GCC GCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA TAG ACTH H G A A E Q K L I S E E D L N G A A * T<---------------------pHEN seq1. 2xTY is 16g Tryptone, 10g Yeast Extract and 5g NaCl in 1 litre.2. Bovine ubiquitin (5 mg) is available from Fluka, Chemika-BioChemika, Industriestrasse 25, CH-9470 Buchs, Switzerland, Tel +41 81 755 2511, Fax +41 81 756 5449.3. KM13 is the protease cleavable helper phage described i n Kristensen and Winter, Folding andDesign3, 321-328 (1998).4. PBS is5.84 g NaCl, 4.72 g Na2HPO4 and 2.64 g NaH2PO4.2H20, pH 7.2, in 1 litre.5. TYE is 15g Bacto-Agar, 8g NaCl, 10g Tryptone, 5g Yeast Extract in 1 litre.6. Nunc Maxisorp immuno test tubes (Cat. No. 4-44202) are available from Gibco BRL, LifeTechnologies Ltd., P. O. Box 35, Trident House, Washington Road, Paisley, PA3 4EF, Scotland, U.K, Tel +44 141 814 6100, Fax +44 141 887 1167.7. 'Marvel' is dried skimmed milk powder.8. Trypsin (T-1426 Type XIII from Bovine Pancreas - Sigma Chemical Company Ltd., Fancy Rd.,Dorset, BH17 7NH, U.K, Tel +44 1202 733114; Fax +44 1202 715460) made up in 50mM Tris-HCl pH7.4, 1mM CaCl2 and stored at -20°C9. Nunc Bio-Assay dish is available from Gibco BRL (see note 6).10. Falcon MicroTest III flexible 96 well flat bottomed assay plates are available from BectonDickinson Labware, Becton Dickinson and Co., 2 Bridgewater Lane, Lincoln Park, NJ 07035,USA.11. HRP-anti-M13 is available from Amersham International plc, Amersham Place, Little Chalfont,Buckinghamshire, HP7 9NA, UK. Tel: +44 01494 544000; Fax: +44 01494 542929.12. TMB is 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine and is available from Sigma (see Note 8). A 10 mg/ml stocksolution can be made by dissolving the TMB in DMSO.13. Corning 'Cell Wells' flat-bottomed multiple well tissue culture treated plates are available fromCorning Glass Works, Corning N.Y. 14831. USA.14. The 96 well transfer device is a piece of wood the size of a microtitre plate with a handle on oneside and 96 metal pins (each 7 cm long with a concave end) on the other. This can be sterilised between bacterial transfer by immersion in a bath of ethanol and then by flaming (hold well away from your body and any flamable objects). If you haven't got one of these (or something similar) you will have to make one yourself or alternatively use a multichannel pipette for bacterialtransfer.15. Horse Radish Peroxidase conjugated Protein A is available from Amersham International plc (seenote 11)14. Horse Radish Peroxidase conjugated Protein L is available from Actigen Ltd, 5 Signet Court,Swanns Road, Cambridge, CB5 8LA, UK. Tel: +44 01223 319101; Fax: +44 01233 316443.。

免疫试题库(附答案)

免疫试题库（附答案）一、单选题（共100题，每题1分，共100分）1、制备抗血清首次与二次之间免疫接种的间隔时间通常为A、10-20dB、5-10dC、15-30dD、40-50dE、3-5d正确答案：A2、用于包被斑点金免疫层析试验载体膜质控条(线)的物质是A、人白蛋白B、胶体金颗粒C、待测抗原标准品D、胶体金标记抗体E、抗免疫金抗体正确答案：E3、噬菌体抗体库技术是利用λ噬菌体载体表达A、FcB、FabC、胸腺嘧啶核苷D、CD分子E、V-D-J正确答案：B4、免疫印迹法常用于A、补体测定B、甲胎蛋白的测定C、免疫球蛋白含量的测定D、抗HIV的确认试验E、细胞因子的测定正确答案：D5、下列细胞因子的英文缩写错误的是A、白细胞介素-ILB、肿瘤坏死因子-TNFC、干扰素-MCFD、集落刺激因子-CSFE、红细胞生成素-EPO正确答案：C6、下列成分有可能与大分子抗原结合而出现肉眼可见反应的是A、Fc段B、Fab段C、F(ab’)2段D、IgG的L链E、IgG的H链正确答案：C7、下列哪种免疫球蛋白在特应性过敏症患者血清中浓度可升高A、IgGB、IgMC、IgDD、IgAE、IgE正确答案：E8、补体不具备下列哪种作用A、溶解细胞作用B、过敏毒素作用C、中和毒素作用D、趋化作用E、调理作用正确答案：C9、慢性排斥反应的主要原因是A、CD4T细胞/巨噬细胞B、抗ABO血型抗体或HLA-Ⅰ类分子抗体C、NK细胞D、抑制细胞的活化E、对HLA抗原的耐受正确答案：A10、玻片法做ABO血型鉴定，属于A、直接凝集反应B、协同凝集反应C、间接血凝反应D、间接凝集抑制反应E、Coombs试验正确答案：A11、1分子亲和素可结合几分子生物素A、2分子B、1分子C、8分子D、3分子E、4分子正确答案：E12、能特异性刺激粒细胞集落形成单位生长的是A、EPOB、G-CSFC、M-CSFD、GM-CSFE、TPO正确答案：B13、在临床检验室内质量控制中，如果质控结果出现失控信号，下列做法正确的是A、增加质控规则，提高误差检出B、发出患者结果，不寻找原因C、增加质控的个数，提高误差检出D、寻找失控的原因，并采取一定的措施加以纠正，然后重新测定，再决定是否发出报告E、先发出患者结果，然后寻找原因正确答案：D14、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体是A、HBVB、HCVC、HIVD、HPVE、HSV正确答案：C15、初次应答时，产生的抗体具有哪种特点A、抗体维持时间较长B、IgG与IgM几乎同时产生C、为低亲和性抗体D、抗体含量较高E、以IgG为主正确答案：A16、特异性体液免疫应答的介导细胞主要是A、T淋巴细胞B、B淋巴细胞C、巨噬细胞D、郎罕细胞E、TH1细胞正确答案：B17、ELISA双抗原夹心法检测抗体时，固相载体包被物是A、未标记的已知抗原B、未标记的已知抗体C、未标记的抗抗体D、酶标记的抗原E、酶标记的抗体正确答案：A18、类风湿性关节炎患者滑膜液中常检出的类风湿因子是A、同IgG轻链发生反应的IgMB、同IgG重链发生反应的IgMC、同细菌抗原发生反应的IgED、同胶原蛋白发生反应的IgE、同DNA发生反应的IgG正确答案：B19、不属于细胞因子生物学活性的是A、增强抗感染和细胞杀伤效应B、促进靶细胞的增殖和分化C、促进炎症过程，影响细胞代谢D、促进或抑制其他细胞因子和膜表面分子的表达E、中和及溶解病毒作用正确答案：E20、检测抗血细胞抗体主要用于检测超敏反应的类型是A、Ⅱ型B、Ⅳ型C、Ⅴ型D、Ⅰ型E、Ⅲ型正确答案：A21、关于抗核抗体下列选项中正确的是A、抗核抗体有器官特异性B、抗核抗体有种属特异性C、是以自身抗原作为靶抗原的一组自身抗体的总称D、抗核抗体泛指各种核成分的抗体E、抗核抗体只能与人的细胞核起反应正确答案：D22、人T细胞可根据下列哪个特征区别于B细胞及其它细胞A、形态B、Fc受体的存在C、胞浆颗粒的是否存在D、CD2E、Ig表面标志正确答案：D23、完全抗原的特征是A、有免疫原性，无反应原性B、无免疫原性和反应原性C、必须与载体结合才具有免疫原性D、有反应原性，无免疫原性E、有免疫原性和反应原性正确答案：E24、直接法荧光抗体技术检查抗原是将荧光素标记在A、特异性抗体B、抗补体抗体C、抗原D、抗人IgGE、补体正确答案：A25、下列免疫学测定方法中敏感性最高的是A、沉淀反应B、凝集反应C、ELISAD、放射免疫测定E、补体结合试验正确答案：D26、巨噬细胞产生的主要细胞因子是A、IL-5B、IL-1C、IL-4D、IL-10E、IL-2正确答案：B27、Percoll分离液的主要成分是A、聚蔗糖B、聚乙二醇C、聚乙烯吡咯烷酮D、经聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒E、泛影葡胺正确答案：D28、下列哪一项不属于粘附分子的功能A、参与体液免疫应答B、在肿瘤转移过程中发挥重要作用C、参与细胞的生长与分化D、参与细胞的信号转导E、参与细胞的伸展与移动正确答案：A29、将外毒素转变为类毒素A、可减弱毒素的毒性B、可增强毒素的免疫原性C、可增强吞噬细胞的吞噬活性D、可降低毒素的免疫原性E、可增强毒素的毒性正确答案：A30、CD4的功能是A、诱导B细胞参与免疫应答B、起正调节作用C、是HIVgp120受体D、抑制T细胞活化E、构成BCR-IgαIgβ复合体正确答案：C31、膜载体的酶免疫测定最常用的载体为A、硝酸纤维素膜B、华特曼滤纸C、分子筛D、醋酸纤维膜E、聚丙烯酰胺正确答案：A32、抗原抗体反应的特点是A、抗原抗体结合是不可逆的B、抗原抗体结合后仍可与其他抗原结合C、解离后抗体不能再与抗原结合D、解离后抗体活性和特异性不变E、解离后抗原抗体结构活性改变正确答案：D33、属于肿瘤主动生物治疗方法的是A、LAK细胞治疗B、化疗C、TIL治疗法D、接种肿瘤疫苗E、放射性核素标记mAb正确答案：D34、用针对哪一种抗原的单克隆抗体可鉴定人的Tc细胞A、CD8B、CD4C、CD3D、gh-2E、Lyt-1正确答案：A35、较长时间(4-5年)保存抗体，最好采用A、-30℃保存B、-10℃保存C、-20℃保存D、4℃保存E、真空干燥保存正确答案：E36、抗原抗体反应特点不包括A、电离性B、特异性C、比例性D、阶段性E、可逆性正确答案：A37、能帮助T细胞将TCR与抗原肽结合的信息传入细胞内的分子是A、CD2B、CD3C、CD4D、CD21E、CD19正确答案：B38、终点法散射比浊分析应保证A、抗体过量B、抗原过量C、抗原：抗体为2:1D、抗原:抗体为1：2E、抗体抗原处于最适比正确答案：A39、初次免疫应答时产生抗体的特点是A、为高亲和性抗体B、抗体效价高C、IgG为主D、以IgM为主E、持续时间长正确答案：D40、载体至少连接多少数目以上的半抗原才能有效地产生抗体A、30B、10C、50D、40E、20正确答案：E41、甲、乙两种抗原都能与某一抗体发生特异性结合反应，这两种抗原相互称为A、半抗原B、完全抗原C、TD-AgD、TI-AgE、共同抗原正确答案：E42、荧光素发射荧光属于A、电化学发光B、偏振光C、化学发光D、生物发光E、光照发光正确答案：E43、辅助性T细胞表达的CD抗原是A、CD4B、CD8C、CD19D、CD35E、CD40正确答案：A44、下列为NK细胞特有表面抗原的是A、CD2B、CD16C、CD56D、CD39E、无特异表面抗原正确答案：C45、TCR、BCR可变区基因重排的机制是A、7-12-9与7-12-9环出B、7-23-9与7-23-9环出C、7-12-9与7-23-9环出D、7-12-9与9-23-7环出E、内含子之间环出正确答案：C46、沉淀反应中如抗体过量将出现A、沉淀物增多B、后带现象C、等价带现象D、前带现象E、假阳性正确答案：D47、HLA分子中与移植免疫的关系最为重要的是A、HLA-AB、HLA-BC、HLA-CD、HLA-DRE、HLA-DP正确答案：D48、参与免疫溶血反应的成分是A、红细胞、补体B、红细胞、抗红细胞抗体、补体C、白细胞、抗白细胞抗体、补体D、红细胞、抗红细胞抗体E、抗红细胞抗体、补体正确答案：B49、肿瘤免疫学检验试图通过免疫学方法检测的物质是A、补体B、细胞因子受体C、细胞因子D、肿瘤标志物E、免疫球蛋白正确答案：D50、CD8的配体是A、MHCII类分子B、MHCI类分子C、B7D、CD28E、CD40正确答案：B51、T细胞表面不表达的分子是A、CD2B、CD3C、CD28D、CD80(B7)E、TCR正确答案：D52、HLA-I类抗原A、主要存在于B细胞、单核巨噬细胞和部分活化T细胞表面B、只能用混合淋巴细胞培养法检测，故又称LD抗原C、其重链由第6号染色体上HLA-I类基因编码D、由α和β两条糖肽链借非共价键连接组成E、为TH细胞活化的协同刺激分子正确答案：C53、常用于诊断小细胞肺癌的酶类肿瘤标志物是A、碱性磷酸酶B、乳酸脱氢酶C、神经元特异性烯醇化酶D、谷胱甘肽-S-转移酶E、酸性磷酸酶正确答案：C54、关于NK细胞错误的是A、来源于骨髓B、CP16、CD56是其特有标志C、表达TCR-CD3复合物D、大多数为CD4-CD8-E、识别CD1分子提呈的脂类或糖类抗原正确答案：B55、最先被用作免疫标记技术的标记物是A、酶B、放射性核素C、荧光素D、激素E、生物素正确答案：C56、抗原抗体反应中，何种条件形成肉眼可见的免疫复合物A、抗体显著多于抗原B、抗原略多于抗体C、抗原抗体比例适当D、抗原显著多于抗体E、抗体略多于抗原正确答案：C57、作为荧光显微镜光源不可能是A、高压汞灯B、紫外线C、氙灯D、卤素灯E、氚灯正确答案：B58、参与体液免疫应答的主要免疫细胞是A、淋巴细胞B、T细胞C、B细胞D、吞噬细胞E、粒细胞正确答案：C59、哪项不是初次应答的规律A、抗体亲和力高B、潜伏期长C、抗体水平低D、产生的抗体以IgM为主E、抗体维持时间短正确答案：A60、有关BCR和抗体描述正确的是A、1个B细胞的BCR和分泌的抗体特异性不同B、二者编码的基因相同C、不具有类别转换D、基因重排发生于免疫应答阶段E、二者可变区不同正确答案：B61、将人IgG给家兔免疫后可得到A、抗γ链抗体B、抗κ链抗体C、抗λ链抗体D、抗Fc段抗体E、以上均可正确答案：E62、艾滋病免疫学检查一般包括A、人类免疫缺陷病毒抗体和B细胞B、T细胞和B细胞C、人类免疫缺陷病毒和其他病毒抗体D、人类免疫缺陷病毒抗体和T细胞E、细菌和真菌正确答案：D63、属于被动免疫治疗的是A、TILB、应用短小棒状杆菌疫苗C、接种狂犬疫苗D、接种肿瘤疫苗E、使用卡介苗正确答案：A64、关于化学发光酶免疫分析不正确的是A、以过氧化物酶为标记酶B、加入发光剂提高敏感度和稳定性C、以邻苯二胺为底物D、化学发光剂作为酶反应底物E、是将发光系统与免疫反应相结合的技术正确答案：C65、关于特异性抗体的鉴定叙述正确的是A、抗体特异性鉴定常采用凝集反应B、抗体效价鉴定常采用单向琼脂扩散试验C、抗体效价鉴定常采用酶联免疫法D、抗体纯度鉴定常采用双向免疫扩散法E、抗体纯度鉴定常采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法正确答案：E66、酶免疫分析技术中常用于标记的酶有A、辣根过氧化物酶和过氧化氢酶B、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶C、β半乳糖苷酶D、过氧化氢酶E、B和C正确答案：E67、IgE分子的哪个部位与肥大细胞膜上的相应受体结合A、Fab段B、CH2C、H链可变区D、H链恒定区E、Fc段正确答案：E68、AIDS患者的T细胞亚群检测一般会出现A、CD4↓CD4/CD8↓B、CD8↓CD4/CD8↑C、CD4↑CD4/CD8↑D、CD8↑CD4/CD8↓E、CD3↑CD4/CD8↑正确答案：A69、导致慢性移植排斥反应的主要原因是A、微生物感染B、再灌注损伤C、迟发型超敏反应D、抑制剂的应用E、局部缺血正确答案：C70、GVHR的中文全称为A、移植物抗宿主反应B、荧光偏振免疫分析C、补体依赖的细胞毒作用D、宿主抗移植物反应E、人类白细胞抗原正确答案：A71、细胞毒性T细胞的主要功能是A、辅助B细胞分化成抗体产生细胞B、放大细胞免疫应答C、促进杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞D、特异性溶解靶细胞E、与NK细胞协同反应正确答案：D72、检测浆膜腔积液何种肿瘤标志物有助于胰腺癌的诊断A、CEAB、AFPC、HCGD、CA199E、CA724正确答案：D73、CD8抗原存在于A、辅助性T淋巴细胞表面B、细胞毒性T淋巴细胞表面C、吞噬细胞表面D、所有成熟的T淋巴细胞表面E、B淋巴细胞表面正确答案：B74、不属于Ⅱ型变态反应的是A、新生儿溶血症B、特发性血小板减少性紫癜C、自身免疫性溶血性贫血D、输血反应E、过敏性休克正确答案：E75、关于小分子抗体的叙述，错误的是A、采用干细胞技术B、不能通过胎盘C、属基因工程抗体D、易于穿透血管和组织E、不含Fc段正确答案：A76、CD3主要分布在A、DCB、APCC、胸腺细胞D、浆细胞E、成熟T细胸正确答案：E77、属于肿瘤糖链抗原的是A、AFPB、PSAC、CEAD、CA19-9E、APT正确答案：D78、“新生儿溶血症”多发生于A、Rh+的胎儿+Rh+的母体B、Rh-的母体+Rh+的胎儿C、Rh-的胎儿+Rh+的母体D、Rh+的母体E、Rh-的母体正确答案：B79、制备单克隆抗体最常用的细胞融合剂为A、HATB、8-AGC、PEGD、PHAE、BSA正确答案：C80、补体系统被激活后形成的膜攻击复合物是A、C1-C9B、C3bBbC、C5b6789D、C4b2bE、C4b2b3b正确答案：C81、关于IRMA的说法正确的是A、反应中加入过量的标记抗原B、反应中加入定量的标记抗原C、反应中加入过量抗体D、反应中加入过量的标记抗体E、反应中加入定量的标记抗体正确答案：D82、下列哪一个HLA功能区在人类中具有相同的抗原性A、胞浆区B、HLA穿膜区C、肽结合区D、Ig样区E、以上均不是正确答案：D83、关于淋巴细胞分离的描述错误的是A、Ficoll分离液法是一种单次差速密度梯度离心的分离法B、温度可影响Ficoll分离的细胞收率C、为获得较纯的单个核细胞，需根据待分离细胞的比重调整分离液的比重D、采用贴壁黏附法分离到的淋巴细胞群中不会损失B细胞E、Percoll分离是一种连续密度梯度离心分离法，是纯化单核细胞和淋巴细胞的一种较好的方法正确答案：D84、与抗体产生有关的细胞是A、粒细胞B、NK细胞C、巨噬细胞D、Tc细胞E、红细胞正确答案：C85、不属于杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理的是A、采用转基因技术B、利用代谢缺陷补救机制筛选出杂交瘤细胞C、杂交瘤保持双方秦代细胞的特性D、杂交瘤细胞可以无限增殖E、淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说正确答案：A86、在电场作用下的加速度的单向扩散试验是A、火箭电泳B、对流免疫电泳C、免疫电泳D、免疫固定电泳E、区带电泳正确答案：A87、制作荧光抗体染色标本最关键的是A、力求保持抗原的完整性B、切片尽量薄些C、采用石蜡切片或冷冻切片法D、材料要新鲜并立即处理及时冷藏E、标本需要固定正确答案：A88、当怀疑患有性联丙种球蛋白缺乏症时应首先考虑进行A、SmIg的检测B、CD的测定C、同种血型凝集素测定D、Ig浓度测定E、特异性抗体产生能力的测定正确答案：D89、少量多次的抗毒素脱敏疗法的基本原理是A、稳定肥大细胞膜，阻止其脱颗粒B、逐步消耗肥大细胞上的IgEC、舒张平滑肌D、中和IgDE、以上都是正确答案：B90、对死疫苗叙述错误的是A、需多次接种B、注射的局部和全身反应较重C、能诱导细胞免疫形成和特异性抗体产生D、用免疫原性强的病原体灭活制成E、保存比活疫苗方便正确答案：C91、参与Ⅱ型超敏反应的细胞是A、嗜碱性粒细胞、NK细胞B、肥大细胞、巨噬细胞C、NK细胞、巨噬细胞D、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞E、肥大细胞、NK细胞正确答案：C92、牛痘苗的发明者是A、德国BehringB、法国PasteurC、德国KochD、澳大利亚BurnetE、英国Jenner正确答案：E93、免疫对机体是A、有利也有害B、正常条件下有利，异常条件下有害C、有利的D、有利无害E、有害的正确答案：B94、乳糜泻病人与下列哪种HLA抗原呈关联A、HLA-B17B、HLA-B8C、HLA-DR2D、HLA-DR3E、HLA-B35正确答案：D95、自身抗体检测对某些自身免疫病诊断的价值正确的是A、敏感性低，特异性低B、敏感性低，特异性强C、相关性不明显D、敏感性高，特异性强E、敏感性高，特异性较低正确答案：E96、在荧光抗体技术中，常用的荧光素为A、FITCB、RB200C、TRITCD、PEE、R-RE正确答案：A97、抗原的特异性取决于A、抗原结构的复杂性B、抗原的化学组成C、抗原分子量的大小D、抗原决定簇的性质、数目及空间构型E、抗原表位的数量正确答案：D98、Ficoll 淋巴细胞分离法是一种A、连续密度梯度离心法B、差速密度梯度离心法C、离子交换层析法D、自然沉降法E、亲和层析法正确答案：B99、抗CD4单克隆抗体不可检出下列哪些细胞A、TH0B、TH1C、TcD、TDTHE、TH2正确答案：C100、ELISA操作过程中导致空白对照孔显色加深的主要原因是A、加样不准B、保温时间不准C、洗涤不彻底D、酶标抗体变性，酶脱落E、照射时间长正确答案：C。

噬菌体抗体库技术

在抗体片段如ScFv和Fab的可变区基因序列的5‘端加入细菌的信号肽
序列,抗体片段即可分泌到（ZHOU）质腔,并在那里完成折叠,成为有功能
的蛋白质分子,
3有效筛选系统的建立
传统的筛选方法使用固相化的纯化抗原,依赖噬菌体颗粒对目的抗原的
亲和力差异来获得较高亲和力的抗体,而目前,可以在体外用完整的固化哺
3.2噬菌体抗体库载体的构建
首先提取细胞的总RNA,经过RTPCR扩增可变区基因
Standard template
酶切轻链PCR产物和表达载体
二者连接,转入感受态细胞中扩增
重链的PCR产物
酶切
成为轻链库
酶切
二者按照一定比例连接
转化入感受态细胞
加入噬菌体
收集噬菌体颗粒
噬菌体总抗体库
Apply to courseware production
简单的PEG沉淀方法就足以将噬菌体与其他所有污染的细胞蛋白分开,
Apply to courseware production
2.2噬菌体展示所使用的衣壳蛋白
Standard template
次要衣壳蛋白pIII

406aa组成,5个拷贝,位于噬菌体的尾部,
由三个功能区组成：
N1穿膜区：作用于E.coli细胞膜上的TolA
有Helperphage,噬菌粒就像质粒
一样进行扩增,
包装后的噬菌体含有两种不同
来源的成分：噬菌体质粒和
Helperphage,
使用野生型辅助噬菌体会导致
噬菌体污染,使得仅有很少部分
子代噬菌体带有抗体片段,
当有噬菌质粒时,由于噬菌质粒
含有野生型M13或者f1复制起

抗结核杆菌人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选

抗结核杆菌人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选何光志;田维毅;高英;王平;王文佳;王乾宇;黄高;安传伟【摘要】目的:构建人源噬菌体展示单链抗体(ScFv)库,筛选抗结核杆菌特异性、高亲和力的ScFv.方法:从结核患者的外周血淋巴细胞中,提取RNA并通过RT-PCR扩增出VH和VL基因,并采用SOE-PCR构建ScFv基因,将其克隆入噬粒载pC ANTA B5E中,转化于大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07援救构建噬菌体单链抗体库.结果:初级库库容量为3.5×106,在大肠杆菌TG1中重组后得到2.6 ×106的次级抗体库.结论:成功构建噬菌体展示ScFv库并获得人源抗结核杆菌特异性ScFv,为进一步研制抗抗结核杆菌的高特异性、高亲和力的基因工程抗体奠定了基础.%Aim: To construct a human phage-displayed single-chain Fv antibody (ScFv) library and screen specific ScFv against Mycobacterium Smegmatis. Methods: The total RNA was extracted from peripheral blood lymphocytes in patients with Mycobacterium Smegmatis, first strand cDNA synthesis was performed using a cDNA synthesis kit and an oligo ( dT) -18 primer. To human immunoglobulin H chain and L chain variable region of degenerate primers, cDNA first strand as a template, were amplified H chain and L chain variable region genes. SOE-PCR method to VH and VL fragments were assembled into ScFv fragments and then cloned into pCANTAB5E ScFv vector and transformed into competent TG 1 electric bacteria by helper phage rescue M13K07 get Mycobacterium Smegmatis single chain antibody phage display library. Results: A primary library of 3.5 X 106 and a second library of 2.6 x 106 were constructed. Conclusion: The results lay a solid foundation for preparation of human engineeringantibody to Mycobacterium Smegmatis reported herein with higher affinity.【期刊名称】《湖南师范大学自然科学学报》【年(卷),期】2011(034)005【总页数】5页(P70-74)【关键词】结核杆菌;人源噬菌体单链抗体;制备及筛选【作者】何光志;田维毅;高英;王平;王文佳;王乾宇;黄高;安传伟【作者单位】贵阳中医学院,中国贵阳550002;贵阳中医学院,中国贵阳550002;遵义医学院附属医院,中国遵义563003;贵阳中医学院,中国贵阳550002;贵阳中医学院,中国贵阳550002;贵阳中医学院,中国贵阳550002;遵义医学院附属医院,中国遵义563003;贵阳中医学院,中国贵阳550002【正文语种】中文【中图分类】R378.91+1结核分枝杆菌(Mycobacterium Smegmatis)是引起结核病的病原菌，也称结核杆菌.可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见.目前全球约有20亿肺结核带菌者，现症结核患者2 000万，每年有1 000万人新发病和300万人死亡.我国结核患者人数居世界第二位，全国1/3的人口曾受到结核菌的感染［1］.噬菌体抗体库技术是抗体工程领域的最重要进展，各种小分子抗体相继产生，在疾病的诊断与防治、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究、肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗等多个领域有着潜在的优势.该技术具有简单易行、生产成本低、筛选容量大等优点［2］.本研究尝试利用噬菌体展示技术构建大容量天然人源性噬菌体抗体库，从中筛选出结核杆菌的人源性单链抗体(single chain Fv fragment，scFv)，为进一步研制抗结核杆菌的特异性的基因工程抗体奠定了基础.100 mL外周血来自10例康复1月的结核患者(遵义医学院附属医院检验科提供)，淋巴细胞分离液，购自上海华精生物高科技有限公司.总RNA抽提试剂盒(TRIzol.R.Total RNA Isolation.Reagent)、逆转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，GIBCOBRL 公司产品;DNA Purification System，Promega，公司产品;100 bp DNA Ladder，SfiⅠ和NotⅠ限制性内切酶、Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶，购自大连宝生物公司;噬菌粒载体pCANTAB-5E、辅助噬菌体M13K07、大肠杆菌E.coli TG1、HRP/抗M13单克隆抗体，Amersham公司产品;结核杆菌抗原(批号:984010)，购自上海晶莹生物制品公司. 2.1 人源抗体VH和VL基因的PCR扩增以合成的cDNA为模板，VHf和VHr引物等物质的量混合扩增VH基因，Vκf/Vκr和Vλf/Vλr不同引物等物质的量混合液扩增VL基因.VL的PCR反应条件为:95℃预变性10 min;94℃ 60 s，66℃ 30 s，72℃30 s，共30个循环;最后72℃延伸10 min.VH的退火温度为65℃，其他反应条件同VL.PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收目的基因片段.2.2 ScFv基因的构建通过重叠延伸拼接法将VH和VL基因拼接成ScFv基因.取纯化的VH和VL基因片段经94℃ 40 s，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min，10个循环后，加含有酶切位点的引物VHf(SfiⅠ)和VLr(NotⅠ)，94℃ 30 s，66℃45 s，72℃ 90 s，35个循环.PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收.2.3 噬菌体抗体库的构建将上述PCR产物ScFv纯化回收，用SfiⅠ和NotⅠ进行酶切，与经同样双酶切的表达载体pCANTAB5E用T4 DNA连接酶，电转化大肠杆菌TG1，铺SOBAG平板.用2×YTAG培养基洗脱菌落，稀释至A600=0.5，加入辅助噬菌体M13K07继续振摇1 h，离心后用2×YTAK培养基重悬后振摇过夜，次日离心收集上清，加入1/5体积的PEG/NaCl溶液，冰浴，离心，重悬沉淀即为噬菌体ScFv库，过滤后于4℃储存备用.2.4 抗体库的重组率测定、酶切鉴定和多样性分析取适量抗体库接种在20 mL 2×YT-ATK(含10 g/L Glucose，100 mg/L Amp及20 mg/L Tet)培养基中，37℃，振摇培养至A600=0.68，加入辅助噬菌体M13K07于37℃静置60 min;4℃，3 500×g离心15 min，沉淀重悬于20 mL2×YT-ATK(含100 mg/L Amp，20 mg/L Tet，70 mg/L Kan)中培养过夜;在4℃条件下，8 000×g离心15 min，上清用40 g/L PEG-8000和30 g/L NaCl沉淀，4℃，10 000×g离心30 min弃上清，离心管倒置除去PEG液;沉淀用适量的PBS 重悬，移入另一离心管，反复吹打混匀，10 000×g离心5 min，上清即为噬菌体抗体库，检测库容.用SB培养液将所制备的噬菌体抗体库进行10倍系列稀释，分别加入100 μL大肠杆菌TG1(A600=1)，室温下感染20 min，涂SOBAG平板(含100 mg/L Amp)，于37℃过夜培养，次日计数噬菌落形成个数，计算噬菌体抗体库的库容，4℃保存.从SOBAG平板上随机挑取15个单菌落，进行PCR扩增用琼脂糖凝胶电泳检测ScFv的重组情况;提取PCR鉴定为阳性单菌落的质粒，用SfiⅠ和NotⅠ进行双酶切，采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析酶切图谱;随机挑取阳性克隆，采用PCR扩增ScFv基因片段，电泳回收后，用BstNⅠ酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析酶切图谱.2.5 噬菌体抗体库的筛选用包被液稀释结核杆菌抗原1 μg/mL包被96孔ELISA板，100 μL/孔，含30g/L BSA的PBS封闭，PBS洗涤后，加入噬菌体抗体库100 μL，37℃温育2 h;吸去噬菌体抗体液，以PBST洗涤1次(第2轮洗涤5次，第3～5轮洗涤10次)，PBST洗涤1次，加入100 μL洗脱液［含0.1 mol/L HCl(pH2)和1 g/L BSA］，于室温静置10 min;将洗脱液稍加吹打后吸出，立即用6 μL 2 mol/L Tris中和，加入2 mL大肠杆菌E.coli TG1，37℃静置20 min，加入20 mL SB(含氨苄西林和四环素)，37℃培养2 h;加入M13K07、卡那霉素.进行5次反复淘洗，收集沉淀.特异性噬菌体抗体得到高度富集.2.6 ScFv的特异性鉴定将第5轮筛选后洗脱的噬菌体感染大肠杆菌TG1，涂于SOBAG平板，过夜培养后，随机挑选细菌菌落接种于4 mL含Amp和四环素的SOBAG培养基中，37℃振荡培养过夜;取200 μL，加至4 mL含相同抗生素的SOBAG中，37℃振荡培养2 h后加入40 μL M13K07，培养2 h;再加入Kan至70 mg/L，30℃振荡培养12～16 h离心收集上清，即为单克隆噬菌体抗体，4℃保存.将待检噬菌体抗体与等量10 g/L BSA混合，室温孵育20 min，加至经抗结核抗原包被和BSA封闭的ELISA板中，于37℃温育2 h，用PBST洗板4次，PBS洗涤2次后，以HRP标记的M13噬菌体单克隆抗体进行结合反应，TMB显色.3.1 抗体重链和轻链可变区基因的PCR扩增以提取出的RNA为模板逆转录合成cDNA第一链后，再以cDNA为模板进行PCR反应分别扩增抗体基因重链和轻链可变区.产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，分别在300～400 bp间出现条带，结果见图1.3.2 单链抗体可变区片段(ScFv)的组装和全长扩增采用SOE-PCR的方法将抗体轻、重链可变区基因组装成ScFv片段，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳证实，组装后的ScFv基因在700～800 bp间出现条带 (图2).3.3 抗体库的库容、重组率测定及酶切鉴定构建的初级抗体库经(库容=涂板后生长出的噬菌斑数数目/涂板菌液量/涂板菌液稀释的倍数)计算，初级库容量为3.5×106.随机挑取20个菌落，经PCR鉴定表明，重组率为80%，故次级库的库容量为2.6×106;阳性质粒做双酶切鉴定，电泳示在700～800 bp间出现条带(图3).3.4 抗体库的多样性随机挑取的10个单克隆，经PCR扩增ScFv基因片段，电泳回收后，以BstNⅠ酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析显示，抗体库中抗体分子的多样性良好，见图4.3.5 噬菌体抗体库的筛选将抗结核杆菌抗原噬菌体抗体库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选.可以看到随着洗涤次数的增加，噬菌体抗体的收获率增加，经过5轮筛选增加约110倍，表明噬菌体抗体库得到富集(见表1).3.6 噬菌体ScFv特异性的初步鉴定从第5轮筛选得到的菌落中随机挑选20个克隆，制备噬菌体抗体，经ELISA检测，阳性克隆孔中液体显色，阴性孔中液体不变色.显色后，阴性对照孔450 nm时A值为0.076，15株ELISA的A值较高，呈现阳性反应，其450 nm时A值分布于0.256～0.532之间，阳性克隆检出率约为75%.对其中12号阳性克隆的可变区DNA序列和氨基酸进行分析，结果该克隆重链可变区与GenBank中登录的免疫球蛋白IgG重链可变区VH3有92%同源性，κ可变区与V-J4有92%同源性.表明12号阳性克隆为抗结核杆菌抗原噬菌体抗体.噬菌体抗体库技术是采用PCR的方法将B细胞全套可变区基因克隆出来，与噬菌体包膜蛋白融合表达，从而展示于噬菌体表面，即可建成噬菌体抗体库.ScFv的基本结构为VH-Linker-VL或VL-Linker-VH，由于ScFv抗体分子量只有全抗体的1/6，抗体只有可变区片段，不含恒定区，免疫原性较低，故易于穿过血管壁和组织屏障，没有Fc段，所以减少了与组织的非特异性结合，同时保留了与抗原结合的特异性和亲和性，具有结构简单，易于大规模生产，成本低等优点，因此在临床、科研、工业和新药设计等领域均具有诱人的应用前景［4-6］.ScFv抗体在感染性疾病的诊断与防治、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究、肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗、新型药物设计等多个领域发挥着越来越重要的作用［7-13］.目前，在多种噬菌体抗体库的构建，并从其中筛选出多株具功能活性的小分子抗体，如抗HBV、HIV、RSV、TNF、erbBZ和gpl20等单链抗体或Fab抗体［14-17］，有些已进入了临床I/II期试验.人源抗体的问世彻底解决了小分子抗体的人源化问题，极大地推动了人源抗体的研究及应用［18-20］.抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因由相对保守的骨架区和能够根据不同抗原做出相应变化的抗体互补决定区(CDR)组成，虽然抗体分子可变区有着数量巨大的多样性，但其骨架区的序列和前导序列相对保守，所以抗体可变区PCR引物的设计应可能考虑亲本抗体可变区序列的完整性和真实性.库容量大小影响抗体库质量的最主要因素，而基因的多样性是决定库容量大小，其直接决定了接下来筛选高亲和力的单链抗体［21］.因为淋巴细胞含目的抗体基因的mRNA是高丰度，有利于所建文库被筛选及克隆出高亲和力的抗体，所以选用淋巴细胞建库较好［3］.本研究扩增设计可变区引物时引用路艳等的工作［3］，通过提取患者康复后的外周淋巴细胞总RNA，经RT-PCR分别扩增出H链和L链可变区基因，将VH和VL片段随机拼接成ScFv片段克隆至pCANTAB5E载体，并转化至感受态TG1菌，经辅助噬菌体M13K07拯救，获得人源抗结核杆菌噬菌体展示单链抗体库，本研究为结核病的预防、诊断、治疗等研究奠定了基础.此研究为结核临床防治研究奠定了基础.【相关文献】［1］吴虢东，王玲.抗结核中药的研究进展［J］.医学综述，2007，13(6):475-476.［2］李菁，林彤，宋帅，等.基因工程重组抗体技术的研究进展［J］.生物技术通报，2009(10):40-44.［3］路艳，韩跃武，韩亚萍，等.抗白念珠菌人源性单链抗体库的构建及筛选［J］.中国生物制品学杂志，2009，22(11):1063-1067.［4］HUSTON 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抗结核杆菌人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选

第３４卷第５期
抗结建及筛选
何光志，田维毅高英王平王文佳王乾宇黄高安传伟，，，，，，
（．贵阳中医学院，１中国贵阳５００；．遵义医学院附属医院，５０２２中国遵义５３０）６０３
ｍｅｈｄｔｎｒｇｎｓｗｅｅａｓｍｂｅｔｃｖｆａｍｅｔａｄｔｅｌｎｄｉｔＣＴ５ｃｖｖｃｏｔｏＶＨａｄＶＬｆｍｅｔｒｓｅｌｄｉｏＳＦｇｎｓｎｎｃｏｅｏｐＡＮＡＢＥＳＦｅｔｒｏａｎｒｈｎ
结核分枝杆菌（ｙｏａｔｉｍｇａｓ是引起结核病的病原菌，ＭｃｃｒｍＳｅｍｔ）ｂｅｕｉ也称结核杆菌．可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见．目前全球约有２亿肺结核带菌者，Ｏ现症结核患者２００万，０每年有１００万人新发病和０３０万人死亡．０我国结核患者人数居世界第二位，全国１３的人口曾受到结核菌的感染．／］
ＡｓａｔＡｍ：ｏｃｎｔｃａｈｍａｈｇ－ｉｌｅｉｇｅｈｉＦｎｉｏｙ（ｃ）ｌｒｒｎｃｅｎｂｔｃｉＴｏｓｕｔｕｎｐａｅｄｓａｄｓｌｃａｖａｔｄＳｒｒｐｙｎ－ｎｂｉａａｄｓｒｅｂｙ
关键词结核杆菌；源噬菌体单链抗体；人制备及筛选
中图分类号Ｒ７．１３８９１文献标识码Ａ文章编号１０－５７２１）５０７－５００２３（０１０－０００
ＣｏｓｒｃｉｎａｄＳｃｅｎｎｆＨｕｎＳｉｇｅｃａｎＡｎｉｏｙｎｔｕｔｎｒｅｉｇｏｍａｎｌ — ｈｉｔｄｏｂＬｂａｙｏｔＭｙｏａｔｒｍｉｒｒｆＡｎｉｃｂｃｅｉ－ｕＳｍｅｍａｉｇｔｓ

ScFv噬菌体抗体库技术研究进展及其在寄生虫学上的应用

・综述・ScFv 噬菌体抗体库技术研究进展及其在寄生虫学上的应用侯俊然　何蔼　詹希美摘要　随着蛋白组学时代的到来,对目的抗体的需求量的增加,噬菌体抗体库技术获得抗体的优越性得到充分发挥。

该文主要介绍噬菌体抗体库技术的重要一种ScFv (单链抗体)噬菌体抗体库技术。

从理想ScFv 噬菌体抗体库的构建、可溶性表达、液体和固体筛选的优缺点及其在寄生虫学的应用等几个方面对此技术的研究进展作一综述。

关键词　噬菌体抗体库;可溶性表达;筛选;ScFv作者单位:510080广州,中山大学基础医学院寄生虫学教研室E 2mail :houjunran2003@ 电话:020********* 单链抗体(single 2chain antibody fragment ,ScFv ),仅为完整抗体的六分之一,相对分子质量(Mr )约为27000,由轻链可变区(vl )和重链可变区(vh )之间通过14～15个氨基酸的弹性小肽连接形成,具有许多优点:体积小,免疫原性低,不易引起人体排斥反应;无Fc 段,不易与具有Fc 受体的非靶细胞结合,成像清晰;渗透性好,能有效穿透致密的组织屏障;易于基因操作和基因工程大量生产。

在诊断和治疗方面有广泛的应用前景,将成为基因工程抗体技术的重要方法之一。

1　ScFv 噬菌体抗体库的技术流程从有关的细胞(免疫脾细胞、淋巴结细胞、外周血淋巴细胞等)克隆出抗体可变区Ig G ,设计引物,利用PCR 扩增出轻链可变区(vl )和重链可变区(vh ),用一段弹性连接肽将其连接,构成单链抗体ScFv 。

重组到噬菌体表达载体中,感染宿主菌,通过与噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白,把单链抗体ScFv 表达在噬菌体表面,利用特异性抗原进行筛选,并重复筛选过程,达到抗体的富集。

2　ScFv 噬菌体抗体库技术2.1　理想ScFv 噬菌体抗体库的构建Okamoto[1]认为理想ScFv 噬菌体抗体库是包含所有抗体可变区的功能位点,包含所有抗体组合形式,抗体多样性最大。

大题38 现代生物科技专题-2021年高考生物大题题型增分密训(解析版)

大题38 现代生物科技专题1．[生物——选修3：现代生物科技专题](15分)高温胁迫是影响植物生长发育的重要因素之一，高温会使番茄的生长发育受到限制。

科学家将来自土壤细菌中的codA基因转入番茄，使番茄对高温的耐受性大于野生型番茄。

回答下列问题：(1)过程①获得的DNA片段________(填“可以”“部分可以”或“不可以”)实现物种间的基因交流。

采用PCR 技术扩增codA基因时，操作过程中需要加热至90～95 ℃的目的是_________________________________________。

(2)去磷酸化是去掉黏性末端最外侧游离的磷酸基团，过程③对已开环的质粒两端去磷酸化的主要作用是________________；为使codA基因在受体细胞中表达，需要将其插在启动子之后，目的是_____________________________。

(3)过程④最常用的方法是________________，过程⑤用到的细胞工程技术是____________。

codA基因能否在番茄细胞中稳定遗传的关键是_____________。

【答案】(1)可以目的基因受热变性解旋为单链(2)防止质粒自身环化驱动codA基因(目的基因)的转录(3)农杆菌转化法植物组织培养codA基因(目的基因)是否插入到番茄的染色体DNA上(3分)【解析】(1)原核细胞DNA分子不含内含子，且过程①获得的DNA片段是反转录形成的，可以实现物种间的基因交流。

采用PCR技术扩增codA基因时，加热至90～95 ℃是为了打开双链。

(2)过程③构建基因表达载体时，对已开环的质粒两端去磷酸化可以避免质粒自身环化；启动子是RNA 聚合酶识别和结合的位点，可以驱动目的基因的转录，故为使codA基因在受体细胞中表达，需要将其插在启动子之后。

(3)过程④把目的基因导入受体细胞最常用的方法是农杆菌转化法，过程⑤指植物组织培养。

codA基因能否在番茄细胞中稳定遗传的关键是目的基因是否插入到受体细胞的染色体DNA上。

噬菌体展示技术的原理及应用

二、噬菌体展示技术旳应用现状
抗体：抗狂犬病毒旳单链抗体，抗HIV-1囊膜糖蛋白旳单链抗体，此抗体可专一性杀死被HIV-1感染并体现有gp120旳淋巴细胞, 中和响尾蛇毒素旳单链抗，等等。
疫苗：展示在噬菌体表面旳HIV-1 旳gp120-V3 环可象天然抗原一样引起明显旳免疫应答, 等等。
噬菌体抗体库旳构建
Antibody IgG structure
Antibody IgG structure
C
L
V
L
V
H
C
H
1
V
L
C
L
V
H
C
H
1
C
H
2
C
H
2
C
H
3
C
H
3
Antibody IgG structure
Hinge
(Fab’)2
Fab
Fc
MembraneExtension
Antibody IgG structure
选择措施：淘选（Panning)而不是筛选（Screening)
非展示系统展示系统
Solid phase selection with immunotubes
B
B
B
B
B
B
Immunotubecoated withantigen
诊疗被动免疫抗体蛋白质构造分析药物导航蛋白质纯化
Wash to remove unbound phage particles.
Elute bound phage
Amplify eluted phageRepeat selectionAnalyze a) ELISA b) Specificity c) Sequencing d) Affinity e) Activity

噬菌体抗体库技术及其应用_吴懿娜

[9]Wo l f M ,A l b r e c h t S ,M är k i C ,e t a l .P r o t e o l y t i c p r o c e s s i n g o f c h e m o -k i n e s :i m p l i c a t i o n si np h y s i o l o g i c a l a n dp a t h o l o g i c a l c o n d i t i o n s [J ].I n t J B i o c h e m C e l l B i o l ,2008,40(6-7):1185-1198.[10]M c Q u i b b a nG A ,G o n g J H ,T a mE M ,e t a l .I n f l a m m a t i o n d a m p e n e db y g e l a t i n a s e Ac l e a v a g e o f m o n o c y t ec h e m o a t t r a c t a n t p r o t e i n -3[J ].S c i e n c e ,2000,289(5482):1202-1206.[11]We b e r M ,B l a i r E ,S i m p s o nC V ,e t a l .T h e c h e m o k i n e r e c e p t o r D 6c o n s t i t u t i v e l yt r a f f i c s t o a n df r o m t h ec e l l s u r f a c et oi n t e r n a l i z ea nd de g r a d e c h e m o k i n e s [J ].M o l B i o l C e l l ,2004,15(5):2492-2508.[12]G r a h a m G J .D 6a n dt h ea t y p i c a l c h e m o k i n er e c e p t o r f a m i l y :n o v e lr e g u l a t o r s o f i m m u n ea n di n f l a m m a t o r y p r o c e s s e s [J ].E u r J I m m u -n o l ,2009,39(2):342-351.[13]B o n e c c h i R ,B o r r o n i E M,A n s e l m o A ,e t a l .R e g u l a t i o no f D 6c h e -m o k i n e s c a v e n g i n g [J ].B l o o d ,2008,112(3):493-503.[14]G r a h a mG J ,M c K i m m i e C S .C h e m o k i n e s c a v e n g i n g b y D 6:am o v a -b l e f e a s t ?[J ].T r e n d s I m m u n o l ,2006,27(8):381-386.[15]M a r t i n e z d e l a T o r r e Y ,L o c a t i M ,B u r a c c h i C ,e t a l .I n c r e a s e di n -f l a m m a t i o ni nm i c ed e f i c i e n t f o rt h ec h e m o k i n ed e c o yr e c e p t o r D 6[J ].E u r J I m m u n o l ,2005,35(5):1342-1346.[16]J a m i e s o nT ,C o o k D N ,N i b b s R J ,e t a l .T h e c h e m o k i n e r e c e p t o r D 6l i m i t s t h e i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e i nv i v o [J ].N a t I m m u n o l ,2005,6(4):403-411.[17]Wh i t e h e a d G S ,Wa n g T ,D e G r a f f L M ,e t a l .T h e c h e m o k i n e r e c e p t o rD 6h a s o p p o s i n g e f f e c t s o na l l e r g i c i n f l a m m a t i o na n d a i r w a y r e a c t i v i t y [J ].A mJ R e s p i r C r i t C a r e M e d ,2007,175(3):243-249.[18]L i uL ,G r a h a mG J ,D a m o d a r a nA ,e t a l .C u t t i n ge d g e :T h es i l e n tc h e m o k i n e r e c e p t o r D 6i s r e q u i r ed f o r ge n e r a t i n g Tc e l l r e s p o n s e s t h a t m e d i a t e e x p e r i m e n t a l a u t o i m m u n e e n c e p h a l o m y e l i t i s [J ].J I m m u n o l ,2006,177(1):17-21.[19]D 'A m i c oG ,F r a s c a r o l i G ,B i a n c h i G ,e t a l .U n c o u p l i n go f i n f l a m -m a t o r y c h e m o k i n e r e c e p t o r s b y I L -10:g e n e r a t i o n o f f u n c t i o n a l d e c o y s [J ].N a t I m m u n o l ,2000,1(5):387-391.[20]A r i e l A ,F r e d m a nG ,S u nY P ,e t a l .A p o p t o t i cn e u t r o p h i l sa n dTc e l l ss e q u e s t e r c h e m o k i n e sd u r i n g i m m u ne r e s p o n s e r e s o l u t i o n t h r o u g h m o d u l a t i o nof C C R 5e x p r e s s i o n [J ].N a t I m m u n o l ,2006,7(11):1209-1216.文章编号:1007-8738(2010)04-0404-03噬菌体抗体库技术及其应用吴懿娜,杜欣军,张伟伟,董　峰,王　硕＊(天津科技大学食品工程与生物技术学院食品营养与安全省部共建教育部重点实验室,天津300457)收稿日期:2009-11-23;　接受日期:2010-01-05基金项目:国家高技术研究发展计划(863)资助项目(2006A A 10Z 448);国家自然科学基金资助项目(20905058)作者简介:吴懿娜(1985-),女,天津人,硕士E -m a i l :y n w u 517@y a h o o .c o m .c n[关键词]噬菌体展示;抗体库;小分子物质[中图分类号]Q 789 [文献标识码]A 目前,抗体在在临床医学研究和食品环境安全检测等方面应用广泛,随着分子生物学的不断发展,利用基因工程手段获得基因工程抗体的方法成为抗体技术研究的热点,自从S m i t h 于1985年第一次成功地将E c o R Ⅰ核酸内切酶基因插入丝状噬菌体基因p Ⅲ中,并在噬菌体表面表达出了融合的蛋白,及1990年M c C a f f e r t y 等又在此基础上构建了库容为106的抗体库,并从中成功地筛选出了溶菌酶单链抗体后,噬菌体抗体库技术成为了抗体工程中的一种新兴的抗体制备的手段。

噬菌体抗体库原理

噬菌体抗体库原理：
该技术以噬菌体为载体,将抗体基因与噬菌体编码的外壳蛋白III或外壳蛋白VIII 相连,在噬菌体表面以抗体外壳蛋白融合蛋白的形式表达;经辅助病毒感染后,借助CPIII的信号肽穿膜作用,进入宿主细胞的外周基质,在正确折叠后被包装于噬菌体尾部,随后携带有表达载体的宿主菌就会释放出带有抗体片段噬菌体颗粒,可以特异识别抗原,又能感染宿主进行在扩增.因此可以采用类似于亲和色谱原理从噬菌体抗体库中筛选出特异性抗体。