高中生物选修三基因工程

基础理论 技术发明
1）目的基因的获取 2）基因表达载体的构建 3）将目的基因导入受体细胞 4）目的基因的检测和鉴定
基础理论和技术的发展催生了基因工程
• DNA是遗传物质的证明 • DNA双螺旋结构和中心法则的确立 • 遗传密码的破译 • 基因转移载体的发现 • 工具酶的发现 • DNA合成和测序技术的发明 • DNA体外重组的实现 • 重组DNA表达实验的成功 • 第一例转基因动物问世 • PCR技术的发明
因的遗传； （3）具有某些标记基因，以便进行重组DNA的筛选。
（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因 等 ）； （4）对受体细胞无害； （5） 大小合适，以便提取和体外操作。
常用的运载体有：
质粒，λ噬菌体的衍生物，动植物病毒等
质粒是基因工程最 常用的运载体，它广泛 地存在于细菌中，是细 菌拟核DNA外能够自主 复制的很小的环状DNA 分子，大小只有普通细 菌拟核DNA的百分之一。
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片 断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了 它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白 质
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片 断，能终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有 目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来
限制酶在原核生物中的作用
2、作用部位：磷酸二酯键
（三） 运载体---“分子运输车”
1、运载体的作用： （1）将目的基因转移到受体细胞中去； （2）使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传； （3）使目的基因能够表达和发挥作用。
2、运载体必须具备的条件：
（1）具有一个或多个限制酶切点，以便与目的基因连接； （2） 能够在受体细胞中复制并稳定地保存，以便目的基
···G
···TG CG··· ⑧···CTTAA
⑤ G··· ⑥···GC ⑦ GT··· AATTC···
ACGTC··· ···CG CA··· G···
第5章 生态系统及其稳定性
2.2 基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：
1、 目的基因的获取 ； 2、 基因表达载体的构建； 3、 将目的基因导入受体细胞 ； 4、 目的基因的检测与鉴定 。 其中核心是 基因表达载体的构建 。
基因组文库 ---包含一种生物的所有基因 基因文库
部分基因文库---包含一种生物的部分基因
（如cDNA文库）
一、获取目的基因
2、获取方法： （1）从基因文库中获取
基因组文库和cDNA文库的构建和比较
一、获取目的基因
2、获取方法： （1）从基因文库中获取
从构建好的基因文库中获取目的基因：
依据基因的核苷酸序列、基因的功能、 基因在染色体上的位置、基因的转录产物 mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特 性来获取目的基因。
一、获取目的基因
2、获取方法： （2）用PCR技术扩增目的基因
PCR结果： 使目的基因以 指数 形式在短时间内大 量扩增。
一、获取目的基因
2、获取方法： （3）用化学方法人工合成
如果基因比较小， 核苷酸序列 又已知，可以 通过 DNA合成仪 用化学方法直接人工合成
二、基因表达载体的构建
1、目的：
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以
遗传 给下一代； （2）使目的基因能够
表达 和发挥作用
二、基因表达载体的构建
2、过程： 载体
目的基因
同一种限制酶
具有黏性末 端的载体
具有相同黏性末 端的目的基因
DNA连接酶
重组DNA分子 （重组载体）
二、基因表达载体的构建
3、组成：
启动子+目的基因+终止子+标记基因+(复制原点）
酸序列，并使每一条链中特定部位的 两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
3、特点： 特异性----特定序列、特定位点 4、结果： 形成DNA的双链片段
黏性末端 片段的末端的形式
平末端
（二） DNA连接酶---“分子缝合针”
1、种类：两类
E·coli DNA连接酶:连接黏性末端 T4 DNA连接酶 ：连接黏性末端和 平末端
§1-1DNA重组技术的基本工具
一、基因工程的概念
基因工程是指按照 人们的意愿 ，进行严格的 设计，并通过 DNA重组 和 转基因 技术，赋 予生物以新的 遗传特性 ，从而创造出更符合人 们需要的新的 生物类型 和 生物产品 。
基因工程的别名 DNA重组技术
操作环境
生物体外
操作对象
基因
操作水平
DNA分子水平
三、将目的基因导入受体细胞
1、转化的概念 2、转化的方法 此外 植物：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 还有 动物：显微注射技术
微生物：Ca2+处理法 3、转化的受体细胞
植物：常用体细胞 动物：受精卵 微生物：常用大肠杆菌、酵母菌等
四、目的基因的表达和鉴定
1、导入的鉴定：DNA分子杂交技术 2、转录的鉴定：核酸分子杂交技术 3、翻译的鉴定：抗原-抗体杂交技术
④条件：
模板DNA (含有目的基因) 四种脱氧核苷酸 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 一对引物 温度控制
⑤方式：以_指__数__方式扩增，即__2_n_（n为扩增循 环的次数）
⑥结果：
目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑦过程：
a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板 在热作用下，_氢__键__断裂，形成__单__链__D_N_A___
黏性末端
黏性末端 黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带 有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样 的切口叫黏性末端。
平末端：当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时， 切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口 叫平末端。
当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产
。生的是黏性末端。当限制酶从识别序列的中心轴 线处切开时，产生的是平末端
70℃-75℃：在 DNA聚合酶（Taq酶） 作用下进 行延伸。
一、获取目的基因
2、获取方法： （2）用PCR技术扩增目的基因 PCR技术的条件： 模板： 目的基因两条链 原料： 四种游离的脱氧核苷酸 引物：（一小段与目的基因模板链互补的）一对DNA
单链
酶： 热稳定DNA聚合酶（Taq酶） 温度控制： 高温→低温→中温
标记基因的作用鉴 别受体细胞中是否 含目的基因。如将 来可用含青霉素的 培养基鉴别，将含 目的基因的细胞筛 选出来。
有切割位点
能带着插入的目 的基因一起复制
PCR技术—聚合酶链式反应
①概念：
是一项在生物体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术
Hale Waihona Puke Baidu
②原理：
DNA双链复制的基本原理
PCR扩增仪
③前提：
一段已知的目的基因的核苷酸序列
一、获取目的基因
2、获取方法： （2）用PCR技术扩增目的基因
PCR技术：在生物 体外 复制特定 DNA片段 的 核酸合成技术。 PCR技术原理： DNA双链复制 。
一、获取目的基因
2、获取方法： （2）用PCR技术扩增目的基因
过程：
90℃-95℃：目的基因的双链模板在热力作用下， 氢键 断裂，形成单链DNA; 55℃-60℃： 引物 与单链模板相应互补序列结合；
（D ）
A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA
练习
3.有关基因工程的叙述中，错误的是（ D ） A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性
状，培育生物新品种 B、重组DNA的形成在生物体外完成 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、质粒都可作为运载体
练习
①
···CTGCA ②···AC ③GC··· ④···G
• 含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具 备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化 酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶 不能将其切开。
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
苏云金芽孢杆菌
普通棉花(无抗虫基因)
提取
与运载体DNA拼接
抗虫基因
棉花细胞(含抗虫基因)
导入
转基因棉花植株
基因工程操作的四个基本步骤
b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部___双__链___。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的__D_N_A_链___。
重组（基因表达）载体的结构组成 复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因
要对天然质粒进行人工改造
练习
1.以下说法正确的是（C ）
A、所有的限制酶只识别一种特定的核苷酸序 列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有一个 或多个限制酶切点，以便与外源基因连接
D、DNA连接酶使黏性末段的碱基之间形成 氢键
练习
2. 不 属 于 质 粒 被 选 为 基 因 运 载 体 的 理 由 是
• 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是， 生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御 机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细 菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利 用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。 所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源 DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
分子 水平 鉴定
4、个体水平的鉴定：抗虫、抗病等的感染、 接种实验
A
磷
酸
二
T
酯
键
大肠杆菌(EcoRI)的一种限制酶能识别GAATTC序列，
并在G和A之间切开。
限制酶所识别的序列有什么特点? 限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个、8个 碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链 DNA上的碱基是反向对称重复排列的。
基本过程 获取基因—体外重组—导入基因—表达基因
结果
人类需要的新的生物类型和生物产品
二、DNA重组技术的基本工具
限制性核酸内切酶——“分子手术刀” DNA连接酶——“分子缝合针” 载体——“分子运输车”
(一）限制性核酸内切酶（限制酶）---“分子手 术刀”
1、来源：主要是从原核生物中分离纯化而来 2、作用：识别某种双链DNA分子特定的核苷
一、获取目的基因
1、目的基因：在基因操作中使用的外源基因。它 主要是 编码蛋白质 的基因，也可以是一些具有调 控作用的因子。
一、获取目的基因
2、获取方法： （1）从基因文库中获取
基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片 段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别 含有这种生物的不同基因，称为基因文库。