甘蓝型油菜下胚轴一步不定芽再生培养及遗传转化应用_廖志强

自 Kartha 等(1974)首次从甘蓝型油菜的茎切段 诱导出不定芽以来，国内外研究机构已经相继从甘 蓝型油菜的叶片、子叶、下胚轴、茎段、花序轴、根和 薄层细胞等部位获得了再生植株。其中，下胚轴由于 具有分化频率较高、取材方便、不受季节限制和易被 农杆菌感染等优点而成为再生和遗传转化首选的外 植体。经过多年的研究，国内外已有大量关于甘蓝型 油菜下胚轴再生体系的报道，一般来说是先将除去子
主要分为甘蓝型、白菜型和芥菜型三种，目前中国栽 并将其应用于油菜的遗传转化工作中，为缩短油菜
种的油菜品种主要为甘蓝型油菜。随着现代分子生 转化周期及提高油菜转化效率创造条件。 物学技术的发展，利用转基因等生物技术加速油菜育
种及其基因功能的研究具有重要意义(官春云, 2002)。 1 结果与分析
植物遗传转化方法主要有农杆菌介导法、花粉管通 道法、基因枪法、显微注射法、PEG 介导法、激光微刺 穿孔法等方法，其中农杆菌介导法为最普遍使用的 方法。尽管利用根癌农杆菌将外源基因导入甘蓝型 油菜中已有一定报道，但除极少数品种如春油菜品
以下胚轴为外植体的遗传转化，均采用二步培养再
生方法(林呐等, 2012; Liu et al., 2012)。由于二步再生
培养操作较繁琐，且芽再生频率不高(王艳等, 2005; 白延红等, 2008)，使得目前油菜转化工作量较大，转化 效率较低。尤其是二步再生培养芽诱导周期较长，一 般需要 2~3 周时间(王艳等, 2005; 白延红等, 2008)，而 经过农杆菌侵染后的愈伤组织抗性芽的诱导筛选更 是需要长达 3 个月时间(林呐等, 2012)。因此，建立快 速简便的甘蓝型油菜再生技术体系，并在此基础上 建立油菜遗传转化体系，简化转化过程，缩短转化周 期，提高转化效率，显得非常必要。
1 Oil Crops Institute, Hunan Agricultural University, Changsha, 410128; 2 Yichun Institute of Agricultural Science, Yichun, 336000 * Corresponding author, guancy2011@ DOI: 10.13271/j.mpb.013.000793
叶节的下胚轴切成约 1 cm 长数个片段，放入含 6－BA
和 2,4－D 等激素的预培养基中预培养数天诱导产生
愈伤组织，然后再将生成愈伤组织的外植体转入添
加 6－BA 和 NAA 等激素的分化培养基中诱导不定芽
再生的二步培养法(杨晓凤等, 2009; Maheshwari et al.,
2011; 刘国红等, 2012; 杨长友等, 2013)。目前油菜在
分子植物育种，2015 年，第 13 卷，第 4 期，第 793－799 页 Molecular Plant Breeding, 2015, Vol.13, No.4, 793－799
研究报告 Research Report
甘蓝型油菜下胚轴一步不定芽再生培养及遗传转化应用
廖志强 1,2 邬贤梦 1 孙娟 1 官春云 1*
Abstract In this study, we established a one-step shoot regeneration and transformation system using hypocotyls of Brassica napus as explants. We used hypocotyls including part of cotyledonary node from Zhongshuang 11 of Brassica napus L. as explants, and adjusted some elements influencing tissue culture of rapeseed such as hormone combinations of 6－BA and NAA, AgNO3 and seedling age, to establish one-step shoot regeneration system. The content of this system is that hypocotyls including part of cotyledonary node from five day seedlings were cultured in the MS media supplemented with 4 mg/L 6－BA, the shoots from the cultured explants were regenerated after five day culture later with the 100% frequency of shoot regeneration. Based on the above shoot regeneration system, a transformation experiment was carried out and a BnTFL1 RNAi vector constructed from pFGC5941 vector was transformed into Zhongshuang 11 successfully. In the whole transformation procedures, it takes only 5 days for inducing buds, and it spends 30 days to screen resistant buds by using PPT, which shorten 60 days of traditional transformation (90 days). The whole transformation period from seeding to getting rooted resistant seedlings should span about 70 days that saves 60 days compared to traditional transformation period. Therefore, this new transformation method obviously shortened transformation period, simplified transformation process and improved transformation efficiency. Keywords Rapeseed, Hypocotyl, Cotyledonary node, One-step shoot regeneration, Transformation
继续增加 6－BA 的浓度，再生不定芽的数量随之减少。 NAA 对不定芽和不定根的再生均产生影响，当培养 基中不含 NAA 时，下胚轴切口处不产生不定根；当 培养基中添加 NAA 时，下胚轴下方切口处开始再生 出不定根，且随着 NAA 浓度的增加，再生不定根外 植体数量也随之增加。与此同时，在含较高浓度 NAA 的培养基中再生不定芽数量较少，表明较高浓 度 NAA 抑制不定芽的再生。根据表 1 的统计结果， A4-1 培养基平均诱导出 8.0±1.85 个不定芽，数量最 多，且不产生不定根，为最佳培养基。
1 湖南农业大学油料作物研究所, 长沙, 410128; 2 江西省宜春市农业科学研究所, 宜春, 336000 * 通讯作者, guancy2011@
摘 要 本研究建立了以甘蓝型油菜下胚轴为外植体的一步不定芽再生培养和遗传转化体系。首先，以甘 蓝型油菜中双 11 号含部分子叶节的下胚轴为外植体，从 6－BA 和 NAA 配比、AgNO3 以及无菌苗苗龄等方面 对影响油菜组织培养的因素进行了研究，建立了甘蓝型油菜快速高频一步不定芽再生培养技术体系。该技术 体系为，切取 5 d 苗龄含部分子叶节的下胚轴置于添加 4 mg/L 6－BA 的 MS 基本培养基中培养，5 d 再生出不 定芽，再生频率为 100%。在此基础上，进行了甘蓝型油菜的遗传转化，成功地将用 pFGC5941 双元载体构建 的 BnTFL1 基因干扰载体转入中双 11 号中。整个转化过程中，芽的诱导生成只需 5 d，接着完成抗性芽的 PPT 筛选需要 30 d，整个转化周期从播种到得到生根抗性苗仅需大约 70 d，而传统转化方法抗性芽的诱导筛选需 要 90 d，整个转化周期需要 130 d 左右，大大缩短了转化周期，简化了转化过程，提高了转化效率。 关键词 油菜, 下胚轴, 子叶节, 一步再生培养, 遗传转化
植物幼苗的子叶节含大量活性较强的分生组织
图 1 不同浓度 6－BA 和 NAA 诱导不定芽再生 注: 第一行从左至右依次为: A1-1, A1-2, A1-3, A1-4; 第二行从左至 右依次为: A2-1, A2-2, A2-3, A2-4; 第三行从左至右依次为: A3-1, A3-2, A3-3, A3-4; 第四行从左至右依次为: A4-1, A4-2, A4-3, A4-4; 第五行从 左至右依次为: A5-1, A5-2, A5-3, A5-4, A5-5 Figure 1 Shoot regeneration induced with different concentrations of 6－BA and NAA Note: From left to right in the first line is A1-1, A1-2, A1-3, A1-4; In the second line is A2-1, A2-2, A2-3, A2-4; In the third line is A3-1, A3-2, A3-3, A3-4; In the forth line is A4-1, A4-2, A4-3, A4-4; In the fifth line is A5-1, A5-2, A5-3, A5-4, A5-5
One-step Shoot Regeneration Culture Established from Hypocotyl of Brassica napus L. and Applied to Transformation